低聚核苷酸类似物的制作方法

专利名称：低聚核苷酸类似物的制作方法
技术领域：
本发明涉及低聚核苷酸类似物及其制备方法和应用。
根据本发明，可制备这样的低聚核苷酸类似物，它们对单链和双链核酸具有良好的杂化性质、核糖核酸酶H-活化性质、良好的水解稳定性以及对核酸酶分裂的良好稳定性，易于用作基团表达抑制剂，例如通过反义作用，以及在治疗疾病例如癌症和病毒例如流感、疱疹和荨麻疹中用作药物。
因此，本发明提供了一种有10-200个天然的和/或合成的核苷单元的低聚核苷酸类似物，核苷单元通过核苷间键连接，其中至少一个核苷间键具有下式结构
式中所示的亚甲基连接到核苷的3′碳原子，所示的氧原子连接到相邻核苷的5′碳原子，R1为氢、羟基、O-、硫醇基、S-、-NH2或者式R1a、-OR1a、-SR1a、-NHR1b或-NR1bR1c的基团，其中R1a为未取代的或取代的C1-C10烷基、C2-C10链烯基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基或C7-C13芳烷基，R1b和R1c各自独立为未取代的或取代的C1-C10烷基、C2-C10链烯基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基或C7-C13芳烷基，或R1b和R1c与连接在上面的氨原予一起构成五元或六元杂环，以及X为氧或硫。
在低聚核苷酸类似物中核苷单元的数目是可变化的，例如从15变化到100，它与低聚核苷酸类似物作为目标的核酸序列的性质有关。优选的是，低聚核苷酸类似物有15-40、特别是15-25个核苷单元。低聚核苷酸类似物对一些目标更优选有15-20个核苷单元，对另一些目标有20-25个核苷单元，对另一些目标有18-25个核苷单元，而对另一些目标有18-22个核苷单元。
在本发明的低聚核苷酸类似物中，式Ⅰ的核苷间键的数目随所需的性质变化。例如，对于某些目的来说，一种式Ⅰ的核苷间键可能是足够的，而对于另一些目的来说，所有的核苷间键可为式Ⅰ，并且可为相同的或不同的。对于大多数目的来说，至多75％，例如至多50％，特别是至多25％的核苷间键可为式Ⅰ。
在本发明的一些实施方案中，在低聚核苷酸类似物中，至少有两个连续的核苷间键，例如2个、3个、4个、5个或6个连续的核苷间键为式Ⅰ，它们可为相同的或不同的。在低聚核苷酸类似物的每一端可有这样的连续核苷间键序列；更通常的是，在有其他核苷间键的核苷序列之间有一个式Ⅰ的这样的连续核苷间键序列。在本发明有两个或更多式Ⅰ的核苷间键的其他实施方案中，式Ⅰ的核苷间键可用其他核苷间键交替，例如沿低聚核苷酸类似物的整个长度，或在低聚核苷酸的一端或两端的区域，或在低聚核苷酸类似物的中部区域。
在本发明不是所有的核苷间键都为式Ⅰ的实施方案中，其余的核苷间键可为天然的磷酸二酯键合或其他合成取代基，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基膦酸酯(-O-P(O)(R)O-)、亚氨膦酸酯、短链烷基、环烷基、短链杂原子、-NHCOCH2-、CH2NHCO-、-CONHCH2-、-CH2CONH-、-CH2NHO-、-CH2N(CH3)O-、-CH2ON(CH3)-、-CH2N(CH3)N(CH3)-或-ON(CH3)CH2-键合，或者两个或多个这样的键合的组合。优选的是，其余的核苷间键为磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键合或这三种类型键合中两个或多个的组合，特别是磷酸二酯、硫代磷酸酯或磷酸二酯和硫代磷酸酯键合的混合物。在某些特别优选的实施方案中，其余的核苷间键为硫代磷酸酯键合。优选的是，不大于50％的核苷间键为硫代磷酸酯键合。
在本发明的一些实施方案中，低聚核苷酸间键或它与硫代磷酸酯或磷酸二酯键合混合物的区域之间含有一个有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯核苷间键的区域，特别是在两个有式Ⅰ核苷间键或它与硫代磷酸酯或磷酸二酯键合的混合物的区域之间含有一个有硫代磷酸酯键合的区域。
在一些特别优选的实施方案中，本发明的低聚核苷酸类似物在两个仅由式Ⅰ的核苷间键连接的核苷区域之间有至少6个由硫代磷酸酯键合连接的核苷的区域。
在本发明的低聚核苷酸类似物中，核苷单元可为天然的或合成的有嘌呤或嘧啶碱的核苷，例如腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶，或者这些碱的类似物，例如2-氨基腺嘧啶、6-羟基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶或二氢尿嘧啶，它们连接到呋喃糖的1′碳原子上。正如熟悉本专业的技术人员理解的，当低聚核苷糖用于反义时，这样选择核苷的序列，以便与目标RNA序列互补。例如，本发明的低聚核苷酸类似物可与人体C-raf激酶的mRNA的区域互补；在这种情况下，优选的序列为WO95/32987中Seq.IDNo.8公开的5′-TCC CGC CTGTGA CAT GCA TT-3′，或者本发明的低聚核苷酸类似物可与人体PKC-α的mRNA区域互补；在这种情况下，优选的序列为WO95/02069中Seq.ID No.2公开的5′-GTT CTC GCT GGT CAG TTT CA-3′。
在本发明一些低聚核苷酸类似物中，至少一个核苷在其2′位被改性，例如提高对给定目标的键联亲合性和/或提高抗核酸酶性。所有的核苷都可这样改性，或者至多80％，例如至多70％、至多60％、至多50％、至多40％、至多30％、至多20％或至多10％的核苷可这样改性。2′位改性原子和基团的例子，即可代替氢原子或羟基连接到核苷的2′位进行改性的原子或基团的例子包括卤素原子，例如氟、氯和溴原子；C1-C10未取代的或取代的烷基，例如甲基、三氟甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、辛基或癸基；C6-C10芳基，例如苯基、甲苯基或二甲苯基；C7-C13芳烷基，例如苄基；氨基，C1-C10烷基氨基，例如甲氨基、乙氨基或辛氨基；C1-C10烷硫基，例如甲硫基、乙硫基或辛硫基；叠氮化物；硝酸酯；亚硝酸酯；氰化物；氰酸酯；甲烷磺酸酯；C1-C10氨烷基氨基；式-OR2的基团，其中R2为C1-C10脂族基团；取代的甲硅烷基；RNA分裂的基团；胆甾烯基；共轭基团；信息基团；嵌入剂，一种改进低聚核苷酸药物动力学性质的基团；以及一种改进低聚核苷酸的药效性质的基团。
在2′位上优选的改性原子和基团是卤素原子，特别是氟，以及式-OR2的基团，其中R2为C1-C10脂族基团，它可为未取代的或取代的C1-C10烷基，例如甲基、乙基、异丙基、丁基、己基、辛基、癸基、三氟甲基、乙氧基乙基、甲氧基乙基或丁氧基乙基；或者C2-C6链烯基，例如乙烯基、烯丙基或甲基烯丙基。特别优选的改性原子和基团是氟和式-OR2的基团，其中R2为未取代的或取代的C1-C10烷基、优选C1-C4烷基，C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基，或者式-(CH2CH2O)-nR3的基团，其中R3为甲基或乙基，n为2-4。特别优选的式-OR2基团是其中R2为甲基、乙基、甲氧基乙基、乙氧基乙基的那些基团或式-(CH2CH2O)-3CH3的基团。
当在2′位改性的核苷存在时，本发明的低聚核苷酸类似物例如可有至少两个通过磷酸二酯核苷间键连接的、在2′位改性的连续核苷，和/或它可在2′位来改性的核苷和2′位改性的核苷的5′碳原子之间有一式Ⅰ的核苷间键。
