专利名称：丝氨酸蛋白酶抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有炔基氨基侧链的丝氨酸蛋白酶抑制剂，含有它的药物组合物，以及所述的抑制剂生产用于治疗和防止与凝血酶相关的疾病的药剂的应用。
丝氨酸蛋白酶除了别的作用之外，主要是在凝血级联(cascade)中起重要作用。这组蛋白酶的成员是例如凝血酶、胰蛋白酶、凝血因子Ⅶa、Ⅸa、Ⅹa、Ⅺa、Ⅻa和C蛋白。
凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，它调节凝血级联的最后步骤。凝血酶的基本功能是切割血纤蛋白原，产生血纤蛋白单体，后者通过交联，形成不溶性的凝胶。此外，凝血酶通过在级联的早期活化凝血因子Ⅴ和Ⅷ来调节凝血酶自身的生产。它在细胞水平也具有重要的作用，在细胞水平，它作用于特定的受体，造成血小板凝集，内皮细胞活化和成纤维细胞增生。因此凝血酶在血停滞和血栓形成中具有中心调节作用。由于凝血酶抑制剂具有广泛的治疗应用，在此领域已进行了详尽的研究。
在丝氨酶蛋白酶，特别是凝血酶的合成抑制剂的开发中，对那些以类似于天然底物方式被蛋白水解酶识别的小的合成肽的兴趣再增加。结果，制备出新的肽样抑制剂，如凝血酶的转换状态抑制剂。
对更有效、更有选择性的凝血酶抑制剂的研究有增无减，为的是获得可以以更低剂量给药且具有更少和更轻的副作用的凝血酶抑制剂。再者，对口服生物利用度给予了特别的关注。潜在的静脉内凝血酶抑制剂在需要治疗与凝血酶相关的疾病的急性护理背景方面是临床有效的。然而，特别是在防止与凝血酶相关的疾病如心肌梗死、血栓形成和中风，需要长期的治疗，优选通过口服抗凝剂。
大多数在现有公开文献中公开的肽样凝血酶抑制剂含有精氨酸侧链。凝血酶抑制剂也可以含有代替精氨酸的赖氨酸侧链，如抑制剂N-Me-D-Cha-Pro-Lys-COOH及其衍生物，由Jones等公开于《酶抑制杂志》，9(1995),43-60，和抑制剂N-Me-D-Phe-Pro-Lys-X,X是羧酰胺或羧酸，由Lewis等公开于《血栓形成与血停滞》，74(4)(1995),1107-12。此外，Brady等，《生物有机与医学化学》,3(1995),1063-78，描述了D-Phe-Pro-Lys-酮酯。其它的凝血酶抑制剂公开于WO 94/25051，其中赖氨酸或精氨酸侧链用氨基环己基部分代替。已知的含有精氨酸和赖氨酸的凝血酶抑制剂的问题在于它们具有低的口服生物利用度。
现已发现，式Ⅰ的具有炔基氨基侧链的丝氨酸蛋白酶抑制剂，特别是凝血酶、Ⅹa和Ⅶa抑制剂，或其前药或其可药用盐是潜在选择性抑制剂
其中A是H、任选取代的D,Lα-羟基乙酰基、R1、R1-O-C(O)-、R1-C(O)-、R1-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-、H2NCO-(CHR2)m-、或N-保护基团，其中R1选自(1-12C)烷基、(2-12C)链烯基、(2-12C)炔基和(3-8C)环烷基，这些基团可任选由(3-8C)环烷基、(1-6C)烷氧基、氧代、OH、COOH、CF3或卤素取代，和选自(6-14C)芳基、(7-15C)芳烷基和(8-16C)芳链烯基，它们中的芳基可以任选由(1-6C)烷基、(3-8C)环烷基、(1-6C)烷氧基、OH、COOH、CF3或卤素取代；每个基团R2独立地是H或具有与R1相同的含意；m是1、2或3；B是一个键，式-NH-CH[(CH2)pC(O)OH]-C(O)-的氨基酸或其酯衍生物且p是0、1、2或3,-N((1-12C)烷基)-CH2-CO-、-N((2-12C)链烯基)-CH2-CO-、-N((2-12C)炔基)-CH2-CO-、-N(苄基)-CH2-CO-、D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Piq、D-3-Piq或具有疏水、碱性或中性侧链的L-或D-氨基酸，这些氨基酸可以任选是N-(1-6C)烷基取代的；或A与B一起是残基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中R3和R4独立地是R1、R1-O-C(O)-、R1-C(O)-、R1-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-、H2NCO-(CHR2)m-、或N-保护基团，或R3和R4之一与R5相连与它们键合的“N-C”一起形成5-或6-元环，这些环可以与脂族或芳族6-元环稠合；且R5是疏水、碱性或中性侧链；X是带有疏水侧链的L-氨基酸、丝氨酸、苏氨酸、任选含有另外的选自N、O或S的杂原子和任选由(1-6C)烷基、(1-6C)烷氧基、苄氧基或氧代取代的环状氨基酸，或X是-NR2-CH2-C(O)-或片断
其中n是2、3或4，且W是CH或N；Y是H、-CHF2、-CF3、-CO-NH-(1-6C)亚烷基-C6H5、-COOR6且R6是H或(1-6C)烷基、-CONR7R8且R7和R8独立地是H或(1-6C)烷基或R7和R8一起是(3-6C)亚烷基，或Y是选自下列的杂环2-噻唑、2-噻唑啉、2-苯并噻唑、2-噁唑、2-噁唑啉和2-苯并噁唑，这些杂环可任选由(1-6C)烷基、苯基、(1-6C)烷氧基、苄氧基或氧代取代；且r是0、1、2或3。
此外，一些本发明化合物在口服给药后，显示出良好的生物利用度。
本发明化合物可用于治疗和预防凝血酶介导和与凝血酶相关的疾病。这些疾病包括许多凝血级联被活化的血栓形成和前血栓形成病症，这些病症包括但不限于，深处静脉血栓形成、肺栓塞、血栓性静脉炎、血栓形成或栓塞造成的动脉闭塞、在血管成形术或血栓溶解期间或之后的动脉再闭塞、动脉损伤或侵害性心脏病学操作后的再狭窄、术后静脉血栓形成或栓塞、急性或慢性动脉粥样硬化、中风、心肌梗死、癌症和转移瘤、以及神经变性疾病。本发明化合物也可以在体外血液循环中，如果需要在透析和手术中用作抗凝血剂。本发明化合物也可以用作体外抗凝血剂。
