核糖核酸酶保护实验试剂盒的制作方法

专利名称：核糖核酸酶保护实验试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因检测所使用的试剂，尤其涉及信使核糖核酸(mRNA)分析所使用试剂盒。
背景技术：
一个基因的表达，需要经过转录(mRNA生成)、翻译(蛋白质合成)、修饰等过程，最后形成具有生物学活性的蛋白质分子。mRNA检测是研究基因表达和功能最重要、最常用的方法。目前常用的mRNA检测方法包括Northern blot、RT-PCR和核糖核酸酶保护实验(Ribonuclease protection assay，RPA)。
Northern blot方法是mRNA检测的经典方法之一，可以半定量的分析mRNA的水平，但该方法操作复杂，需要的时间长，对标本的完整性要求高，需要的样品量大，且不能同时检测多个靶基因；定量RT-PCR是目前几种常用方法中最为灵敏的一种，比NorthernBlot灵敏1000倍以上，对标本的完整性要求也相对比较低，但是由于PCR扩增的非线型性和碱基错配等缺限，难以获得十分准确的定量结果。
核糖核酸酶保护实验(Ribonuclease Protection Assay，RPA)是近几年发展起来的一种全新的mRNA定量分析技术，与Northern blot、RT-PCR等mRNA检测方法比较，RPA具有明显的优势。它可以同时检测多种基因的表达，且灵敏度高，为Northern Blot的10-50倍；因为不需要基因的体外扩增，其定量结果比RT-PCR更加准确可靠。因此，RPA已成为目前mRNA定量分析的首选方法，在国外广泛应用于生命科学与医学研究领域。但是使用现有的试剂盒进行实验需较长的杂交时间，且在消化未杂交单链RNA的实验过程中，没有被消化的保护片断的沉淀不够充分，增加了观察的难度。
此外该方法在国内使用的报道极少，其重要原因之一就是目前国内还没有方便经济的试剂盒提供，而进口试剂价格昂贵。另一方面，现有的试剂盒大都仅适于采用放射性同位素标记探针，对环境和科研人员的健康都有一定的影响，对实验场地及其防护都有较高的要求，因而也限制了该技术在国内的推广。

发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种杂交速率高且能充分沉淀未被消化的RNA保护片断的核糖核酸酶保护实验试剂盒，该试剂盒成本低且适用于采用非放射性的生物素标记探针。
本发明采用如下技术方案设计一种核糖核酸酶保护实验试剂盒，包括盒体和放置于盒体内的多个试剂容器，所述多个试剂容器分别穿过连接件上的定位孔被固定在盒体内，盒体外表面印刷有与所述核糖核酸酶保护实验有关的提示性信息；其特征在于，所述盒体内包括杂交缓冲液容器、RNA酶消化缓冲液容器、探针稀释缓冲液容器和上样缓冲液容器；所述杂交缓冲液为下述成份的混合液40mmol/L PIPES(pH 6.8)、1mmol/L EDTA(pH 8.0)、0.4mol/L NaCl、1mmol/L CTAB以及体积比为80％的去离子甲酰胺；本发明的主要改进之一是在杂交缓冲液中加入了1mmol/L的CTAB，CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，具有提高DNA及RNA互补链复性速率的性质。当CTAB的浓度为1mmol/L时，复性速率比在水中快10000倍，比在1mol/L的NaCl溶液中快约2000倍，大大提高了杂交速率，缩短了杂交时间。CATB存在条件下对复性反应的影响仅次于核酸的浓度，CTAB还可以稳定已经形成的双链结构。
所述RNA酶消化缓冲液为下述成份的混合液0.3mol/L NaCl、5mmol/L EDTA、10mmol/LTris-HCl(pH 7.4)和50mg/L糖原。本发明的主要改进之二是在核酸酶消化缓冲液中加入了糖原，糖原有富集核酸的作用，如此没有被消化的保护片断就能更加完全的沉淀下来，增大沉淀块的体积，更有助于肉眼的观察，方便实验操作。
所述探针稀释缓冲液为下述成份的混合液0.5mol/L乙酸胺、1mmol/L EDTA和0.2％质量体积比的SDS。
所述上样缓冲液为下述成份的混合液95％体积比的二甲基甲酰胺、0.025％质量体积比的二甲苯青、0.025％质量体积比的溴酚兰、18mmol/L EDTA以及0.025％质量体积比的SDS。