正如熟悉本专业的技术人员理解的，在低聚核苷酸类似物中的末端核苷可分别有游离的5′和3′位羟基，或者可有改性基团，例如磷酸酯、硫醇、烷基硫、硫代烷基、硫代磷酸酯、氨烷基、吖啶基、胆甾烯基或荧光素基代替这些羟基中的一个或两个。
在式Ⅰ的键合中，R1a、R1b或R1c作为取代的烷基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基可被取代，例如被羟基、C1-C4烷氧基、卤素(优选氯或氟)、氰基、三(C1-C15烃基)甲硅烷基或伯、仲或叔氨基取代。
在式Ⅰ的键合中，其中R1为R1a、-OR1a或-SR1a,R1a作为C1-C10烷基例如可为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、戊基、己基、辛基、壬基或癸基，优选C1-C4烷基；R1a作为C2-C10链烯基或为乙烯基、烯丙基、甲基烯丙基、1-丙烯基、异丙烯基、2-丁烯基、1-丁烯基、异丁烯基、戊烯基、己烯基、辛烯基或癸烯基，优选C2-C5链烯基；R1a作为C3-C8环烷基例如可为环丙基、环丁基、环戊基、甲基环戊基、环己基、甲基环己基、二甲基环己基、环庚基或环辛基，优选C5-C8环烷基；R1a作为C6-C10芳基例如可为苯基、邻甲苯基、间甲苯基、对甲苯基、邻二甲苯基、间二甲苯基、对二甲苯基或萘基，优选C6-C8芳基；R1a作为C7-C13芳烷基例如可为苄基、4-甲基苄基、2-苯基乙基、2-苯基丙基、3-苯基丙基或二苯基甲基，优选C7-C9芳烷基。R1作为-NHR1b可为C1-C10烷氧基，例如甲氨基、乙氨基、异丙氨基、丁氨基、戊氨基、己氨基、辛氨基或癸氨基，优选C1-C4烷氨基；C2-C10链烯基氨基，例如烯丙基氨基、甲基烯丙基氨基、1-丙烯基氨基、异丙烯基氨基、异丁烯基氨基、己烯基氨基、辛烯基氨基或癸烯基氨基，优选C3-C5链烯基氨基；C3-C8环烷基氨基，例如环丙基氨基、环丁基氨基、环戊基氨基、环己基氨基、环庚基氨基、环辛基氨基或二甲基环己基氨基，优选C5-C8环烷基氨基；C6-C10芳氨基、例如苯氨基、邻-、间-或对-甲苯氨基、邻-、间-或对-二甲苯氨基或萘氨基，优选C6-C8芳氨基；C7-C13芳烷基氨基，例如苄氨基、4-甲基苄氨基、2-苯基乙氨基、3-苯基丙氨基或二苯基甲氨基，优选C7-C9芳烷基氨基。R1作为-NR1bR1c可为二(C1-C10烷基)氨基，例如二甲基氨基、二乙基氨基、甲基乙基氨基、二异丙基氨基、二丁基氨基或二辛基氨基，优选二(C1-C4烷基)氨基；N,N-二(C2-C10链烯基)氨基，例如二烯丙基氨基、二甲基烯丙基氨基、烯丙基甲基烯丙基氨基、二丙烯基氨基、二丁烯基氨基、二戊烯基氨基、二己烯基氨基、二辛烯基氨基或二癸烯基氨基，优选二(C3-C5链烯基)氨基；N,N-二(C3-C8环烷基)氨基，例如二环丙基氨基、环丙基环戊基氨基、二环丁基氨基、二环戊基氨基、二环己基氨基、二环庚基氨基或二环辛基氨基，优选N,N-二(C5-C8环烷基)氨基；N-C3-C8环烷基-N-C1-C10烷基氨基，例如N-环戊基-N-甲基氨基、N-环戊基-N-乙基氨基、N-环己基-N-甲基氨基、N-环己基-N-乙基氨基，优选N-(C5-C8环烷基)-N-C1-C4烷基氨基；N-C6-C10芳基-N-C1-C10烷基氨基，优选N-C6-C8芳基-N-C1-C4烷基氨基，例如N-苯基-N-甲基氨基、N-甲苯基-N-甲基氨基或N-苯基-N-乙基氨基；N,N-二(C7-C13芳烷基)氨基，例如二苄基氨基、二(4-甲基苄基)氨基、二(苯乙基)氨基或二(苯丙基)氨基，优选N,N-二(C7-C9芳烷基)氨基；或N-C7-C13芳烷基-N-C1-C10烷基氨基，优选N-C7-C9芳烷基-N-C1-C4烷基氨基，例如N-苄基-N-甲基氨基或N-苄基-N-乙基氨基，或通过氮原子连接到式Ⅰ中所示的磷原子的五元或六元N杂环的基团，例如1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-哌嗪基或吗啉基。如上所述，上述基团中任何一个都可为未取代的或取代的。
在一些优选的实施方案中，R1为氢、羟基、O-、SH、S-、未取代的或取代的C1-C4烷基或苯基、或-OR1a的基团(其中R1a为未取代的或取代的C1-C4烷基、C3-C5链烯基、C5-C8环烷基或C7-C9芳烷基)或式-SR1a的基团(其中R1a为未取代的或取代的C1-C4烷基或苯基)，任选取代基为上述的。在某些特别优选的实施方案中，R1为氢、羟基、O-、SH、S-、甲氧基、乙氧基或2-氰基乙氧基。
在式Ⅰ中的R1为O-的场合下，本发明的低聚核苷酸类似物可为药物学上可接受的盐的形式，例如金属盐，优选碱金属盐，或未取代的或取代的铵盐，例如一、二或三C1-C10烷基-或羟烷基-铵盐、N-乙基哌啶鎓盐或N,N′-二甲基哌嗪鎓盐。在R1为O-的特别优选的实施方案中，低聚核苷酸类似物为钠盐或铵盐形式。
在式Ⅰ中的磷原子为手性中心的场合下，可观测到杂化性质和抗核酸酶性质的差别以及与磷的立体化学有关的生物效率的差别。
本发明的低聚核苷酸类似物可用式V-L-(V-L)n-V表示，其中n为8-198中的一个数，每一V独立为天然的或合成的核苷的残基，每一n+2残基V与相邻残基V是相同的或不同的，每一L为一核苷间键，每一n+1键合L与相邻键合L是相同的或不同的，至少一个L为式Ⅰ。
本发明还提供一种制备有至少一个式Ⅰ的核苷间键的低聚核苷酸类似物的方法，例如低聚核苷酸有2-200个核苷单元，例如上述的低聚核苷酸类似物，该法包括(ⅰ)在(A)有5′羟基的天然的或合成的核苷或低聚核苷酸和(B)在3′位有能与所述的5′羟基反应的基团的天然或合成核苷或二核苷酸之间进行偶联反应或顺序偶联反应，一直到制得有所需数目核苷的低聚核苷酸为止，在至少一所述的偶联反应中，(B)为下式的核苷
式中，B1为核苷碱基团，R4为羟基保护基团，R5为氢、羟基或2′位改性原子或基团，M+为金属或未取代的或取代的铵离子或杂环碱例如吡咯烷、哌啶、N-乙基哌啶、N,N′-二甲基哌嗪、吗啉或1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)的阳离子，X为氧或硫，它在位阻有机酰卤或酸酐存在下与(A)反应，生成有下式的亚膦酸酯核苷间键的低聚核苷酸类似物
式中，X为氧或硫，以及(ⅱ)(a)亚膦酸脂键合氧化或(b)亚膦酸酯键合硫化或(C)亚膦酸酯键合与式R1aY的化合物反应，其中R1a规定如上，Y为一离去原子或基团，或(d)亚膦酸酯键合与式R1aOH的醇或式R1bNH2或R1bR1cNH的胺氧化和反应，其中R1a、R1b和R1c规定如上，或(e)亚膦酸酯键合甲硅烷化和甲硅烷化的键合与硫代烷基化剂或硫代芳基化剂反应。得到式Ⅰ的亚膦酸酯键合。其中R1为-SR1a,R1a规定如上。
规定如上的方法可在溶液中或固体载体上进行，例如使用已知的低聚核苷酸合成步骤。用这一方法制得的低聚核苷酸类似物可进一步反应，用氢代替保护基R4，或者在R4在低聚核苷酸类似物中的末端核苷上的场合下，通过上述的5′位改性基团代替保护基R4。
本发明的低聚核苷酸类似物可用固相合成法来制备，例如使用H-膦酸盐、磷酸三酯或亚胺膦酸酯或两种或两种以上的混合物，例如使用商购的自动化核酸合成器。固相合成法可包括与连接到固体载体上的核苷或低聚核苷酸(A)进行如上述的顺序偶联反应(ⅰ)，如上述步骤(ⅱ)，然后(ⅲ)从固体载体上除去低聚核苷酸并除去保护基团，得到有末端5′位游离羟基的低聚核苷酸以及(ⅳ)任选使5′位游离羟基反应，在末端5′位引入改性基团。