优选的本发明化合物具有式Ⅰ，其中X是带有疏水侧链的L-氨基酸、丝氨酸、苏氨酸或-NR2-CH2-C(O)-。
其它优选的式Ⅰ化合物是这样的化合物，其中A如前面所定义；B是一个键，式-NH-CH[(CH2)pC(O)OH]-C(O)-的氨基酸或其酯衍生物且p是0、1、2或3,-N((1-6C)烷基)-CH2-CO-、-N((2-6C)链烯基)-CH2-CO-、-N(苄基)-CH2-CO-、D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Piq、D-3-Piq或具有疏水侧链的D-氨基酸，这些氨基酸可以任选是N-(1-6C)烷基取代的；或A与B一起是残基R3R4N-CHR5-C(O)-；X是任选含有另外的选自N、O或S的杂原子和任选由(1-6C)烷基、(1-6C)烷氧基、苄氧基或氧代取代的环状氨基酸，或X是-NR2-CH2-C(O)-或片断
更优选的是式Ⅰ化合物，其中A是H、2-羟基-3-环己基-丙酰基-、9-羟基-芴-9-羧基、R1、R1-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-、H2NCO-(CHR2)m-、或N-保护基团，其中R1选自(1-12C)烷基、(2-12C)链烯基、(6-14C)芳基、(7-15C)芳烷基和(8-16C)芳链烯基；每个基团R2独立地是H或具有与R1相同的含意；B是一个键，D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Piq、D-3-Piq或具有疏水侧链的D-氨基酸，这些氨基酸可以任选是N-(1-6C)烷基取代的；或A与B一起是残基R3R4N-CHR5-C(O)-；Y是-CO-NH-(1-6C)亚烷基-C6H5、-COOR6、-CONR7R8，或Y是选自下列的杂环2-噻唑、2-噻唑啉、2-苯并噻唑、2-噁唑、2-噁唑啉和2-苯并噁唑。
特别优选是式Ⅰ化合物，其中A是H、R1-SO2-或R2OOC-(CHR2)m-；B是一个键，D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Piq、D-3-Piq或具有疏水侧链的D-氨基酸；或A与B一起是残基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中至少R3和R4之一是R2OOC-(CHR2)m-或R1-SO2-，另一个独立地是(1-12C)烷基、(2-12C)链烯基、(2-12C)炔基、(3-8C)环烷基、(7-15C)芳烷基、R1-SO2-或R2OOC-(CHR2)m-，且R5是疏水侧链；Y是-CO-NH-(1-6C)亚烷基-C6H5、-COOR6且R6是H或(1-3C)烷基、-CONR7R8,R7和R8独立地是H或(1-3C)烷基或R7和R8一起是(3-5C)亚烷基，或Y是选自下列的杂环2-噻唑、2-苯并噻唑、2-噁唑或2-苯并噁唑。
当A是R2OOC-(CHR2)m-时，优选B是具有疏水侧链的D-氨基酸；或A与B一起是残基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中至少R3和R4之一是R2OOC-(CHR2)m-，且另一个独立地是(1-12C)烷基、(2-6C)链烯基、(3-8C)环烷基、苄基、R1-SO2-或R2OOC-(CHR2)m-；和X是2-氮杂环丁烷羧酸、脯氨酸、2-哌啶酸、4-噻唑烷羧酸、3,4-脱氢-脯氨酸、2-八氢吲哚羧酸或-[N(3-8C)环烷基]-CH2-C(O)-。最优选的是这样的化合物，其中A是HOOC-CH2-；B是D-Phe、D-Cha、D-Coa、D-Dpa、p-Cl-D-Phe、p-OMethyl-D-Phe、p-OEthyl-D-Phe、D-Nle、m-Cl-D-Phe、3,4-二-OMe-D-Phe、D-Chg；或A与B一起是残基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中至少R3和R4之一是HOOC-CH2-，另一个独立地是(1-4C)烷基、(1-4C)烷基-SO2-或HOOC-CH2-，且R5是(3-8C)环烷基、(3-8C)环烷基(1-4C)烷基、苯基、苄基、任选由氯或(1-4C)烷氧基取代。特别优选的是这样的化合物，其中Y是选自下列的杂环2-噻唑、2-苯并噻唑、2-噁唑或2-苯并噁唑。
当A是R1-SO2-时，优选B是一个键、D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Piq、D-3-Piq或具有疏水侧链的D-氨基酸；或A与B一起是残基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中至少R3和R4之一是R1-SO2-，另一个独立地是(1-12C)烷基或R1-SO2-；X是2-氮杂环丁烷羧酸、脯氨酸、2-哌啶酸、4-噻唑烷羧酸、3,4-脱氢-脯氨酸、2-八氢吲哚羧酸或-[N(环戊基)]-CH2-C(O)-或片断
更优选的是这样的化合物，其中A是乙基-SO2-或苄基-SO2-；B是一个键、D-Phe、D-Cha、D-Coa、D-Dpa、p-Cl-D-Phe、p-OMethyl-D-Phe、p-OEthyl-D-Phe、D-Nle、m-Cl-D-Phe、3,4-二-OMe-D-Phe、D-Chg；或A与B一起是残基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中至少R3和R4之一是乙基-SO2-或苄基-SO2-，另一个独立地是(1-12C)烷基或R1-SO2-，且R5是(3-8C)环烷基、(3-8C)环烷基(1-4C)烷基、苯基、苄基、二苯基次甲基，这些基团任选由氯或(1-4C)烷氧基取代。最优选的是这样的化合物，其中Y是-CO-NH-CH2-C6H5、-CO-NH-CH2CH2-C6H5或-CONR7R8,R7和R8独立地是H或(1-3C)烷基或R7和R8一起是(3-5C)亚烷基，或Y是选自下列的杂环2-噻唑、2-苯并噻唑、2-噁唑或2-苯并噁唑。
