一种新型核糖核酸酶a及其纯化生产工艺的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种新型核糖核酸酶A，它是以现有的牛胰腺核糖核酸酶A为基础、对其特定几个位点进行突变形成的，其纯化生产工艺为：对基因序列全基因合成后，构建毕赤酵母重组质粒，然后经过种子培养、发酵培养基扩增培养、甘油补料分批培养、甲醇补料诱导表达，再经过蛋白纯化得到目的新型核糖核酸酶A融合蛋白。该方法得到的目的蛋白表达量高，容易纯化，且稳定性高，活性成分作用时间长，保存期长。
【专利说明】-种新型核糖核酸酶A及其纯化生产工艺
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物化学【技术领域】，具体涉及一种新型核糖核酸酶A，以及该新型核糖 核酸酶A的纯化生产工艺。
【背景技术】
[0002] 核糖核酸酶A (RNase A)是内切核糖核酸酶，可特异地攻击RNA上嘧啶残基的3' 端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键。核糖核酸酶A是脊椎动物所特有的蛋白质家族， 除了水解RNA以外，它们还参与细胞成熟、细胞凋亡、血管生成以及宿主防御等过程，在疾 病的诊断和治疗方面表现出重要的应用价值。
[0003] RNase A家族成员具有很高的序列相似性，它们大多含有6-8个半胱氨酸并形成 分子内二硫键，以维持特有的空间结构。RNase A基因结构中不含有内含子，成熟的RNase A的氨基酸序列中均含有非常保守的CKXXNTF氨基酸序列（XX为任意氨基酸）。
[0004] 核糖核酸酶A最早是在牛的胰腺中发现的，牛胰腺核糖核酸酶A包括一个374bp 的开放阅读框，编码124个氨基酸的多肽链（如SEQ ID NO :4所示），预测其等电点为8. 30， 分子量为14kD。
[0005] 牛胰腺核糖核酸酶A是第一个被应用于动物肿瘤和白血病临床治疗的RNase A， 并取得一定的效果。目前所用的RNase A多从牛胰腺中提取，虽然原料来源丰富，但纯化的 技术要求较高，而且有DNA酶和病毒（如牛海绵状脑病病毒）污染危险，因此，WHO和FDA等 国际权威机构明确规定动物源性的牛核糖核酸酶A不能用于制备人和动物基因治疗或基 因免疫用途的重组质粒。
[0006] 张泉等发表的论文"牛胰腺核糖核酸酶A的基因克隆、表达及初步鉴定"中提出利 用RT-PCR从牛胰腺总RNA中扩增出大小和序列正确的RNase A cDNA，并在大肠杆菌中获得 分泌性表达重组酶，为生物制品级核算疫苗或基因治疗用途质粒DNA的制备提供了借鉴。 但是，使用该方法诱导表达的重组核糖核酸酶A蛋白表达量不高，且纯化困难。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种新型核糖核酸酶A，以及该新型核糖核酸 酶A的纯化生产工艺。
[0008] 本发明所采用的技术方案为：
[0009] -种新型核糖核酸酶A，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0010] 编码上述新型核糖核酸酶A的基因，其碱基序列如SEQ ID NO : 2所示。
[0011] 上述新型核糖核酸酶A的纯化生产工艺，它包括以下步骤：
[0012] Sl :对SEQ ID NO :2所示的基因序列进行全基因合成，得到新型核糖核酸酶A基 因；
[0013] S2 :将新型核糖核酸酶A基因连接到PPIC9K载体上，构建PPIC9K重组质粒；
[0014] S3 :将PPIC9K重组质粒线性化，然后电转化到毕赤酵母GSl 15中；
[0015] S4 :筛选重组子，获得毕赤酵母重组质粒；
[0016] S5 :将毕赤酵母重组质粒接种到YH)液体培养基，30°C、280rpm震荡培养12-24h， 获得一级种子液；