在式Ⅱ的核苷中，如上所述，B1可为嘌呤或嘧啶碱或其类似物。其中B1为天然核苷碱、更优选嘧啶碱、特别是胸腺嘧啶的化合物是优选的。R4可为任何能保护5′位羟基不受不希望的反应的羟基保护基。这样的基团是大家熟悉的，包括C1-C10脂族基团，例如烷基；C3-C8环脂族基团，例如环烷基；C6-C10芳族基团，例如芳基；C7-C40芳脂族基团，例如芳烷基或C1-C4烷氧基取代的芳烷基；或-COR6或-SO2R6的基团，其中R6为C1-C10脂族基团、C3-C8环脂族基团、C6-C10芳族基团或C7-C40芳脂族基团；以及三(C1-C15烃基)甲硅烷基。优选的是，R4为传统用于低聚核苷酸合成的5′位保护基团，特别是甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基或三叔丁基三苯甲基。R5作为2′位改性的原子或基团可为上述的原子或基团；优选的是R5为氢。M+例如可为碱金属离子或优选未取代的铵离子、一、二或三C1-C10烷基-或羟烷基-铵离子或杂环碱例如吡咯烷、哌啶、N-乙基哌啶、N,N-二甲基哌嗪、吗啉或DBU的阳离子。特别优选的M+为三乙基铵离子。
式Ⅱ核苷的优选立体异构体为下式的立体异构体
式中，B1、R4、R5、X和M+规定如上。
式Ⅱ的核苷可用以下步骤制备a)下式的化合物与(1,1-二乙氧基乙基)亚膦酸乙酯在碱例如双(三甲基甲硅烷基)氨化钾存在下，在四氢呋喃(THF)中，在-80至40℃下反应，
式中，B1和R4规定如上，R5a为氢、氟或-OR2，其中R2规定如上，L为一离去原子或基团，优选碘原子，生成下式的化合物
式中，B1和R5a规定如上；b)式Ⅳ的化合物在含有1％乙醇的氯仿中，在氩气下，在室温下与三甲基甲硅烷基氯反应，以便用氢代替连接到磷上的保护缩酮基团；c)在异丙醇钛(Ⅳ)存在下，在干燥的THF中，在室温下，b)得到的产物与丙酮反应，生成下式的化合物
d)式Ⅴ的化合物在THF中，在室温下与四正丁基氟化铵和乙酸反应，以除去叔丁基二苯基甲硅烷基保护基；e)生成的含5′-羟基的化合物在有机碱存在下与式R4Y化合物反应，其中R4规定如上，Y为卤素，生成下式的化合物
式中B1、R4和R5a规定如上；f)式Ⅵ的化合物在室温下，在无水甲醇中与碱金属甲醇盐，或在水中与DBU反应，以除去乙基和用氢代替-C(CH3)2OH基；g)如果需要，用氨或胺处理产物，生成相应的未取代的或取代的铵盐；以及h)如果需要，使产物硫化，得到式Ⅱ的核苷，其中X为硫，例如采用有机化学杂志，第60卷，第8241页，1995年中描述的步骤，与新戊酰氯反应，随后与(CH3)3Si-S-Si(CH3)3反应。
可使式Ⅳ、Ⅴ或Ⅵ的化合物反应，在2′位引入不同的改性原子或基团R5，例如用传统的步骤将这样的2′位改性原子或基团引入核苷。
可通过下式的醛在无水乙醇中、在室温下用NaBH4还原生成相应的醇，
式中，B1和R5a规定如上，该醛按照WO92/20823中公开的方法制备，然后生成的醇在2,6-二甲基吡啶存在下，在干燥的二甲基甲酰胺中，在0-30℃下与甲基三苯氧基碘化磷鎓反应来制备式Ⅲ的化合物。
(1,1-二乙氧基乙基)亚膦酸乙酯可按EP0307362中公开的制备。
在使用固相合成的典型步骤中，有被保护的5′位羟基的天然的或合成的核苷使用连接剂例如琥珀酸酐，在3′位共价连接到惰性的氧化硅为基础的载体上，例如含有长链烷氨基的受控孔的玻璃(CPG)，得到连接到固体载体上的3′-末端核苷。固体载体也可含有对于所需的低聚核苷酸起3′末端改性基团作用的基团。然后除在连接在末端核苷的5′羟基上的保护基团，例如二甲氧基三苯甲基，得到游离的5′羟基。末端核苷然后与这样的天然和合成核苷或二核苷酸(B)偶联，得到连接到固体载体上的二聚的低聚核苷酸(或其中(B)为二核苷酸、三聚低聚核苷酸)，(B)有被保护的，例如二甲氧基三苯甲基被保护的5′羟基以及在3′位有这样一基团，它可与末端核苷上的5′位游离羟基反应的或活化反应的基团。除去连接低聚核苷酸上的5′位保护基后，重复与有3′位反应性基团的天然或合成5′位被保护核苷或二核苷酸(B)的反应循环，一直到合成出有所需核苷数目的低聚核苷酸为止。
为了生成不同于式Ⅰ的核苷间键，根据传统的低聚核苷合成步骤选择核苷或二核苷酸(B)的3′位的反应性基团或活化反应性基团，例如可为H-膦酸盐基、亚氨膦酸酯基或磷酸二脂基。可用传统的步骤进行偶联反应，如果需要，随后进行氧化、硫化或其他处理，生成这些核苷间键，例如磷酸三酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键合。
在本发明的低聚核苷酸类似物的制备中，至少一个偶联反应使用式Ⅱ的核苷作为(B)来进行，它与核苷或核苷酸(A)反应，它在固相合成中连接到固体载体上，偶联反应在位阻的有机酰卤或酸酐存在下进行，例如新戊酰氯、金刚酰氯、2,4,6-三异丙基苯磺酰氯、二苯基次膦酰氯、双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯、2-氯-2-氧代-5,5-二甲基-1,3,2-二氧杂膦或双(五氟苯基)酐。优选的是，反应在杂环碱(在环中有叔氮原子)或这样的碱的氧化物存在下，例如吡啶、喹啉、N-甲基咪唑或吡啶-N-氧化物以及特别是有机溶剂例如乙腈存在下进行。偶联反应可在室温或中等升温下，例如在至多50℃下进行。
使用式Ⅱ的核苷作为(B)的偶联反应制得的式ⅠA的亚膦酸酯核苷间键可在下一偶联反应进行以前或者优选有所需数目核苷的低聚核苷酸类似物合成以后进行氧化或硫化，它可与用式Ⅱ的核苷通过其他偶联反应生成的一种或多种其他亚膦酸酯核苷间键或用3′H-膦酸盐取代的核苷通过偶联反应制成的亚磷酸酯键合一起氧化或硫化。氧化(ⅱ)(a)可通过用碘和水处理或用叔丁基氢过氧化物处理来实现，例如使用用于亚磷酸酯核苷间键氧化的传统步骤来实现。硫化(ⅱ)(b)可通过在叔胺存在下，在有机溶剂中，通常为二硫化碳，用碳处理来实现，例如用已知的步骤来实现。
式ⅠA的亚膦酸酯核苷间键与式R1aY的化合物的反应(ⅱ)(c)可使用已知的步骤来进行，R1aY中R1a和Y规定如上，Y优选为卤素原子或三氟甲烷磺酸基，R1a为烷基、环烷基或芳烷基，例如可通过式ⅠA的亚膦酸酯键合与R1aY(其中Y为卤素)在强碱例如氢化钠存在下反应来进行。在R1aY为链烯基或芳基卤化物或三氟甲磺酸酯的场合下，亚膦酸酯键合和R1aY之间的反应可用已知的步骤来进行，例如在钯催化剂例如Pd(PPh3)4和叔胺存在下进行，例如在Y、Xu等，四面体通讯，30,949(1989)或K.S.Petrakis等，美国化学会杂志，109,2831(1987)中描述的。
在下一偶联反应以前或在合成出有所需数目核苷的低聚核苷酸以后，式ⅠA的亚膦酸酯核苷间键与式R1aOH的醇的氧化反应(ⅱ)(d)可通过在醇R1aOH和碱例如吡啶存在下，例如在亚磷酸酯核苷间键氧化的传统条件下与氧化剂例如碘、四氯化碳和-溴三氯甲烷反应来进行。
在下一偶联反应以前或在合成出有所需数目核苷的低聚核苷酸以后，式ⅠA的亚膦酸酯核苷间键的氧化反应(ⅱ)(d)可用式R1bNH2或R1bR1cNH的胺(R1b和R1c规定如上)和四氯化碳或-溴三氯甲烷或碘来进行，得到本发明的低聚核苷酸类似物，其中R1分别为-NHR1b或-NR1bR1c。反应可用对于Atherton-Todd反应已知的条件和步骤来进行。
式ⅠA的亚膦酸酯键合的反应(ⅱ)(e)可用以下步骤来进行用已知的甲硅烷化步骤使键合甲硅烷化，例如用三烷基甲硅烷基卤和碱例如三乙胺；甲硅烷化的键合与硫代烷基化剂或硫代芳基化剂例如式ArSO2SR1a的硫代磺酸酯反应，其中R1a规定如上，Ar为芳族基团，例如苯基或甲苯基。这一反应的适合步骤由W.K.D.Brill，四面体通讯，36,703(1995)描述。