最优选地，式Ⅰ化合物中r是1。
在部分A的定义中定义的N-保护基团是任何的用于肽的N-保护基团。适合的N-保护基团可见于T.W.Green和P.G.M wuts:《有机合成中的保护基团》，第二版(Wiley,纽约，1991)和《肽、分析、合成、生物学》，第3卷，E.Gross和J.Meienhofer编(Academic Press,纽约，1981)。
“任选取代的D,Lα-羟基乙酰基”一词是指式HO-CRaRb-C(O)-的基团，其中Ra和Rb独立地是H、疏水侧链，或Ra和Rb一起形成5-或6-元环，它任选与一或二个脂族或芳族6-元环稠合，且此5-或6-元环由碳原子和任选一个选自N、O和S的杂原子组成。优选的D,Lα-羟基乙酰基基团是2-羟基-3-环己基-丙酰基-和9-羟基-芴-9-羧基。
“(1-12C)烷基”一词是指具有1至12个碳原子的支链或未支链化的烷基，如甲基、乙基、叔丁基、异戊基、庚基、十二烷基等。优选的烷基是(1-6C)烷基，具有1-6个碳原子。更优选的是(1-4C)烷基。在R6、R7和R8中的定义中最优选的是(1-3C)烷基，具有1-3个碳原子，如甲基、乙基、异丙基。
(2-12C)链烯基是具有2-12个碳原子的支链或未支链化的不饱和烃基。优选的是(2-6C)链烯基。实例是乙烯基、丙烯基、烯丙基等。
“(1-6C)亚烷基”一词是指具有1到6个碳原子的支链或未支链化的亚烷基，如-(CH2)m-且m是1至6、-CH(CH3)-、-CH(CH3)-(CH2)-等。在Y的定义中的优选的亚烷基是亚乙基和亚甲基。
(2-12C)炔基是含有一个叁键和具有2至12个碳原子的支链或未支链化的烃基。优选的是(2-6C)炔基，如乙炔基和丙炔基。
(6-14C)芳基是6-14个碳原子的芳族部分。芳基可以进一步含有一或多个杂原子，如N、S或O。芳基的实例是苯基、萘基、(异)喹啉基、2,3-二氢化茚基等。最优选的是苯基。
(7-15C)芳烷基和(8-16C)芳链烯基是烷基和链烯基分别被一或多个芳基取代，碳原子的总数分别为7-15和8-16。
“(1-6C)烷氧基”一词是指具有1-6个碳原子的烷氧基，其烷基部分具有前面定义的含义。
“(3-8C)环烷基”一词是指具有3-8个碳原子的环烷基，为环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基。环戊基和环己基是优选的环烷基。
“卤素”一词是指氟、氯、溴或碘。
“酯衍生物”一词是指任何适宜的酯衍生物，优选是(1-4C)烷基酯、如甲基-、乙基-或叔丁基酯。
1-和3-Tiq分别是指1,2,3,4-四氢异喹啉-1-或-3-羧酸；1-和3-Piq分别是指1-和3-羧基全氢化异喹啉；Atc是2-氨基-1,2,3,4-四氢化萘-2-羧酸；Aic是氨基-1,2-二氢化茚-羧酸；Phe是苯丙氨酸；Cha是环己基丙氨酸；Dpa是二苯基丙氨酸；Coa是环辛基丙氨酸；Chg是环己基甘氨酸；Nle是正亮氨酸；Asp是天冬氨酸。
“疏水侧链”一词是指(1-12C)烷基，任选由一或多个(3-8C)环烷基或(6-14C)芳基(它可以含有杂原子，例如氮)如环乙基、环辛基、苯基、吡啶基、萘基、四氢化萘基等取代，这些疏水侧链可任选由取代基如卤素、三氟甲基、低级烷基(例如甲基或乙基)、低级烷氧基(例如甲氧基)、苯氧基、苄氧基等取代。
在定义中，“取代的”一词是指由一或多个取代基取代。
具有碱性侧链的氨基酸是例如，但不限于，精氨酸和赖氨酸，优选是精氨酸。“具有中性侧链的氨基酸”是指氨基酸如具有2-甲基磺酰基-乙基侧链的氨基酸(methionine sulphon)等。
环状氨基酸是例如2-氮杂环丁烷羧酸、脯氨酸、2-哌啶酸、1-氨基-1-羧基-(3-8C)环烷(优选4C、5C或6C)、4-哌啶羧酸、4-噻唑烷羧酸、3,4-脱氢-脯氨酸、氮杂脯氨酸、2-八氢吲哚羧酸等。优选的是2-氮杂环丁烷羧酸、脯氨酸、2-哌啶酸、4-噻唑烷羧酸、3,4-脱氢-脯氨酸和2-八氢吲哚羧酸。“前药”一词是其中式Ⅰ化合物的炔基氨基侧链被保护的化合物，例如被羟基、(1-6C)烷氧基或(1-6C)烷氧基羰基保护。
本发明还涉及制备式Ⅰ化合物的方法，包括偶合适合地被保护的氨基酸或氨基酸类似物，接着去除保护基团。
式Ⅰ化合物可以用常规用于这些化合物的方式制备。具有炔基氨基侧链的修饰的氨基酸以类似于对其它氨基酸已知的方法的方式引入。
为此目的，在溶液中或固体载体上，将适合的Nα保护的(和侧链保护的，如果反应性侧链存在)氨基酸衍生物或肽活化和偶合到适合的羧基保护的氨基酸或肽衍生物上。α-氨基官能团通常是通过氨基甲酸乙酯官能团如酸不稳定的叔丁氧基羰基(Boc)、苄氧羰基(Z)和取代的类似物或碱不稳定的9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)基团来发生。Z基团也可以通过催化氢化来去除。其它适合的氨基保护性基团包括Nps、Bmv、Bpoc、Msc等。氨基保护性基团的全面的综述给出在《肽、分析、合成、生物学》第3卷，E.Gross和J.Meienhofer编(Academic Press，纽约，1981)。羧基的保护可以通过酯的形成来保护，例如碱不稳定的酯，象甲基-或乙基酯、酸不稳定的酯象叔丁基酯，或氢解不稳定的酯如苄基酯。炔基氨基侧链的保护可以用上文提到的基团来实现。适合地保护的氨基酸或肽的羧基的活化可以用叠氮化物、混合酐、活性酯或碳化二亚胺方法来发生，特别是加入催化和外消旋抑制化合物，如1-羟基苯并三唑、N-羟基琥珀酰亚胺、3-羟基-4-氧代-3,4-二氢-1,2,3-苯并三嗪、N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺。参见，例如《肽、分析、合成、生物学》(参见上文)和Pure and Applied Chem.59(3),331-334(1987)。