[0017] S6 :将一级种子液按10%的体积比接种到Yro液体培养基，30°C、220rpm震荡 16-24h，获得二级种子液；
[0018] S7 :将二级种子液按5%的体积比接种到含发酵培养基的发酵罐，设定搅拌转速 为300rmp、通气量为30%、温度30°C，开始发酵培养，通过调节搅拌速度、通气量、罐压使DO 维持在20%?35%，当DO陡然上升至95-100%时，说明培养基中甘油已经消耗殆尽，立即 进入下一步骤；
[0019] S8 :以12ml/h/L的速率流加50%甘油（甘油与去离子水按体积比I : 1配比而 成）到发酵罐中，维持4h，同时提高搅拌速度、通气量、罐压使DO维持在20 %?35%，停止 补加甘油后，观察DO值上升至100%后，继续维持"甘油饥饿"状态Ih ;
[0020] S9 :以lml/h/L的低速流加甲醇（100%甲醇）4h，以使工程菌适应以甲醇为唯一碳 源的环境，再以每半小时增加10%的流速增到3ml/h/L至诱导结束，通过调节搅拌速度、通 气量、罐压和甲醇流加速率使DO值维持在20 %?35 %，每4h取样一次，测定发酵液中酵母 菌体细胞光密度OD6c?，当0D_为400时结束诱导；
[0021] SlO :纯化目的新型核糖核酸酶A，得到目的新型核糖核酸酶A融合蛋白。
[0022] 所述步骤S7中发酵培养基的配方为：在无机盐培养基中添加4. SSmVLPTM1微量 元素溶液，初始PH5. 0。所述无机盐培养基的配方为：磷酸26. 7mL、CaS040. 93g、K2S0418. 2g、 MgS04 ·7Η2014· 9g、K0H4. 13g、甘油 40. 0g(31. 67mL)、ΡΤΜΙ4· 35ml，氨水调节 pH 至 4· 5,溶剂 为去离子水，配制量为1升。
[0023] 所述 PTM1 微量元素溶液的配方为=CuSO4 · 5H206. 0ml/L、ΚΙ0. 08ml/L、 MnSO4 · Η203· 0ml/L、Na2MoO4 · 2Η200· 2ml/L、H3BO3O. 02ml/L、CoCl2O. 5ml/L、ZnCl220. 0ml/L、 FeSO4 · 7H2065. 0ml/L、BiotinO. 2ml/L、H2S045. 0ml/L，溶剂为去离子水，混匀过滤除菌。
[0024] 所述步骤SlO中纯化目的新型核糖核酸酶A融合蛋白具体包括以下步骤：
[0025] Sl :将诱导后的菌液用管式离心机离心，收集上清液；
[0026] S2 :用陶瓷膜进行过滤处理，去除菌体等碎片；
[0027] S3 :将上清液上清超虑浓缩，同时除盐并交换成20mMTris-HCL缓冲液，将上清液 浓缩十倍；
[0028] S4 :60°C加热浓缩液，去除热不稳定杂蛋白，离心收集浓缩上清液；
[0029] S5 :采用亲和层析柱进行纯化，纯化过程如下：
[0030] 1)平衡柱子：先用分子级的水将柱子里的乙醇冲洗干净，然后用3-4倍柱体积的 平衡缓冲液平衡柱子，
[0031] 2)上样：将浓缩上清液用平衡缓冲液稀释5倍后上样，结束后继续用平衡缓冲液 冲洗色谱柱，
[0032] 3)洗脱：用洗脱缓冲液将目标蛋白从色谱柱上洗脱下来，收集样品，
[0033] 4)将搜集到的样品透析，然后进行冷冻干燥，得到目的新型核糖核酸酶A融合蛋 白。
[0034] 所述亲和层析柱的填料为镍亲和层析填料。所述平衡缓冲液的配方为： 20mMTris-HCl，0. 5M NaCl，5mM 咪唑，pH7. 8 ;所述洗脱液缓冲液的配方为：20mMTris-HCl， 0.5M NaCl，300mM 咪唑，ρΗ7·8。
[0035] 与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：