对于熟悉本专业的技术人员来说，很显然在式ⅠA的亚膦酸酯键合反应以便用含反应性基团例如氨基的R1基代替连接到磷上的氢原子中，在反应引入R1的过程中，如果在反应条件下取代基是反应性的，应保护取代基，随后再去护。
当在固体载体上合成出有所需核苷数目的低聚核苷酸类似物时，它从固体载体上分离出来，例如用浓氨水处理的传统的方法，这一处理也除去在低聚核苷酸合成中使用的一种或多种核苷中的环外氮原子上可能存在的保护基团，在处理除去羟基保护基团例如二甲氧基三苯甲基前后，上述保护基也可用传统的方法来进行，例如用有机酸例如三氟乙酸的水溶液处理。
在低聚核苷酸从固体载体上分离的前后，在去护时产生的末端5′位羟基可反应，以便引入5′位末端改性基，例如磷酸酯基或如上述的其他5′位改性基团，例如用Beaucage和Lyer，四面体，49,192563(1993)描述的步骤。
在上述合成方法的改进中，式Ⅱ的核苷可用下式的二核苷酸代替
式中，B1、R1、R4和R5规定如上，B2为核苷碱基团，它可为上述对B1的天然或合成核苷碱的基团，R6为氢、羟基或2′位改性原子或基团，如对R5规定的，R7为能与核苷中5′位羟基有反应性的或活化反应性的基团。
在这一改进中，在式Ⅷ的核苷酸中的R7O可为H-膦酸盐基；在这种情况下，式Ⅷ的二核苷酸可在位阻的有机酰卤存在下，例如使用3′位H-膦酸盐制备低聚核苷酸合成的传统步骤，与在固相合成中它连接到固体载体上的核苷或低聚核苷酸(A)反应制成亚磷酸酯核苷间键，然后它可氧化、硫化或与式R1aY的化合物反应，或进行另外的反应(ⅱ)(a)至(ⅱ)(e)，如上述由式Ⅱ的核苷与(A)反应制成的式ⅠA亚膦酸酯核苷间键那样。
在这一改进中，在式Ⅷ的二核苷酸中的R7O基团另一方面可为亚氨膦酸酯基团，在这种情况下，式Ⅷ的二核苷酸可与核苷或低聚核苷酸(A)反应，例如使用3′位亚氨膦酸酯制备低聚核苷酸的传统步骤。
在这一改进的另一实施方案中，式Ⅷ二核苷酸中的R7O基团可为磷酸二酯基；在这种情况下，式Ⅷ的二核苷酸可与核苷或低聚核苷酸(A)反应，例如使用3′位磷酸二酯制备低聚核苷酸的传统步骤。
式Ⅷ的二核苷酸可用以下步骤来制备式Ⅱ的核苷在脱水偶联剂例如碳化二亚胺或位阻的有机酰卤或酸酐的存在下，与下式的核苷反应
式中，B2和R6规定如上，R8为羟基保护基，制得下式的二核苷酸
，任选将式X中的核苷间键进行上述反应(ⅱ)(a)至(ⅱ)(e)中任一反应后，将R8O基团转化成R7O-基团。
可从上述对R4所述的基团中选择羟基保护基团R8。R8优选为传统用于核苷化学的3′位保护基团，特别是叔丁基二苯基甲硅烷基。
式Ⅸ的核苷是3′位被保护的天然或合成核苷，它们可有氢、羟基或在2′位的2′位改性原子或基团。这样的核苷是已知的或可用已知方法制备的。
式Ⅱ的核苷和式Ⅸ的核苷之间在位阻的有机酰卤存在下的反应如上所述式Ⅱ的核苷与核苷或低聚核苷酸(A)的反应那样优选在杂环碱或其氧化物和有机溶剂中进行。
基团R8O-转化成基团R7O-(其中R8和R7规定如上)可用被保护的3′位羟基转化成能与5′位羟基反应的或活化反应的基团，例如H-膦酸盐、亚氨膦酸酯或磷酸二酯基的传统方法来进行。例如，保护基R8可被除去，生成游离的3′位羟基，然后它可与脂族的双(N,N-二烷基)亚氨膦酸酯例如双(N,N-二异丙基)二亚氨膦酸2-氰乙基酯反应，生成3′位亚氨膦酸酯基。
其中R5和R6中的一个或每一个为规定如上的2′位改性原子或基团，特别是规定如上的式-OR2基团的式Ⅷ二核苷酸是新的化合物。式Ⅹ的二核苷酸是新的化合物。因此，本发明还提供下式的新型二核苷酸
式中，B1、B2、R1、R4规定如上，R5和R6规定如上，不同的是，在R1不为氢的场合下，R5和R6中至少一个为如上规定的2′位改性原子或基团，R9为如上规定的R7或R8，特别是R5为氢或羟基，R6为如上规定的2′位改性原子或基团，特别是如上规定的式-OR2基团。
其中R1为C1-C10烷氧基的式Ⅷ二核苷酸也可用以下步骤来制备下式的核苷与式Ⅸ的核苷在叔胺例如二甲基氨基吡啶和脱水剂例如二环己基碳化二亚胺(DCC)存在下反应，
式中，B1、R4和R5规定如上，生成式Ⅹ的二核苷酸，然后将它按如上所述处理，得到式Ⅷ的二核苷酸。式Ⅻ和Ⅸ的核苷之间的反应可在溶剂例如THF中，在室温下进行。
式Ⅻ的核苷可通过使用传统的步骤，用酸处理式Ⅱ的核苷(式Ⅻ酸的盐形式)来制备。
至少有一个式Ⅰ核苷间键的低聚核苷酸，例如有2-200个核苷单元的低聚核苷酸，例如如上所述的低聚核苷酸类似物也可用以下步骤来制备将有被保护的5′位羟基和在3′位有下式基团的核苷与有游离5′位羟基的天然或合成核苷或低聚核苷酸进行核苷偶联反应，
式中，R1a规定如上，R10和R11各自独立为未取代的或取代的C1-C10烷基、C2-C10链烯基、C4-C10环烷基、C6-C10芳基或C7-C13芳烷基，或R10为所述的基团，而R11为氢，或R10和R11与连接在上面的氮原子一起构成5元至十三元杂环，生成下式的核苷间键的低聚核苷酸前体，
式中R1a规定如上；以及通过以下反应将前体转化成有下式的核苷间键的低聚核苷酸，
式中，R1a规定如上，X为氧或硫将前体氧化生成有式ⅩⅤ核苷间键的低聚核苷酸(其中X为氧)或将前体硫化生成有式ⅩⅤ核苷间键的低聚核苷酸(其中X为硫)。
生成有式ⅩⅣ键合的前体的反应可在胺质子化偶联催化剂(活化剂)例如四唑或5-(4-硝基苯基)四唑存在下进行。反应可在-20至50℃、优选室温下进行。生成的前体的氧化或硫化可用亚磷酸酯核苷间键氧化或硫化使用的方法来进行。例如，可使用低聚核苷酸合成中亚磷酸酯键合氧化的已知条件和步骤，用碘和水，或用氢过氧化物例如叔丁基氢过氧化物处理来进行氧化。例如使用亚磷酸酯核苷间键硫化的已知步骤，在叔胺存在下，在有机溶剂中，通学在二硫化碳中，通过用[3H]1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物(Beaucage试剂)或用四乙基秋兰姆处理，用硫处理来进行硫化。
有被保护的5′位羟基和在3′位有式ⅩⅢ基团的核苷可用以下方法来制备有被保护的5′位羟基和在3′位有下式基团的核苷
式中R1a规定如上，Z为卤素，与下式的化合物反应，
式中，R10和R11规定如上。反应可在有机溶剂例如卤化的烃类例如氯仿中，在叔氮碱例如吡啶存在下，在-78至50、优选-30至25℃下进行。
有被保护的5′位羟基和在3′位有式ⅩⅥ的基团的核苷可通过有被保护的5′位羟基和在3′位有下式的基团的核苷非氧化的卤化来制备。
非氧化的卤化可在碱、优选叔氮碱例如吡啶存在下，在有机溶剂(它可为吡啶，但优选为卤化烃例如氯仿)中，在-20至60、优选0至50℃下与非氧化的卤化剂例如卤代正膦如三苯基二氯正膦或二氯三(2,4,6-三溴苯氧基)正膦反应来进行。
有被保护的5′位羟基和在3′位有式ⅩⅧ基团的核苷可按WO96/08503中公开的来制备。
当有式ⅩⅤ的键合的低聚核苷酸在固体载体上生成时，它可经处理除去5′位保护基团，生成的5′位羟基端接的低聚核苷酸与有被保护的5′位羟基和在3′位有与连接到固体载体上的去护的低聚核苷酸上的游离5′位羟基是反应性的或活化反应性的基团的天然或合成核苷或低聚核苷酸进行顺序偶联循环，一直到制得有所需长度的低聚核苷酸为止。例如，有式ⅩⅤ的键合的低聚核苷酸可与有3′亚氨膦酸酯、H-膦酸盐、磷酸二酯基或式ⅩⅢ的3′位基团以及被保护的5′位羟基的核苷或低聚核苷酸偶联，得到链增长的低聚核苷酸，它反过来通过另外的供选择的反应进一步链增长，一直到制得有所需长度的低聚核苷酸。在使用有3′位亚氨膦酸酯、H-膦酸盐或磷酸二酯基的核苷或低聚核苷酸的场合下，偶联反应可使用在低聚核苷酸合成中已知的步骤来进行。在使用有式ⅩⅢ的3′位基团的核苷场合下，偶联反应可按如上所述的进行。例如，在使用3′位亚氨膦酸酯或式ⅩⅢ的3′位基团的场合下，偶联循环包括氧化或硫化，而在使用3′位H-膦酸盐的场合下，在链增长完成后进行氧化或硫化，而在使用3′位磷酸二酯的场合下，不需要氧化。