本发明化合物，它可以是游离碱形式，可以以可药用盐的形式，由反应混合物分离。可药用盐也可以通过用有机或无机酸如氢氯酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、马来酸、丙二酸、甲磺酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸和抗坏血酸处理式Ⅰ的游离碱来获得。
本发明化合物具有一或多个手性碳原子，因此可以获得其纯对映体，或对映体混合物，或含有非对映体的混合物。获得纯对映体的方法是本领域已知的，例如由旋光酸或外消旋混合物获得的盐的结晶，或使用手性柱色谱。对于非对映体可以使用正相或反相柱。
本发明化合物可以经肠或不经肠给药，且优选给药于人，每日剂量0.001-100mg/kg体重，优选0.01-10mg/kg体重。与可药用的辅助剂混合，例如如标准参考文献中所描述的，Gennaro等，Remington’sPharmaceutical Science,(第18版，Mack Publishing Company,1990，参见特别是第8部分，Pharmaceutical Preparations and TheirManufacture)，化合物可以压制成固体剂量单位，如丸剂、片剂，或配制成胶囊或栓剂。借助于可药用的液体，化合物也可以以溶液、悬浮液、乳液的形式施用，例如用作注射制剂，或作为喷雾剂，例如用作鼻喷雾剂。
制作剂量单位，例如片剂时，考虑使用常规的添加剂如填料、着色剂、聚合物粘合剂等。通常可以使用不干扰活性化合物功能的可药用添加剂。可与组合物一起给药的适合的载体包括乳糖、淀粉、纤维素衍生物等，或其混合物，以适合量使用。
本发明用下列实施例进一步说明。实施例“-赖氨炔基ψ[COCO]-OH、-赖氨炔基-OMe和-赖氨炔基-(2-噻唑基)”是指下式的残基
其中Y=分别是COOH、OCH3和2-噻唑基。Azt=2-氮杂环丁烷羧酸；Boc=叔丁氧基羰基；Cbz=苄氧羰基；Bzl=苄基。实施例1HOOC-CH2-D-Cha-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)(a)1-氨基-4-氯-2-丁炔盐酸盐将1,4-二氯-2-丁炔(73.8g)溶解于氯仿(600ml)中。加入六胺(84.0g)，反应混合物回流加热2.5小时，之后在5℃下冷却24小时。滤出六胺配合物(220g)。将配合物的乙醇(1l)溶液与浓盐酸(180ml)一起在室温下搅拌24小时。滤出沉淀出的氯化铵，将滤液真空浓缩，直到晶体初现。之后加入乙醚，沉淀出1-氨基-4-氯-2-丁炔的盐酸盐。由乙醇/乙醚重结晶，给出1-氨基-4-氯-2-丁炔盐酸盐(59.75g)。
TLC:Rf=0.60,硅胶，二氯甲烷/甲醇/水70/30/5 v/v/v。(b)1-乙酰基氨基-4-氯-2-丁炔将1-氨基-4-氯-2-丁炔盐酸盐(59.75g)溶解于10％乙酸钠的水溶液(335ml)中。加入乙酸乙酯(500ml)，在室温下滴加入乙酸酐(70ml)。加入25％的乙酸钠水溶液至pH5，并将此溶液在室温下搅拌30分钟。分离开乙酸乙酯层，水层用乙酸乙酯萃取二次。合并的有机层用水、盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并真空蒸发，产生1-乙酰基氨基-4-氯-2-丁炔，如黄色浆(58.8g)。
TLC:Rf=0.99，硅胶，二氯甲烷/甲醇/水70/30/5 v/v/v。(c)乙酰氨基(4-乙酰氨基-2-丁炔基)-丙二酸二乙酯向氢化钠(60％矿物油分散液，3.48g)的二噁烷(70ml)的冷(0℃)溶液滴加入无水乙醇(70ml)。让混合物升温至室温，滴加入乙酰氨基丙二酸二乙酯(20.5g)的二噁烷(70ml)溶液。加入碘化钠(9.07g)，并在室温下滴加1-乙酰基氨基-4-氯-2-丁炔(11g)的二噁烷(140ml)溶液。加入另外的100ml乙醇后，混合物回流2.5小时。将反应混合物冷却，滤出形成的沉淀物。使用硅胶色谱(洗脱液乙酸乙酯/甲醇9/1 v/v)纯化，产生乙酰氨基(4-乙酰氨基-2-丁炔基)-丙二酸二乙酯(15.9g)。
TLC:Rf=0.25,硅胶，乙酸乙酯。(d)2,6-二氨基-4-己炔酸二盐酸盐(H-赖氨炔酸二盐酸盐)将乙酰氨基(4-乙酰氨基-2-丁炔基)-丙二酸二乙酯(7.64g)溶解于乙酸(140ml)和6M盐酸溶液(290ml)的混合物中，并在95℃下加热过夜。真空浓缩混合物。残留物用乙醇/水结晶，产生2,6-二氨基-4-己炔酸二盐酸，为晶状粉末(4.0g)。(e)Boc-赖氨炔基(Cbz)-OH
将五水硫酸铜(Ⅱ)(287mg)加入到2,6-二氨基-4-己炔酸二盐酸盐(500mg)的17ml二噁烷/水3/2v/v溶液中，pH通过加入2M氢氧化钠溶液调节到9。在室温下，与2M氢氧化钠溶液一起，滴加在二噁烷(10ml)中的N-(苄氧基羰氧基)-琥珀酰亚胺(573mg)，保持pH在9-9.5左右。加毕，将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物过滤，并将由此获得的沉淀物悬浮于二噁烷(20ml)中。加入二碳酸二叔丁基酯(500mg),pH通过加入4M氢氧化钠溶液调节到12-13。反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物过滤，滤液用水稀释。加入4M盐酸溶液，直到pH2，水层用二氯甲烷萃取二次。合并的有机相用水洗涤，经硫酸钠干燥，蒸发去除溶剂，产生Boc-赖氨炔基(Cbz)-OH(540mg)。