[0036] (1)本发明提供一种新型核糖核酸酶Α，该新型核糖核酸酶A是以现有的牛胰腺核 糖核酸酶A为基础、对其特定几个位点进行突变形成的，该新型核糖核酸酶A经过实验验 证，其稳定性，无论在高温环境下，还是在低温环境下，比现有的牛胰腺核糖核酸酶A都要 高，这不仅有效延长了其活性成分作用时间，直接延长了其作用时效，而且也使保存时间更 为长久。
[0037] (2)本发明针对基因阶段，提供一种合适、有效、成功的带有编码新型核糖核酸酶 A基因的重组质粒的构建方法，针对蛋白质阶段，提供一个分阶段不同培养基、特定添加物、 特殊处理方法形成的菌体扩增和诱导表达目的蛋白方法，两种方法合理组合，很好地完成 了新型核糖核酸酶A的基因克隆和表达，使得诱导表达得到的新型核糖核酸酶A表达量高， 且容易纯化。
【专利附图】
【附图说明】
[0038] 图1所示的是本发明实施例3中得到的纯化后目的新型核糖核酸酶A蛋白的检测 图，其中M3 :蛋白质分子量标记；1 :浓缩上清液；3 :洗脱收集液；
[0039] 图2所示的是本发明突变前后牛胰腺核糖核酸酶A的诱导表达产量比较；
[0040] 图3所示的是本发明突变前后牛胰腺核糖核酸酶A在60度条件下的活性比较；
[0041] 图4所示的是本发明突变前后牛胰腺核糖核酸酶A在冷冻条件下的活性比较。
【具体实施方式】
[0042] 以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示 性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语 具有与本发明所属【技术领域】人员通常理解的相同含义。
[0043] 实施例1 :含有新型核糖核酸酶A基因的重组质粒的构建
[0044] 本实施例对SEQ ID NO :2所不的基因序列进彳丁重组质粒的构建。该基因编码的氣 基酸序列如SEQ ID NO :1所示，我们将其称之为新型核糖核酸酶A。新型核糖核酸酶A与 现有的牛胰腺核糖核酸酶A氨基酸序列（SEQ ID NO :4所示，其碱基序列如SEQ ID NO :3所 示）相比，其突变位点为第38位、第88位、第109位、第120位，分别由D突变为R、由G突 变为D、由A突变为R、由F突变为G。新型核糖核酸酶A由124个氨基酸残疾组成，属碱性 蛋白质，其具有核糖核酸酶A家族的典型结构，如由8个半胱氨酸形成的四个分子内二硫键 和CKXXNTF特征结构，属于核糖核酸酶A家族。
[0045] 含有新型核糖核酸酶A基因的重组质粒的构建，包括以下步骤：
[0046] Sl :对SEQ ID NO :2所示的基因序列进行全基因合成（由华大基因合成），得到新 型核糖核酸酶A基因。
[0047] S2 :将新型核糖核酸酶A基因连接到PPIC9K载体（购自invitrogen)上，构建 PPIC9K重组质粒。
[0048] S3 :将重组质粒从大肠杆菌中提取出来，将PPIC9K重组质粒线性化，然后电转化 到毕赤酵母GS115(购自invitrogen)中。
[0049] 质粒DNA线性化（5 X 0· 5mLEP管中酶切体系）：
【权利要求】
1. 一种新型核糖核酸酶A，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. -种编码如权利要求1所述的新型核糖核酸酶A的基因，其特征在于：其碱基序列 如 SEQ ID NO : 2 所示。
3. 权利要求1所述的新型核糖核酸酶A的纯化生产工艺，其特征在于包括以下步骤： 51 :对SEQ ID NO :2所示的基因序列进行全基因合成，得到新型核糖核酸酶A基因； 52 :将新型核糖核酸酶A基因连接到PPIC9K载体上，构建PPIC9K重组质粒； 53 :将PPIC9K重组质粒线性化，然后电转化到毕赤酵母GS115中； 54 :筛选重组子，获得毕赤酵母重组质粒； 55 :将毕赤酵母重组质粒接种到YH)液体培养基，30°C、280rpm震荡培养12-24h，获得 一级种子液； 56 :将一级种子液按10%的体积比接种到YH)液体培养基，30°C、220rpm震荡培养 16-24h，获得二级种子液； S7:将二级种子液按5%的体积比接种到含发酵培养基的发酵罐，设定搅拌转速为 300rmp、通气量为30%、温度30°C，开始发酵培养，使DO维持在20%?35%，当DO陡然上 升至95-100%时，立即进入下一步骤； 38:以121111/11/1的速率流加50%甘油到发酵罐中，维持411，同时使00维持在20%? 