本发明的低聚核苷酸类似物可用于治疗学，例如治疗人体或其他动物通过蛋白质调制的疾病或治疗病毒，例如流感，疱疹和荨麻疹。因此，本发明还提供了一种含有本发明的低聚核苷酸类似物作为有效成分的药物组合物。熟悉本专业的技术人员很容易确定最佳的剂量和治疗方案。当给约70kg重的哺乳动物给药时，例如剂量可为每天0.01-1000mg。本发明的治疗剂体内给药例如口服吸入、静脉内或肌内通常是优选的。其他给药方法，例如透皮、局部或病灶内给药法以及栓剂也是适用的。对于某些治疗来说，与药理学上可接受的载体一起使用是优选的。
本发明的低聚核苷酸类似物对核酸酶的降解有很高的稳定性。还观测到与互补的核酸链，特别是RNA型的有很好的配对性。所以，本发明的低聚核苷酸类似物特别适用反义技术，即由于键联到核酸中适合的互补核苷酸序列，抑制不希望的蛋白质产物的表达(参见EP0266099、WO87/07300和WO89/08146)。它们可用于治疗感染和疾病，例如在核酸阶段阻断生物活性蛋白质的表达(例如致肿瘤基团)。本发明的低聚核苷酸类似物还适合作诊断剂，以及可用作通过单链或双链核酸阶段的选择性相互作用确定病毒感染以及与遗传有关的疾病的基团探针。特别是，由于对核酸酶的稳定性提高，诊断应用不仅在体外是可能的，而且在体内也是可能的(例如组织样、血浆和血清)。这类应用的可能性例如在WO91/06556中公开。
式Ⅺ的新型二核苷酸可用作药物，例如用作抗病毒剂。
本发明的药理学活性的低聚核苷酸类似物和二核苷酸可以肠胃外给药的制剂形式或输液形式使用。这类溶液优选为等渗性水溶液或悬浮液，在使用前制备它们是可能的，例如在冻干制剂的情况下，冻干制剂独自含有活性物质，或含有活性物质和载体，例如甘露糖醇。药物制剂可被消毒和/或含有赋形剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂和/或乳化剂、增溶剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。如果需要，药物制剂可含有另外的药理学上活性的物质，例如抗菌素，药物制剂可按本身已知的方法来制备，例如用传统的溶解方法或冻干方法，它们含有约0.1至90、特别是约0.5至约30、例如1至5％活性物质。
用以下实施例来说明本发明。
在实施例中使用的化合物及其前体制备如下。这些化合物所有的31P数据和实施例的数据都为1H去偶的。
化合物A
Ph=苯基T=1-胸腺嘧啶基在5分钟内分批将NaBH4(865mg,23mmol)在室温下加到按WO92/20823中公开制备的式ⅩⅢ的醛(11.2g,23mmol)于无水乙醇(120ml)的溶液中。1小时后，用水急冷反应混合物，用乙酸乙酯(500ml)稀释，并用水(2×50ml)洗涤。水相反萃取后，将合并的有机相干燥(MgSO4)，并浓缩得到化合物A白色固体。1H nmr(CDCl3,400MHz)δ9.10(1H,s,NH)7.65(4H,d,Ar4×CH ortho),7.40(7H,m,Ar4×CH meta,2×CH para+H6)6.13(1H,t,H1′)4.00(1H,dd,H5′),3.93(1 H,m,H4′)3.82(1H,dd,H5′),3.62(2H,m,CH2OH)2.60(1H,m,H3′),2.32(1H,m,H2′),2.12(1H,m,H2′)1.62(3H,s,T-CH3)和1.10(9H,s,tBu)ppm.化合物B
Ph=苯基T=1-胸腺嘧啶基将2,6-二甲基吡啶(4.25ml,36.5mmol)在0-5℃下加到化合物A(9g,18.1mmol)于干燥DMF(100ml)的溶液中，随后加入甲基三苯氧基碘化磷鎓9.45g,20.9mmol)。将生成的混合物加热到室温。1小时后，将混合物稀释(200ml乙酸乙酯)，并用0.1N Na2SO3(2×20ml)洗涤，0.5N盐酸(2×20ml)洗涤和水(2×20ml)洗涤。干燥，浓缩和用快速氧化硅柱色谱纯化(梯度洗脱剂氯仿∶乙酸乙酯20∶1至7∶1)，得到化合物B白色固体。1H nmr(CDCl3,400MHz)δ10.2(1H,s,NH)7.66(4H,d,4×CH ortho),7.40(7H,M,4×CHmeta,2×CH para+H6)6.19(1H,t,H1′)4.02(1H,dd,H5′),3.82(1H,m,H4′)3.78(1H,dd,HS′),3.17(1H,dd,CH2l)3.10(1H,dd CH2l),2.68(1H,m,H3′),2.30(1H,m,H2′)2.23(1H,m,H2′)1.66(3H,s,CH3-T),1.10(9H,s,tBu)ppm.化合物C
在氢气、-78℃下，在5分钟内将双(三甲基甲硅烷基)氨化钾(34.6ml,0.75M甲苯溶液)溶液滴加到(1,1-二乙氧基乙基)亚膦酸乙酯(5.51g,26.2mmol)于干燥THF(170ml)的溶液中。将生成的溶液在-78℃下搅拌1小时。然后将化合物B(5.0g,8.25mmol)于干燥THF(20ml)的溶液在5分钟内滴加入。在-78℃下搅拌1小时后，在2小时内加热到室温。然后加入氯化铵饱和水溶液(50ml)，并用乙酸乙酯(500ml)萃取整个混合物。用氯化铵饱和水溶液(2×50ml)和水(2×50ml)洗涤有机相。在硫酸镁上干燥，并浓缩。用快速氧化硅柱色谱(洗脱剂乙酸乙酯∶乙醇30∶1)纯化，得到在磷处非对映异构体差向立体异构体的1∶1混合物的混合物C。
化合物D
(Ph=苯基，T=1-胸腺嘧啶基在室温下将三甲基甲硅烷基氯(4.44ml,35mmol)滴加(2分钟)到在氩气下的化合物C(2.4g,3.5mmol)于含有乙醇(1％)的氯仿(25ml)的搅拌溶液中。在-20℃下静置60小时后，将另一部分三甲基甲硅烷基氯(2.22ml,17.5mmol)和乙醇(200μl)一起加入，将生成的溶液在室温下搅拌7小时。浓缩和用氯仿(50ml)蒸发，得到白色固体，它用快速氧化硅柱色谱纯化(洗脱剂氯仿∶乙醇13∶1)，得到非对映异构体1∶1混合物白色固体。化合物E
将异丙醇钛(Ⅳ)(738μl,2.48mmol)加到化合物D(1.2g,2.1mmol)于含丙酮(3.2ml)的干燥THF(30ml)的溶液中。15分钟后，浓缩并通过氧化硅短柱(洗脱剂乙酸乙酯∶乙醇4∶1)(500ml)，得到两种非对映异构体的混合物的化合物E。
31Pnmr1H去偶(CDCl3,162MHz)δ55.0,54.7ppm测量值C57.7,H7.05,N4.05％C32H45N2O7PSi·2H2O要求C57.8,H7.4,N4.2％化合物F
将四正丁基氟化铵(1.63ml,1.0M)的溶液加到化合物E(1.02g,1.62mmol)和乙酸(92μl,16.1mmol)于THF(10ml)的溶液中。在室温下搅拌1小时后，将混合物浓缩，并与氯仿(50ml)共蒸发。用快速氧化硅柱色谱(洗脱剂氯仿∶乙醇9∶1)纯化，得到两种非对映异构体混合物的化合物F。实测值C 45.55,H 6.85,N 6.4％C16H27N2O7P.1 2/3H2O要求C 45.7,H 7.25,N 6.6％31P nmr1H去偶(CDCl3,162MHz)δ56.7,56.5ppm.化合物G