TLC:Rf=0.70，硅胶，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水63/20/6/11 v/v/v/v。(f)Boc-赖氨炔基(Cbz)-NMeOMe将N,O-二甲基-羟胺盐酸盐(363mg)和[2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基尿鎓四氟硼酸盐](1.2g)加入到Boc-赖氨炔基(Cbz)-OH(1.4g)的二氯甲烷(50ml)溶液中，pH通过加入N,N-二异丙基乙胺调节到pH9-10。反应混合物在室温下搅拌1小时。将混合物依次用冷的2M盐酸溶液、水、5％碳酸氢钠水溶液和水洗涤。有机层经硫酸钠干燥，过滤并蒸发。残留物用硅胶色谱纯化(洗脱液乙酸乙酯/庚烷3/2 v/v)，产生Boc-赖氨炔基(Cbz)-NMeOMe(1.37g)。
TLC:Rf=0.70，硅胶，乙酸乙酯/庚烷4/1 v/v。(g)Boc-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)将2-溴噻唑(1.78g)的乙醚(10ml)溶液滴加入正丁基锂(10.9mmol)的乙醚(10.9ml)的冷(-78℃)的搅拌着的溶液中。在溶液在-78℃搅拌30分钟后，缓慢加入Boc-赖氨炔基(Cbz)-NMeOMe(1.37g)的无水四氢呋喃(15ml)溶液。混合物在-78℃搅拌1小时，之后加入5％的碳酸氢钠水溶液。让混合物升温至室温，将不同的层分离。水层用乙醚萃取。合并的有机层用水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发。残留物用硅胶色谱(洗脱液乙酸乙酯/庚烷1/1 v/v)纯化，产生Boc-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)(1.21g)。
TLC:Rf=0.72,硅胶，乙酸乙酯/庚烷3/1 v/v。(h)H-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA将Boc-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)(1.21g)溶解于三氟乙酸(TFA)/二氯甲烷(15ml；1/1 v/v)，并在室温下搅拌1小时。粗制的胺在蒸发去除溶剂之后分离，定量产生黄色的油状物，即刻用于制备N-Boc-N-(叔丁氧羰基甲基-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)。
TLC:Rf=0.25,硅胶，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水63/20/6/11 v/v/v/v。(i)H-D-Cha-OMe.HCl向冷(-20℃)无水甲醇(195ml)中滴加入亚硫酰氯(28ml)。加入H-D-Cha-OH.HCl(40g)，反应混合物回流加热5小时。反应混合物真空浓缩，与甲醇共蒸发(3次)。残留物用甲醇/乙醚结晶，产生H-D-Cha-OMe.HCl，为白色晶状粉末(40.9g)。
TLC:Rf=0.66,硅胶，正丁醇/乙酸/水10/1/3 v/v/v。(j)N-(叔丁氧基羰基甲基)-D-Cha-OMe将溴代乙酸叔丁基酯(36g)加入到搅拌着的H-D-Cha-OMe.HCl(40.9g)的400ml乙腈溶液中。混合物的pH用N,N-二异丙基乙胺调节至8.5。混合物在室温下搅拌16小时，真空蒸发。残留物溶解于二氯甲烷中，溶液用水洗涤，用硫酸钠干燥，真空蒸发。在硅胶上用庚烷/乙酸乙酯9/1(v/v)作洗脱液色谱，给出64g N-(叔丁氧羰基甲基)-D-Cha-OMe。
TLC:Rf=0.25,硅胶，乙酸乙酯/庚烷1/1 v/v。(k)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-OMe将N-(叔丁氧羰基甲基)-D-Cha-OMe(64g)和二碳酸二叔丁基酯(40.3g)的N,N-二甲基甲酰胺(500ml)溶液的pH用N,N-二异丙基乙胺调节到8.5。混合物在室温下搅拌16小时。真空去除溶剂。向残留物加入二氯甲烷和水。将有机层分开，用冷1N盐酸、水、5％碳酸氢钠和水洗涤。有机层用硫酸钠干燥，蒸发滤液成非晶形固体状的N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-OMe，产量59.6g。
TLC:Rf=0.50,硅胶，二氯甲烷/庚烷1/1 v/v。(l)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-OH将N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-OMe(59.6g)的900ml二噁烷/水9/1(v/v)溶液用足够量的6N氢氧化钠处理，保持其pH为12在室温下6小时。酸化后，混合物倒入水中，并用二氯甲烷萃取。有机层用水洗涤，用硫酸钠干燥。滤液蒸发，产生54g N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-OH。
TLC:Rf=0.60,硅胶，二氯甲烷/甲醇9/1 v/v。(m)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-OSu.