本发明的试剂盒中，所述杂交缓冲液的体积为3ml，所述RNA酶消化缓冲液的体积为30ml，所述探针稀释缓冲液的体积为10ml，所述上样缓冲液的体积为1.4ml，其中所述杂交缓冲液、RNA酶消化缓冲液和上样缓冲液以一倍体积的工作液即可直接使用。
为了方便实验的操作，减小制备各种试剂所需的时间，所述试剂盒的盒体内还集成有如下组分及其体积的试剂容器小鼠肝脏RNA 100μl(0.5mg/ml，溶解在0.1mM EDTA)、5mg/ml的酵母RNA 500μl、10％质量体积比的SDS 1ml、0.5mg/ml的小鼠β-actin模板10μl、RNA酶A/T1混合液300μl、5M的醋酸胺10ml和10mg/ml的蛋白酶K250μl。
所述用于固定试剂容器的连接件为一具有支撑脚且与所述盒体内腔匹配的水平架板，该水平架板具有相隔一定距离的试剂容器定位孔，在每一试剂容器定位孔的边缘标示容器内试剂的名称。
所述定位孔共有13个，分三行排列，其中四个角位上的四个定位孔的直径较大；所述RNA酶消化缓冲液分装于两个容器内，该两容器分别置于左上方和右上方的两个大定位孔内；所述探针稀释缓冲液容器置于左下角的大定位孔内；所述醋酸胺容器置于右下角的大定位孔内；所述杂交缓冲液试剂分装于两个容器内，该两容器分别置于连接件中部的两个小定位孔内。
同现有技术相比较，本发明的核糖核酸酶保护实验试剂盒在杂交缓冲液中加入了十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，使杂交速率加快了，杂交效率提高了，大大缩短了杂交时间；在核酸酶消化缓冲液中加入了糖原，使没有被消化的保护片断更加完全的沉淀下来，增大沉淀块的体积，更有助于肉眼的观察，方便实验操作。本发明的试剂盒采用自行研制的试剂，完全能够达到美国Ambion公司RPAIII的质量标准，但价格仅为该产品的三分之一，目前国内尚未发现同类产品；本试剂盒同时也适用于采用非放射性的生物素标记探针，避免了放射性同位素标记方法的不利因素，有利于该技术在国内的推广应用。


图1为本发明核糖核酸酶保护实验试剂盒的内部结构示意图；图2为所述核糖核酸酶保护实验的流程图。
具体实施例方式
以下结合附图所示之最佳实施例作进一步详述。
如图1所示，本发明的核糖核酸酶保护实验试剂盒，包括盒体1和放置于盒体1内的多个试剂容器，所述多个试剂容器分别穿过连接件2上的定位孔21被固定在盒体1内，盒体1外表面印刷有与所述核糖核酸酶保护实验有关的提示性信息。所述用于固定试剂容器的连接件2为一具有支撑脚且与所述盒体内腔匹配的水平架板。所述定位孔21相隔一定距离布置在该水平架板2上，共有13个，分三行排列，其中四个角位上的四个定位孔的直径较大，在每一试剂容器定位孔21的边缘标示容器内试剂的名称。
盒体1内共放置有11种试剂，各试剂的名称及其浓度或规格、体积及贮藏温度如下表

其中，所述RNA酶消化缓冲液分装于两个容器内，该两容器分别置于连接件2的左上方和右上方两个大定位孔内；所述探针稀释缓冲液容器置于左下角的大定位孔内；所述醋酸胺(Ammonium Acetate)容器置于右下角的大定位孔内；所述杂交缓冲液试剂也分装于两个容器内，该两容器分别置于连接件2中部的两个小定位孔21内。
所述杂交缓冲液为下述成份的混合液40mmol/L PIPES(哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸))(pH 6.8)、1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)(pH 8.0)、0.4mol/L NaCl(氯化钠)、1mmol/LCTAB(十六烷基三甲基溴化铵)以及体积比为80％的去离子甲酰胺。其中CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性。在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里。在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此CTAB可以用于从大量产生黏多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌(包括大肠杆菌的某些珠)中制备纯化核酸。
CTAB同时具有提高DNA及RNA互补链复性速率的性质。当CTAB的浓度为1mmol/L时，复性速率比在水中快10000倍，这一速率比在1mol/L的氯化钠溶液中快约2000倍。CATB存在条件下对复性反应的影响仅次于核酸的浓度，CTAB还可以稳定已经形成的双链结构。