将二甲氧基三苯甲基氯(958mg,2.83mmol)加到化合物F(550mg,1.41mmol)于吡啶(10ml)的溶液中。在室温下搅拌20小时后，浓缩，并用快速氧化硅柱色谱(洗脱剂氯仿、甲醇、三乙胺100∶5∶1)纯化，得到两种非对映异构体混合物化合物G。
31P nmr1H去偶(CDCl3,162MHz)δ54.9,54.7ppm化合物H
将甲醇钠(1.5ml4.4N甲醇溶液)加到化合物G(0.85g,1.22mmol)于无水甲醇(10ml)的溶液中。在室温下搅拌16小时后，浓缩并用快速氧化硅色谱(梯度洗脱剂氯仿、甲醇、三乙胺100∶20∶1至100∶35∶1)纯化，随后将产物于0.5％三乙胺水溶液中的溶液通过Dowex 50W-X2离子交换柱(三乙胺型)进一步纯化，浓缩后得到化合物H。
31P nmr1H去偶(CD3OD,162MHz)δ23.7ppm。
化合物J
化合物J按WO96/08503实施例98中描述的制备。
在化合物K至M的化学式中，T为胸腺嘧啶基，DMTr为二甲氧基三苯甲基。
化合物K
在室温下将3-羟基丙腈(58μl,0.85mmol)加到在氩气下的化合物H(500mg,0.71mmol)和二环己基碳化二亚胺(189mg,0.92mmol)于干燥THF(5.4ml)的溶液中。将生成的溶液在55℃下加热2小时。冷却后，将混合物过滤，用乙酸乙酯(20ml)稀释，用水和盐水洗涤，在Na2SO4上干燥，过滤和浓缩。将生成的产物吸收在二氯甲烷(5ml)中，过滤和浓缩，如果需要，重复这一过程，除去二环己基脲，得到在磷处非对映异构体混合物化合物K。
31P nmr(1H去偶)(CDCl3,162MHz)δ37.4,37.3ppm)。
化合物L和M
将二氯三苯基正膦(113mg,350μmol)加到仔细干燥的化合物K(71mg,220μmol)于含吡啶(80ml,1mmol)的氘化氯仿(0.5ml)的溶液中。将生成的溶液摇动，使正膦溶解，然后在室温下静置。用31P nmr监测反应进程。产物为化合物L。16小时后，加入另外的二氯三苯基正膦(28mg,87μmol)。24小时后，31P nmr表明反应完成95％。在-30℃下将总计56μl(0.67mmol)吡咯烷分批加入到粗反应混合物中。将生成的混合物加热到室温，然后用二氯甲烷(20ml)稀释，用去离子水(2×10ml)洗涤2次，干燥(Na2SO4)和浓缩。用快速氧化硅柱色谱纯化，得到化合物M。
实施例1-13在以下实施例中，化合物H和化合物J在低聚核苷酸类似物合成中用作单体。未改性的5′-二甲氧基三苯甲基取代的核苷H-膦酸盐也用作商购的三乙基铵盐，缩写如下Tp=胸苷H-膦酸盐Cp=N4-苯甲酰基-脱氧胞苷-H-膦酸盐Ap=N6-苯甲酰基-脱氧腺苷-H-膦酸盐Gp=N2-异丁酰基-脱氧鸟苷-H-膦酸盐低聚核苷酸的合成在聚丙烯注射器中用商购的核苷(Tp、Cp或Ap)衍生的长链烷基胺受控孔玻璃手工进行。第一残基在以下实施例的3′末端由这一商业材料得到。合成在0.2μmol规模上在3′至5′方向进行。
实施例1低聚核苷酸类似物15′TTT T*TC TCT CTC TCT3′式中，*为式Ⅰ的核苷间键(其中X为氧和R1为羟基)，所有其他键合为磷酸二酯键合。
载体(6.8mg)用二氯甲烷洗涤，用二氯乙酸处理来除去5′位保护基，在偶联制备中再次洗涤载体。在用未改性的核苷H-膦酸盐偶联的场合下，在新戊酰氯(182mM)存在下，也在吡啶-乙腈(1∶1体积比，200μl)中，用5′位被保护的核苷H-膦酸盐(30mM(对于胸苷)；20mM(对于胞苷))于吡啶-乙腈(1∶1体积比，200μl(对于胸苷)，300μl(对于胞苷))的溶液处理载体1分钟。
为了得到所需的低聚核苷酸类似物，进行通常的H-膦酸盐DNA合成，不同的是，单体化合物H对于未改性的核苷H-膦酸盐来说是取代的，当在合成中达到T*位以及改变的偶联和氧化条件按下述的使用时。
当单体为式Ⅱ的亚膦酸3′-亚甲基酯时，在新戊酰氯(121mM)存在下，在吡啶-乙腈(1∶1体积比，200μl)中，载体用化合物H(60mM)于吡啶-乙腈(1∶1体积比，200μl)的溶液处理2次，每次30分钟，即所说的2×30分钟。进行另外的洗涤步骤，重复该循环，除去5′位保护基和新单体偶联(或化合物H或3′-H-膦酸盐)到生长的低聚核苷酸链的游离5′位羟基上。
重复这些步骤，一直到全长15链节的前体制成低聚核苷酸类似物Ⅰ为止。
合成循环的各步骤可汇集表示如下步骤 试剂/溶剂 体积1-洗涤 二氯甲烷 4ml2-去保护2.5％(体积)二氯乙酸于二氯甲烷中4-5ml3-洗涤 二氯甲烷 4ml4-洗涤 吡啶-乙腈(1∶1体积比) 4ml5-偶联ⅰ)化合物H(60mM)于吡啶-乙腈(1∶1体积比，200μl)的溶液 400μl用新戊酰氯(121mM)在吡啶-乙腈(1∶1体积比，200μl)处理，并反应2×30分钟。
ⅱ)为未改性的核苷H-膦酸盐的单体 400μl(T)用新戊酰氯(182mM)在吡啶-乙腈 500μl(C)(1∶1体积比，200μl)处理并反应1分钟的在吡啶-乙腈中(1∶1体积比，200μl(对于Tp)，200μl+100μl吡啶(对于Cp)单体溶液(300mM(对Tp)，200mM(对Cp))。6-洗涤 吡啶-乙腈(1∶1体积比) 4ml7．用适合的单体重复步骤1-6，一直到得到低聚核苷酸类似物的低聚核苷酸前体为止。进行单体加入的最初一个循环以后，在室温下，在吡啶-水(8∶2体积比)中，用碘(0.2M)处理载体上的低聚物1小时，任选随后用碘(0.2M)、吡啶-三乙胺-水(6∶1∶1体积比)在室温下再处理1小时。这样使核苷间键氧化。然后用吡啶-乙腈(1∶1体积比)洗涤载体，除去微量碘，随后用乙醚洗涤。然后将载体空气干燥，转移到塑料管中，在55℃下用氨水(30％)处理过夜。这样从载体上除去低聚核苷酸类似物，分裂碱保护基，同时原封不动留下5′-O-二甲氧基三苯甲基。这一处理后，按照标准步骤，将低聚核苷酸类似物溶液在低聚核苷酸纯化柱上除去5′-O-二甲氧基三苯甲基(评价和分离合成的低聚核苷酸，应用生物系统，1992)。然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，按标准的步骤纯化低聚核苷酸类似物。
低聚核苷酸类似物Ⅰ的MALDI-TOF质谱分析计算质量4424.3Da测量值4423.8Da实施例2低聚核苷酸类似物25′TTT T*TC TCT CTC TCT3′式中，*为式Ⅰ的核苷间键，其中X为硫，R1为羟基。所有其他核苷间键为硫代磷酸酯。上述低聚核苷酸的固体相合成使用上述实施例1的方法进行，一直到最后的单体加入循环。用硫化反应代替实施例1中使用的用碘处理低聚物。因此，在最后的偶联步骤后，按照A.Audrus和G.Zon，核酸研究讨论会文集No.20,1988,121的步骤，在室温下用硫(5％(重量/体积))在二硫化碳-吡啶-三乙胺(10∶10∶1体积比，2ml)中的溶液处理载体上的前体1-18小时，生成低聚核苷酸类似物2。在完成培育期后，用吡啶-乙腈(1∶1体积比)和乙醚洗涤载体，然后空气干燥。如实施例1描述的，从载体上除去低聚核苷酸类似物和除去保护基。
低聚核苷酸2的MALDI-TOF(负方式)质谱分析计算质量4649.3Da
测量值4642.8Da实施例3低聚核苷酸35′TTT T*TMeC TCT CTC TCT3′式中，*为式Ⅰ的核苷间键，其中X为氧，R1为羟基。所有其他的核苷间键为磷酸二酯。Tme为在2′位存在α-甲氧基而不是氢原子的胸苷残基。按实施例1所述的进行上述低聚核苷酸的固相合成，直到核苷残基11。在这里，在新戊酰氯(182mM)于吡啶-乙腈(1∶1体积比，200μl)中存在下，用5′-二甲氧基三苯甲基-2′-O-甲基胸苷H-膦酸盐(30mM)于吡啶-乙腈(1∶1体积比，200μl)的溶液处理载体上的前体1分钟，生成低聚核苷酸类似物3。合成的其余部分按实施例1所述的进行。