将N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-OH(12.5g)的200ml乙腈溶液用N-羟基琥珀酰亚胺(4.1g)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(6.84g)在室温下处理过夜。反应混合物蒸发至于，残留物溶解于乙酸乙酯中。有机相用水洗涤，经硫酸钠干燥，浓缩，给出活性酯，它直接用于下一步骤。(n)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-OH将H-Pro-OH.HCl(7.5g)溶解于100ml水中。反应混合物的pH用1N氢氧化钠溶液调节到8，之后滴加溶解于100ml N,N-二甲基甲酰胺中的N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-OSu。反应在室温下在pH约8下搅拌过夜。将反应混合物冷却，用1N盐酸调节至pH约2。水层用乙酸乙酯萃取。有机相用水洗涤，经硫酸钠干燥，并真空蒸发。硅胶纯化，使用梯度液乙酸乙酯/甲醇9/1→1/1(v/v)，给出11.0g所需二肽。
TLC:Rf=0.81,硅胶，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水163/20/6/11 v/v/v/v。(o)N-Boc-N-(叔丁氧羰基甲基)-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)将N-Boc-N-(叔丁氧羰基甲基)-D-Cha-Pro-OH(1.31g)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(15ml)中。加毕三乙胺(750μl)，反应混合物放置于氮气，冷却到-15℃。随后加入氯甲酸异丁基酯(352μl)，将混合物在-15℃下搅拌15分钟。将H-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(1.15g)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(10ml)中，滴加入冷的混合酐溶液，通过加入三乙胺保持pH在8.5。反应混合物在-15℃下搅拌30分钟。将反应混合物蒸发至干。残留物溶解于乙酸乙酯中，依次用水、5％碳酸氢钠水溶液、水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，并真空浓缩。残留物在硅胶上色谱(洗脱液二氯甲烷/甲醇95/5 v/v)纯化，产生N-Boc-N-(叔丁氧羰基甲基)-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)(1.77g)。(p)HOOC-CH2-D-Cha-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)将N-Boc-N-(叔丁氧羰基甲基)-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)(1.77g)在室温下用三氟乙酸/茴香硫醚10/1 v/v(20ml)处理4小时。反应混合物真空浓缩，残留物溶解于水中。用乙醚彻底洗涤水相。水层直接装填到制备HPLC Supelcosil LC-18-BD柱上，使用20％A/70％B/10％C至20％A/50％B/30％C梯度洗脱体系，历时45分钟，流速20ml/min。(A:0.5M磷酸缓冲液pH2.1，B水，C乙腈/水3/2 v/v)。
产生二种非对映体。*300mg.Massa:ESI+:518.5[AH]+；259.8[AH2]2+Rt(LC):28.81分钟；20％A/80％B至20％A/20％B/60％C，经40分钟*500mg.Massa:ESI+:518.5[AH]+；259.8[AH2]2+Rt(LC):29.88分钟；20％A/80％B至20％A/20％B/60％C，经40分钟实施例2N-Me-D-Phe-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH(a)Boc-赖氨炔基(Cbz)-OMe将[2-(1H-苯并三唑)-1,1,3,3-四甲基尿鎓四氟硼酸盐](1.83g)加入到Boc-赖氨炔基(Cbz)-OH(2.15g)在二氯甲烷∶甲醇9∶1混合物(25ml)的溶液中，pH通过加入N,N-二异丙基乙胺调节至7-8。反应混合物室温下搅拌1小时。混合物用1N盐酸、水、5％碳酸氢钠溶液和水洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。残留物在硅胶上用乙酸乙酯/庚烷6/4v/v作洗脱液进行色谱纯化。产量2.17g。
Rf=0.5,硅胶，乙酸乙酯/庚烷3/1 v/v。(b)2-乙酰氧基-3-(叔丁氧羰基氨基)-7-(苄氧基羰基氨基)-庚-5-炔-腈在-78℃下，向搅拌着的2g Boc-赖氨炔基-OMe的60ml二氯甲烷溶液加入18.2ml预冷却的二异丁基铝氢化物(1.0M的己烷液)溶液，加入的速度要使温度保持低于-70℃。溶液搅拌半小时。将混合物倒入柠檬酸的水溶液中，用二氯甲烷萃取。合并的萃取液用水、5％碳酸氢钠溶液和水洗涤，用无水硫酸钠干燥，并过滤。滤液真空浓缩，产生2.25g油。粗制的产物溶解于25ml二氯甲烷中。将溶液冷却到0℃，加入0.31g苄基三乙基氯化铵、1.2ml乙酸酐和2.5g氰化钠的75ml水溶液。混合物在0-5℃下剧烈搅拌30分钟。分离出有机层，用水洗涤两次，用无水硫酸钠干燥，蒸发至干。残留物在硅胶上用庚烷∶乙酸乙酯8∶2(v/v)作洗脱液进行色谱纯化，给出1.4g 2-乙酰氧基-3-(叔丁氧羰基氨基)-7-(苄氧羰基氨基)-庚-5-炔-腈。
Rf=0.6,硅胶，庚烷/乙酸乙酯1/1 v/v。(c)H-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH在-20℃下，将6.5g气态氯化氢导入1.4g 2-乙酰氧基-3-(丁氧羰基氨基)-7-(苄氧羰基氨基)-庚-5-炔-腈在乙醚/甲醇9/1 v/v混合物的溶液中。混合物在0-4℃下搅拌过液。之后将混合物冷却到-20℃，加入6.75ml水。反应混合物在20℃下搅拌4小时。分离出有机层。水相的pH用1N氢氧化钠调节至10，接着用1-丁醇萃取。合并的萃取液用盐水洗涤，真空浓缩，给出650mg H-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH。
Rf=0.17,乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水63/20/6/11 v/v/v/v。(d)N-Boc-N-Me-D-Phe-OH将商品化的H-N-Me-D-Phe-OH(11g)溶解于二噁烷/水1/2(165ml)混合物中，接着添加二碳酸二叔丁基酯(19.1g)。反应混合物的pH用氢氧化钠作为碱保持在8.5-9。接着，反应混合物真空浓缩，残留物溶解于乙酸乙酯中。有机相用0.1N盐酸和饱和氯化钠洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，并蒸发到干，给出17.1g产物。