35%，停止补加甘油后，观察DO值上升至100%后，继续维持"甘油饥饿"状态Ih ; S9 :以lml/h/L的低速流加甲醇4h，再以每半小时增加10%的流速增到3ml/h/L至诱 导结束，使DO值维持在20%?35%，同时实时测定发酵液中酵母菌体细胞光密度OD6c?，当 0D_为400时结束诱导； SlO :纯化诱导得到的目的新型核糖核酸酶A融合蛋白。
4. 根据权利要求3所述的新型核糖核酸酶A的纯化生产工艺，其特征在于：所述步 骤S7中发酵培养基的配方为：在无机盐培养基中添加4. SSmVLPTM1微量元素溶液，初始 ρΗ5· 0。
5. 根据权利要求4所述的新型核糖核酸酶A的纯化生产工艺，其特征在于：所述无机 盐培养基的配方为：磷酸 26. 7mL、CaS040. 93g、K2S0418. 2g、MgS04 · 7Η2014. 9g、Κ0Η4. 13g、 甘油40. 0g、PTMI4. 35ml，氨水调节pH至4. 5,溶剂为去离子水，配制量为I升。
6. 根据权利要求4所述的新型核糖核酸酶A的纯化生产工艺，其特征在于：所述 PTM1 微量元素溶液的配方为：CuS04 · 5Η206· 0ml/L、ΚΠλ 08ml/L、MnSO4 · Η203· 0ml/L、 Na2MoO4 · 2Η200· 2ml/L、H3BO3O. 02ml/L、CoCl2O. 5ml/L、ZnCl220. 0ml/L、FeSO4 · 7Η2065· Oml/ L、BiotinO. 2ml/L、H2S045. 0ml/L，溶剂为去离子水，混勻后过滤除菌。
7. 根据权利要求3所述的新型核糖核酸酶A的纯化生产工艺，其特征在于：所述步骤 SlO中纯化目的新型核糖核酸酶A融合蛋白具体包括以下步骤： 51 :将诱导后的菌液用管式离心机离心，收集上清液； 52 :用陶瓷膜进行过滤处理，去除菌体等碎片； 53 :将上清液超滤浓缩，同时除盐并交换成20mMTris-HCL缓冲液，将上清液浓缩十倍； 54 :60°C加热浓缩液，去除热不稳定杂蛋白，离心收集浓缩上清液； 55 :采用亲和层析柱进行纯化，纯化过程如下： 1)平衡柱子：先用分子级的水将柱子里的乙醇冲洗干净，然后用3-4倍柱体积的平衡 缓冲液平衡柱子， 2) 上样：将浓缩上清液用平衡缓冲液稀释5倍后上样，结束后继续用平衡缓冲液冲洗 色谱柱， 3) 洗脱：用洗脱缓冲液将目标蛋白从色谱柱上洗脱下来，收集样品， 4) 将搜集到的样品透析，然后进行冷冻干燥，得到目的新型核糖核酸酶A融合蛋白。
8. 根据权利要求7所述的新型核糖核酸酶A的纯化生产工艺，其特征在于：所述亲和 层析柱的填料为镍亲和层析填料。
9. 根据权利要求7所述的新型核糖核酸酶A的纯化生产工艺，其特征在于：所述平衡 缓冲液的配方为：20mMTris-HCl，0. 5MNaCl，5mM 咪唑，ρΗ7· 8。
10. 根据权利要求7所述的新型核糖核酸酶A的纯化生产工艺，其特征在于：所述洗脱 液缓冲液的配方为：20mMTris-HCl，0. 5MNaCl，300mM 咪唑，ρΗ7· 8。
【文档编号】C12N15/55GK104212779SQ201410437404
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年8月29日 优先权日:2014年8月29日
【发明者】刘艳杰, 陈铭璐, 董颖红 申请人:宁波美成生物科技有限公司