低聚核苷酸类似物3的MALDI-TOF(负方式)质谱分析计算的质量4454.4Da测量值4448.6Da实施例4低聚核苷酸类似物45′TTT T*TMeC TCT CTC TCT3′式中，*为式Ⅰ的核苷间键，其中X为硫，R1为羟基。所有其他的核苷键合为硫代磷酸酯。Tme为在2′位有α-甲氧基而不是氢的胸苷残基。按实施例3所述进行固相合成，而硫代和随后的吸收和去封按上述实施例2中所述的进行。
低聚核苷酸类似物4的MALDI-TOF(负方式)质谱分析计算质量4679.3Da测量值4664.1Da实施例5低聚核苷酸类似物55′TTT*TT3′
式中，*为式Ⅰ的核苷间键，其中X为氧，R1为羟基。所有其他核苷间键为磷酸二酯键合。
用实施例1的步骤进行这一制备，不同的是化合物H和化合物Tp是仅使用的核苷单体。
MALDI-TOF质谱分析计算的质量1457.1Da测量值1457.7Da实施例6低聚核苷酸类似物65′TTT TT*C TCT CTC TCT 3′式中，*为式Ⅰ的核苷间键，其中X为氧，R1为羟基。所有其他的核苷间键都为磷酸二酯键合。
用实施例1的一般步骤进行这一制备。
实施例7低聚核苷酸类似物75′T*T*T*T*T*C TCT CTC TCT 3′式中，*为式Ⅰ的核苷间键，其中X为氧，R1为羟基。所有其他核苷间键都为磷酸二酯键合。
用实施例1的一般步骤进行这一制备，但由化合物H引入5个核苷残基。
实施例8低聚核苷酸类似物85′CGA CTA TGC AT*T T*TC 3′式中，*为式Ⅰ的核苷间键，其中X为氧，R1为羟基。所有其他的核苷间键都为磷酸二酯键合。
用实施例1的一般步骤进行这一制备，但由化合物H引入两个核苷残基。当序列要求使用A或G核苷时，那么实施例1方法的偶联步骤改变如下ⅰ)用新戊酰氯(182mM)在吡啶-乙腈(1∶1体积比，200μl)处理，在吡啶-乙腈(1∶1体积比，200μl(对于Ap或Gp))中的30mM Ap或30mM Gp，并反应1小时。
低聚核苷酸类似物8的MALDI-TOF质谱分析计算的质量4514.1Da测量值4517.3Da实施例9低聚核苷酸类似物95′GCG T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*GC G 3′式中，*为式Ⅰ的核苷间键，其中X为氧，R1为羟基。所有其他的键合都为磷酸二酯键合。
用实施例1和8的一般步骤进行这一制备，但由化合物H引入10个核苷残基。
实施例10低聚核苷酸类似物105′TT T TT*C*TCT CTC TCT 3′式中，*为式Ⅰ的核苷间键，其中X为氧，R1为羟基。所有其他的键合都为磷酸二酯键合。
用实施例1的一般步骤进行这一制备，不同的是，当C*残基要引入时，单体化合物J用来直接代替化合物H。
实施例11低聚核苷酸类似物115′TTT TTT TTT TTT TTT T*T*T*T3′式中，*为式Ⅰ的核苷间键，其中X为氧，R1为羟基。所有其他的键合都为磷酸二酯键合。
用实施例1的一般步骤进行这一制备，但由化合物H引入3个核苷残基。
实施例12低聚核苷酸类似物125′T*T*C*T*C*G CCC GCT CC*T*C*C*T*C*C 3′式中，*为式Ⅰ的核苷间键，其中X为硫，R1为羟基。所有其他的键合都为硫代磷酸酯。
用实施例2的一般步骤进行这一制备。如实施例8中所述引入G残基，而如实施例10所述引入C*残基。
实施例13低聚核苷酸类似物135′T*T*C*T*C*G CTG GTG AGT*T*T*C*A 3′式中，*为式Ⅰ的核苷间键，其中X为硫，R1为羟基。所有其他键合都为硫代磷酸酯。
用实施例12的一般步骤进行这一制备。如实施例8中所述引入A残基。
实施例14如在“低聚核苷酸和类似物，一种实施方法”，F.Eckstein编辑，IRL出版，1991中所述，用固相亚氨膦酸酯低聚核苷酸合成法制备有序列5′TTT tTC TCT CTC TCT 3′的低聚核苷酸类似物1，其中t为由化合物M得到的核苷单元，不同的是，在合成中的适宜点，用化合物M代替一般的3′-亚氨膦酸酯取代的核苷，以致生成有式ⅩⅣ核苷间键的低聚核苷酸前体，其中R1a为-OCH2CH2CN，然后在标准的氧化步骤中氧化成有式ⅩⅤ核苷间键的低聚核苷酸，其中R1a为-OCH2CH2CN和X为氧，这一低聚核苷酸进一步偶联得到低聚核苷酸类似物1。
权利要求
1．一种有10-200个天然的和/或合成的核苷单元的低聚核苷酸类似物，核苷单元通过核苷间键连接，其中至少一个核苷间键为下式
式中，所示的亚甲基连接到核苷的3′位碳原子上，所示的氧原子连接到相邻核苷的5′位碳原子上，R1为氢、羟基、O-、硫醇基、S-、-NH2或式R1a、-OR1a、-SR1a、-NHR1b或-NR1bR1c中的一个基团，其中R1a为未取代的或取代的C1-C10烷基、C2-C10链烯基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基或C7-C13芳烷基，R1b和R1c各自独立为未取代的或取代的C1-C10烷基、C2-C10链烯基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基或C7-C13芳烷基，或R1b和R1c与连接在上面的氮原子一起构成5元或6元杂环，以及X为氧或硫。
2．根据权利要求1的低聚核苷酸类似物，其中它有15-40个核苷单元。
3．根据权利要求1的低聚核苷酸类似物，其中它有15-25个核苷单元。
4．根据权利要求1、2或3的低聚核苷酸类似物，其中所有的核苷间键都为式Ⅰ。
5．根据权利要求1、2或3的低聚核苷酸类似物，其中至多75％的核苷间键为式Ⅰ。
6．根据权利要求5的低聚核苷酸类似物，其中至多50％的核苷间键为式Ⅰ。
7．根据权利要求6的低聚核苷酸类似物，其中至多25％的核苷间键为式Ⅰ。
8．根据上述权利要求中任一项的低聚核苷酸类似物，其中至少两个连续的核苷间键为式Ⅰ。
9．根据权利要求1-7中任一项的低聚核苷酸类似物，其中式Ⅰ的核苷间键用其他核苷间键交替。
10．根据权利要求1-3和5-9中任一项的低聚核苷酸类似物，其中其余的核苷间键为磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键合或其两个或两个以上的混合物。
11．根据权利要求10的低聚核苷酸类似物，其中其余的核苷间键为硫代磷酸酯键合。
12．根据权利要求10或11的低聚核苷酸类似物，其中在有式Ⅰ的核苷间键或有它与硫代磷酸酯或磷酸二酯键合混合物的两个区域之间含有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯核苷间键的区域。
13．根据上述权利要求中任一项的低聚核苷酸类似物，其中至少一个核苷在其2′位被改性。
14．根据权利要求13的低聚核苷酸类似物，其中至少一个核苷在2′位有卤素原子或式-OR2的基团，其中R2为C1-C10脂族基团。
15．根据权利要求14的低聚核苷酸类似物，其中至少一个核苷在2′位有基团-OR2，其中R2为未取代的或取代的C1-C10烷基。
16．根据权利要求15的低聚核苷酸类似物，其中R2为C1-C4烷基、C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基或式-(CH2CH2O)-nR3基团，其中R3为甲基或乙基，n为2-4。