TLC:Rf=0.35,硅胶，二氯甲烷/甲醇8/2 v/v。(e)N-Boc-N-Me-D-Phe-Pro-OH根据针对N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-OBzl合成(参见实施例1)描述的步骤偶合N-Boc-N-Me-D-Phe-OH(17.1g)和H-Pro-OMe.HCl(10.1g)。获得的二肽，N-Boc-N-Me-D-Phe-Pro-OMe(22.6g)，溶解于二噁烷/水9/1(200ml)中，在室温下用4N氢氧化钠(21.7ml)处理过液。反应混合物用300ml冰水稀释，用4N盐酸酸化(pH2)，用二氯甲烷萃取。合并的有机层用饱和氯化钠洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干，给出粗制产物。用乙醚/庚烷2/3 v/v结晶，给出纯的N-Boc-N-Me-D-Phe-Pro-OH(12.6g)。
TLC:Rf=0.20,硅胶，甲苯/乙酸乙酯6/4 v/v。(f)N-Boc-N-Me-D-Phe-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH在-20℃下，将氯甲酸异丁基酯(0.101g)加入到N-Boc-N-Me-D-Phe-Pro-OH(0.195g)的N,N-二甲基甲酰胺(10ml)溶液中，用三乙胺将混合物pH调节至8。在-20℃下，将pH用三乙胺调节至8.5的H-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH(0.3g)的N,N-二甲基甲酰胺(10ml)溶液加入到反应混合物中。混合物搅拌过夜。反应未完成，因此将N-Boc-N-Me-D-Phe-Pro-OH(293mg)的N,N-二甲基甲酰胺(5ml)溶液在0℃下用N-羟基琥珀酰亚胺(95mg)和1,3-二环己基碳化二亚胺在pH8.5下处理，并加入到反应混合物中。混合物在室温下搅拌4小时。真空去除挥发物。残留物溶解于二氯甲烷中。溶液用水洗涤，用硫酸钠干燥，蒸发至干。残留物在硅胶上用乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水63/5/1.5/2.75 v/v/v/v作洗脱液进行色谱分离。
将级分合在一处，给出0.26g N-Boc-N-Me-D-Phe-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH。
Rf=0.24,用乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水63/5/1.5/2.75 v/v/v/v于硅胶上。(g)N-Boc-N-Me-D-Phe-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-OH将N-Boc-N-Me-D-Phe-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH(260mg)的20ml二氯甲烷溶液用1,1,1-三乙酰氧基-1,1-二氢-1,2-benziodoxol-3(1H)-酮(180mg)处理。混合物在室温下搅拌3个半小时，用硫代硫酸钠溶液和水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，蒸发至干，给出0.35gN-Boc-N-Me-D-Phe-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-OH，与试剂的一些降解产物一起。
Rf=0.36，用乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水63/20/6/11 v/v/v/v于硅胶上。(h)N-Me-D-Phe-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH将N-Boc-N-Me-D-Phe-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-OH(0.3g)的三氟乙酸/茴香硫醚10/1 v/v(10ml)混合物中的溶液在室温下搅拌4小时。反应混合物真空浓缩，溶解于水中，用乙醚洗涤。残留物真空干燥，给出430mg粗制的N-Me-D-Phe-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH，它在制备HPLC Supelcosil LC-18-DB柱上纯化，使用A20％；B80％；C0％至A20％；B70％；C10％梯度洗脱体系，历时45分钟，流速20ml/min。
产生二种非对映体。*53.7mg；MS:FAB+429.1[M+H]；FAB-426.9[M-H]Rt(LC):15.25分钟；A:20％；B:80％；C:0％至A:20％；B:20％；C60％，经40分钟*51.6mg；MS:FAB 429.1[M+H]；FAB-426.8[M-H]Rt(LC):16.30分钟；A:20％；B:80％；C:0％至A:20％；B:20％；C60％，经40分钟实施例3N-Me-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH(a)N-Me-N-Boc-D-Cha-Pro-OH与实施例2(e)中描述的步骤相同，由N-Me-N-Boc-D-Cha-OH和H-Pro-OMe.HCl为原料，制备出N-Me-N-Boc-D-Cha-Pro-OH。
TLC:Rf=0.26，硅胶，乙酸乙酯/甲醇4/1 v/v。(b)Boc-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe将2-乙酰氧基-3-(叔丁氧羰基氨基)-7-(苄氧羰基氨基)-庚-5-炔-腈(36g)的乙醚/甲醇3/1 v/v(1l)溶液冷却到-20℃。向溶液中通入气态氯化氢，直到浓度达到3M(109g)，之后将混合物在0-4℃搅拌过夜。加入水(170ml)，加入速度使温度＜5℃。接着，让反应混合物升温，在室温下再搅拌5小时。分离出有机相。水层的pH用稀氢氧化钠调节到10，接着用1-丁醇萃取。合并的萃取液用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，并蒸发至干，给出H-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe(58g)。向H-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe(58g)的甲醇溶液中加入二碳酸二叔丁基酯(18.4g),pH通过加入三乙胺调节至8。反应混合物在室温下搅拌。反应完毕后，将之真空浓缩。残留物溶解于乙酸乙酯中，用0.1N盐酸溶液和盐水洗涤。有机层经硫酸镁干燥，过滤和蒸发。残留物在硅胶上(洗脱液庚烷/乙酸乙酯7/3 v/v，至乙酸乙酯至乙酸乙酯/甲醇8/2 v/v的梯度)色谱纯化。将级分合在一处，给出4.76g Boc-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe。