所述RNA酶消化缓冲液为下述成份的混合液0.3mol/L NaCl、5mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)、10mmol/L Tris-HCL(盐酸缓冲的三羟甲基氨基甲烷)(pH 7.4)以及50mg/L糖原(Glycogen)。糖原有富集核酸的作用，如此没有被消化的保护片断就能更加完全的沉淀下来，增大沉淀块的体积，更有助于肉眼的观察，方便实验操作。
所述探针稀释缓冲液为下述成份的混合液0.5mol/L乙酸胺(ammonium acetate)、1mmol/L EDTA和0.2％质量体积比的SDS(十二烷基硫酸钠)。
所述上样缓冲液为下述成份的混合液95％体积比的二甲基甲酰胺(Formamide)、0.025％质量体积比的二甲苯青(xylene cyanol)、0.025％质量体积比的澳酚兰(bromophenolblue)、18mmol/L EDTA以及0.025％质量体积比的SDS。
如图2所示，所述核糖核酸酶保护实验的工作原理是将标记的特异RNA探针(32P或生物素)与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合，形成双链RNA；未结合的单链RNA经RNaseA或RNase T1消化形成寡核糖核酸，而待测目的基因与特异RNA探针结合后形成双链RNA，免受RNA酶的消化，故该方法命名为RNA酶保护实验。对于32P标记的探针，杂交双链进行变性聚丙酰胺凝胶电泳，用放射自显影或磷屏成像系统检测被保护探针的信号；对于生物素标记的探针，杂交双链经过变性聚丙酰胺凝胶电泳后电转移至尼龙膜，采用链霉亲和素-辣根过氧化物酶(Streptavidin-HRP)和化学发光底物与膜上生物素标记的探针结合，X射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号。本发明的试剂盒是应用于上述变性聚丙酰胺凝胶电泳及之前的步骤中。
所述核糖核酸酶保护实验的过程如下1.样品RNA与标记探针杂交(1)将样品RNA与探针混合于1.5ml的离心管中，每10μg总RNA或0.6μg poly(A)RNA加入150～600pg或2-8×104cpm的探针，每一反应中样品RNA的量为5～30μg，一般不超过100μg；(2)另取2个离心管，加入与样品RNA等量的酵母RNA和标记探针，分别命名为质控管I和质控管II；(3)每管加入1/10体积的5M醋酸胺和2.5倍体积的无水乙醇，混匀后于-20℃放置至少15分钟；
(4)12,000×g，4℃离心至少15分钟；(5)弃上清，空气干燥3～5分钟；(6)每管加入30μl杂交液缓冲液溶解沉淀；(7)90～95℃变性3～4分钟，42～45℃杂交过夜。
2.未杂交单链RNA的消化(1)将RNA酶消化缓冲液和RNaseA/RNaseT1按一定比例混合稀释(推荐使用1∶400的稀释倍数)，混匀后加入到杂交过夜的样品管中，每管300μl；(2)质控管I加入300μl不含RNA酶的消化缓冲液，该管可检测探针完整性(如果探针未发生降解，则可检测到相应大小的条带)，质控管II加入含RNA酶的消化缓冲液，该管为阴性对照，电泳后，检测不到杂交信号；(3)37℃孵育30分钟，消化未被保护的单链RNA片段；(4)加入10％SDS 10μl和10mg/ml蛋白酶K2.5μl，37℃孵育15分钟，以灭活RNA酶；(5)加入1/10体积的5M醋酸胺，2.5倍体积的无水乙醇和的酵母RNA1～2μl，-20℃放置至少15分钟；(6)12,000×g，4℃离心至少15分钟；(7)弃上清，空气干燥3-5分钟后加入5～10μl加样缓冲液溶解沉淀；(8)90-95℃变性3～5分钟。
3.被保护RNA片段的检测(1)制备5％丙烯酰胺/8M尿素变性凝胶(注梳子拔除后，应立即冲洗上样孔，以清除孔内残留凝胶和尿素，否则容易堵塞上样孔)，5％的变性聚丙烯酰胺凝胶能够有效分离50～1000个核苷酸的RNA；(2)将样品上样于已制备好的变性凝胶加样孔中，加样的一般顺序为RNA分子量标准、质控管I(只需上样样品总量的10～20％，如上样量过多，则信号太强，因而影响邻近泳道信号的检测)、质控管II和待测样品，以13～20V/cm的电压电泳，当溴酚蓝染料带达到凝胶底端时停止电泳；(3)放射性同位素标记探针的检测将电泳后的丙烯酰胺凝胶转移到滤纸上，朔料薄膜包裹后X-线胶片曝光(推荐使用真空干胶仪，干胶曝光的条带更清晰，且增加信号检测的灵敏度)；(4)非放射性标记探针的检测将丙烯酰胺凝胶上的RNA电转到尼龙膜，交连固定、封阻、酶连和洗膜，化学发光法检测杂交信号。