17．根据权利要求16的低聚核苷酸类似物，其中R2为甲基、乙基、甲氧基乙基、乙氧基乙基或式-(CH2CH2O)-3CH3的基团。
18．根据权利要求13-17中任一项的低聚核苷酸类似物，其中至少两个连续的核苷在2′位被改性，并通过磷酸二酯核苷间键连接和/或在2′位未改性的核苷和在2′位改性的核苷的5′位碳原子之间有式Ⅰ的键合。
19．根据上述权利要求中任一项的低聚核苷酸类似物，其中R1a、R1b或R1c作为烷基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基是未取代的或被羟基、C1-C4烷氧基、卤素、氰基、三(C1-C15烃基)甲硅烷基或伯、仲或叔氨基取代的。
20．根据上述权利要求中任一项的低聚核苷酸类似物，其中R1为氢、羟基、O-、SH、S-、未取代的或取代的C1-C4烷基或苯基、-OR1a的基团，其中R1a为未取代的或取代的的C1-C4烷基、C3-C5链烯基、C5-C8环烷基或C7-C9芳烷基或式-SR1a的基团，其中R1a为未取代的或取代的的C1-C4烷基或苯基。
21．根据权利要求20的低聚核苷酸类似物，其中R1为氢、羟基、O-、SH、S-、甲氧基、乙氧基或2-氰基乙基。
22．根据上述权利要求中任-项的低聚核苷酸类似物，其中它与人体C-raf激酶的mRNA区域是互补的。
23．根据权利要求22的低聚核苷酸类似物，其中核苷序列为
24．根据权利要求1-21中任一项的低聚核苷酸类似物，其中它与人体PKC-α的mRNA区域是互补的。
25．根据权利要求24的低聚核苷酸类似物，其中核苷序列为
26．一种制备有至少一种式Ⅰ的核苷间键的低聚核苷酸类似物的方法
式中，R1和X规定如上，该法包括(ⅰ)在(A)有5′位羟基的天然或合成核苷或低聚核苷酸和(B)在3′位有能与所述的5′位羟基反应的基团的天然或合成核苷或二聚核苷酸之间进行偶联反应或顺序偶联反应，一直到得到有所需核苷数目的低聚核苷酸为止，其中至少一个所述的偶联反应中为下式的核苷(B)在位阻的有机酰卤或酸酐存在下与(A)反应，
式中，B1为核苷碱基团，R4为羟基保护基，R5为氢、羟基或2′位改性原子或基团，M+为金属或未取代的或取代的铵离子或杂环碱的阳离子，X为氧或硫，生成有下式亚膦酸酯核苷间键的低聚核苷酸类似物，
式中，X为氧或硫，以及(ⅱ)(a)亚膦酸酯键合氧化，或(b)亚膦酸酯键合硫化，或(c)亚膦酸酯键合与式R1aY的化合物反应，其中R1a如权利要求1规定的，Y为离去原子或基团，或(d)亚膦酸酯键合与式R1aOH的醇或式R1bNH2或R1bR1cNH的胺氧化和反应，其中R1a、R1b、和R1c如权利要求1规定的，或(e)亚膦酸酯键合甲硅烷化以及甲硅烷化的键合与硫代烷基化剂或硫代芳基化剂反应，生成式Ⅰ的亚膦酸酯键合，其中R1为SR1a，其中R1a如权利要求1规定的。
27．根据权利要求26的方法，其中低聚核苷酸类似物进一步反应，用氢代替保护基R4，或在R4为低聚核苷酸类似物中的末端核苷的场合下，用5′位改性基团代替保护基R4。
28．根据权利要求26或27的方法，其中包括按权利要求26中所述与连接到固体载体上的核苷或低聚核苷酸(A)进行顺序偶联反应(ⅰ)和步骤(ⅱ)，然后(ⅲ)从固体载体上分离低聚核苷酸，并除去保护基，得到有末端5′位游离羟基的低聚核苷酸，以及(ⅳ)任选使5′位游离羟基反应，在末端5′位引入改性基团。
29．根据权利要求26、27或28的方法，其中在式Ⅱ中，B1为嘧啶碱，R4为甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基或三叔丁基三苯甲基，R5为氢，M+为未取代的铵、一、二或三C1-C10烷基-或羟烷基-铵离子，或者杂环碱的阳离子。
30．根据权利要求26-29中任一项的方法，其中式Ⅱ的核苷为下式的立体异构体
式中，B1、R4、R5、X和M+如权利要求26规定的。
31．根据权利要求26-30中任一项的方法，其中式Ⅱ核苷与A在位阻的有机酰卤存在下的偶联反应在环中有叔氮原子的杂环碱或其氧化物存在下进行。
32．根据权利要求26-31中任一项的方法，其中氧化(ⅱ)(a)通过用碘和水或用叔丁基氢过氧化物处理来实现。
33．根据权利要求26-31中任一项的方法，其中硫化(ⅱ)(b)通过在叔胺存在下，在有机溶剂中用硫处理来实现。
34．根据权利要求26-31中任一项的方法，其中式1A的亚膦酸酯核苷间键与式R1aY化合物的反应(ⅱ)(c)在强碱存在下进行，其中R1a为权利要求1中规定的烷基、环烷基或芳烷基，Y为卤素。
35．根据权利要求26-31中任一项的方法，其中式1A的键合与式R1aY化合物的反应(ⅱ)(c)在钯催化剂存在下进行，其中R1a为链烯基或芳基卤化物或三氟甲磺酸酯。
36．根据权利要求26-31中任一项的方法，其中式1A的亚膦酸酯核苷间键与式R1aOH醇的氧化反应(ⅱ)(d)通过在醇R1aOH和碱存在下与氧化剂的反应来进行。
37．根据权利要求36的方法，其中氧化剂为碘、四氯化碳或-溴三氯甲烷，而碱为吡啶。
38．根据权利要求26-31中任一项的方法，其中式1A的亚膦酸酯核苷间键与式R1bNH2或R1bR1cNH(其中R1b和R1c如权利要求1规定的)和四氯化碳或-溴三氯甲烷或碘进行氧化反应(ⅱ)(d)，得到本发明低聚核苷酸类似物，其中R1分别为-NHR1b或-NR1bR1c。
39．根据权利要求26-31中任一项的方法，其中式1A的亚膦酸酯键合的反应(ⅱ)(e)通过以下步骤进行键合用三烷基甲硅烷基卤和碱甲硅烷基化，然后甲硅烷基化的键合与硫代烷基化剂或硫代芳基化剂反应。
40．根据权利要求39的方法，其中硫代烷基化剂或硫代芳基化剂为式ArSO2SR1a的硫代磺酸酯，其中R1a为权利要求1规定的，Ar为芳基。
41．根据权利要求26-40中任一项的方法，其中当在固体载体上合成出有所需数目核苷的低聚核苷酸类似物时，在处理除去羟基保护基团前后，用浓氨水处理，将它从固体载体上分离。
42．根据权利要求26-40中任一项的方法，其中羟基保护基团通过用有机酸水溶液处理来除去。
43．根据权利要求26-42中任一项的方法，其中式Ⅱ的核苷用下式的二核苷酸代替，
式中，B1、R1、R4和R5为权利要求26规定的，B2为核苷碱基团，R6为氢、羟基或2′位改性原子或基团，R7为能与核苷中5′位羟基反应的或活化反应的基团。
44．根据权利要求43的方法，其中式Ⅷ中的R7O为H-膦酸盐基、亚氨膦酸酯基或磷酸二酯基。
45．一种下式的二核苷酸
式中，B1、B2、R1、R4为权利要求43规定的，R5和R6为权利要求43规定的，不同的是，在R1不为氢的场合下，R5和R6中至少一个为2′位改性原子或基团，R9为权利要求43中规定的R7或羟基保护基团。
46．一种含有权利要求1-25中任一项的低聚核苷酸或权利要求45的二核苷酸作为有效成分的药物组合物。
47．一种治疗病毒或蛋白质调控的疾病的方法，该法包括给疗需要的哺乳动物服用权利要求1-25中任一项的低聚核苷酸或权利要求45的二核苷酸。
全文摘要
一种有10—200个天然的和/或合成的核苷单元的低聚核苷酸类似物,核苷单元通过核苷间键连接,其中至少一个核苷间键为右式。式中,所示的亚甲基连接到核苷的3′位碳原子上,所示的氧原子连接到相邻核苷的5′位碳原子上,R
文档编号A61P35/00GK1212701SQ9719276
公开日1999年3月31日 申请日期1997年2月24日 优先权日1996年3月5日
发明者A·D·巴克斯特, S·P·科林伍德, M·E·道格拉斯, R·J·泰勒 申请人:诺瓦提斯公司