所述10×TBE的配方表如下

所述5％丙烯酰胺/8M尿素凝胶的配方表如下

其配制方法为在室温下将上表中的各成分搅拌至尿素全部溶解后，加入10％过硫酸胺120μl和TEMED 12μl快速混匀后，立即灌胶。
权利要求
1.一种核糖核酸酶保护实验试剂盒，包括盒体(1)和放置于盒体(1)内的多个试剂容器，所述多个试剂容器分别穿过连接件(2)上的定位孔(21)被固定在盒体内，盒体(1)外表面印刷有与所述核糖核酸酶保护实验有关的提示性信息；其特征在于，所述盒体(1)内包括杂交缓冲液容器、RNA酶消化缓冲液容器、探针稀释缓冲液容器和上样缓冲液容器；所述杂交缓冲液为下述成份的混合液40mmol/L PIPES(pH 6.8)、1mmol/LEDTA(pH 8.0)、0.4mol/L NaCl、1mmol/L CTAB以及体积比为80％的去离子甲酰胺；所述RNA酶消化缓冲液为下述成份的混合液0.3mol/L NaCl、5mmol/LEDTA、10mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)和50mg/L糖原。
2.根据权利要求1所述的核糖核酸酶保护实验试剂盒，其特征在于所述探针稀释缓冲液为下述成份的混合液0.5mol/L乙酸胺、1mmol/L EDTA和0.2％质量体积比的SDS。
3.根据权利要求1所述的核糖核酸酶保护实验试剂盒，其特征在于所述上样缓冲液为下述成份的混合液95％体积比的二甲基甲酰胺、0.025％质量体积比的二甲苯青、0.025％质量体积比的溴酚兰、18mmol/L EDTA以及0.025％质量体积比的SDS。
4.根据权利要求1至3任一项所述的核糖核酸酶保护实验试剂盒，其特征在于该试剂盒中所述杂交缓冲液的体积为3ml，所述RNA酶消化缓冲液的体积为30ml，所述探针稀释缓冲液的体积为10ml，所述上样缓冲液的体积为1.4ml，其中所述杂交缓冲液、RNA酶消化缓冲液和上样缓冲液以一倍体积的工作液即可直接使用。
5.根据权利要求4所述的核糖核酸酶保护实验试剂盒，其特征在于所述试剂盒的盒体(1)内还包括分别装有如下组分及其体积的试剂容器小鼠肝脏RNA 100μl(0.5mg/ml，溶解在0.1mM EDTA)、5mg/ml的酵母RNA 500μl、10％质量体积比的SDS 1ml、0.5mg/ml的小鼠β-actin模板10μl、RNA酶A/T1混合液300μl、5M的醋酸胺10ml和10mg/ml的蛋白酶K 250μl。
6.根据权利要求5所述的核糖核酸酶保护实验试剂盒，其特征在于所述用于固定试剂容器的连接件(2)为一具有支撑脚且与所述盒体(1)内腔匹配的水平架板，该水平架板具有相隔一定距离的试剂容器定位孔(21)，在每一试剂容器定位孔(21)的边缘标示容器内试剂的名称。
7.根据权利要求6所述的核糖核酸酶保护实验试剂盒，其特征在于所述定位孔(21)共有13个，分三行排列，其中四个角位上的四个定位孔的直径较大；所述RNA酶消化缓冲液分装于两个容器内，该两容器分别置于左上方和右上方的两个大定位孔内；所述探针稀释缓冲液容器置于左下角的大定位孔内；所述醋酸胺容器置于右下角的大定位孔内；所述杂交缓冲液试剂分装于两个容器内，该两容器分别置于连接件(2)中部的两个小定位孔(21)内。
全文摘要
一种核糖核酸酶保护实验试剂盒，包括盒体(1)和放置于盒体(1)内的多个试剂容器，该多个试剂容器分别穿过连接件(2)上的定位孔(21)被固定在盒体(1)内；盒体内包括杂交缓冲液容器、RNA酶消化缓冲液容器、探针稀释缓冲液容器和上样缓冲液容器；杂交缓冲液为下述成分的混合液40mmol/L PIPES(pH6.8)、1mmol/LEDTA(pH8.0)、0.4mol/L NaCl、1mmol/L CTAB以及体积比为80％的去离子甲酰胺；RNA酶消化缓冲液为下述成分的混合液0.3mol/L NaCl、5mmol/LEDTA、10mmol/L Tris－HCl(pH7.4)和50mg/L糖原。本发明的试剂盒灵敏度高、重复性好、生产成本低，且适用于非放射性生物素标记的探针。
文档编号C12Q1/68GK1793381SQ200510101128
公开日2006年6月28日 申请日期2005年11月3日 优先权日2005年11月3日
发明者桂耀庭, 蔡志明, 刘春霖 申请人:北京大学深圳医院