TLC:Rf=0.40，硅胶，二氯甲烷/甲醇9/1 v/v。
另外，分离出一副产物，经鉴定为Boc-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OBu(0.94g)。
TLC:Rf=0.47，硅胶，二氯甲烷/甲醇9/1 v/v。(c)H-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe.TFA根据实施例1h中描述的方法，将Boc-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe(500mg)转化成标题化合物(500mg)，即刻用于偶合。
TLC:Rf=0.12，硅胶，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(d)N-Me-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe向N-Me-N-Boc-D-Cha-Pro-OH(546mg)的N,N-二甲基甲酰胺(10ml)的冷(0℃)溶液中依次加入1-羟基苯并三唑(202mg)，二环己基碳化二亚胺(308mg)和H-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe.TFA(516mg)，之后将溶液的pH用三乙胺调节到8。反应混合物在0下搅拌1小时，保持在室温下过夜。将混合物冷却到-20℃，通过过滤去除二环己基脲。滤液蒸发到干。残留物溶解于乙酸乙酯中，用1N盐酸、水、5％碳酸氢钠和水依次洗涤，经硫酸钠干燥，并真空浓缩。残留物在硅胶上用庚烷/乙酸乙酯1/1→1/4(v/v)作洗脱液进行色谱分离。将含有N-Me-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe级分合并，蒸发。产量544mg。
TLC:Rf=0.39，硅胶，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(e)N-Me-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH将N-Me-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe(544mg)溶解于二噁烷/水7/3(v/v)(13ml)中，用2N氢氧化钠溶液(0.61ml)在室温下处理1小时。反应混合物用水(30ml)稀释，加入2N盐酸溶液，直到pH2，水层用二氯甲烷萃取。合并的有机相用水、盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，给出所需的产物。产量560mg。
TLC:Rf=0.47，硅胶，二氯甲烷/甲醇4/1 v/v。(f)N-Me-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-OH将N-Me-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH(500mg)溶解于2.3ml的1-羟基-1,2-benziodoxol-3(1H)-酮1-氧化物的二甲基亚砜的0.5M溶液，在室温过夜搅拌。反应混合物用硫代硫酸钠(1.25g)的150ml水的溶液骤止，用冰浴冷却，之后溶液的pH用2N盐酸调节到2。水层用二氯甲烷萃取，合并的有机层用饱和的氯化钠溶液洗涤。有机相经硫酸钠干燥，过滤，并真空蒸发，给出粗制的N-Me-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-OH。
TLC:Rf=0.71，硅胶，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水88/31/18/7 v/v/v/v。(g)N-Me-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH将粗制的N-Me-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-OH在与实施例2h中描述的相同的条件下处理，在HPLC纯化后，给出175mg纯的N-Me-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH，为非对映体混合物。
Rt(LC):22.19和22.83分钟，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C，经40分钟。实施例43,3-二苯基丙酰基-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH(a)3,3-二苯基丙酰基-脯氨酰基-OH与实施例2e中描述的步骤相同，使用3,3-二苯基丙酸(5.0g)和H-Pro-OMe.HCl(3.66g)，制备出3,3-二苯基丙酰基-脯氨酰基-OH(5.2g)TLC:Rf=0.65，硅胶，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水63/20/6/11 v/v/v/v。(b)3,3-二苯基丙酰基-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe与实施例3中描述的步骤相同，将3,3-二苯基丙酰基-脯氨酰基-OH(648mg)与H-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe.TFA(722mg)偶合，纯化后，给出被保护的三肽3,3-二苯基丙酰基-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe(1.13g)。
TLC:Rf=0.40，硅胶，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(c)3,3-二苯基丙酰基-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH与实施例3(e)中描述的步骤相同，将3,3-二苯基丙酰基-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe(860mg)皂化。与实施例2g中描述的一样，粗制的产物在二氯甲烷(80ml)中使用1,1,1-三乙酰氧基-1,1-二氢-1,2-benziodoxol-3(1H)-酮(594mg)氧化。随后在TFA和茴香硫醚中脱保护(实施例2h)，给出3,3-二苯基丙酰基-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH(229mg)，为非对映体混合物。
Rt(LC):20.31分钟，20％A,60％B和20％C至20％A,80％C，经30分钟。实施例5苄基SO2-正Leu(环)-Gly-赖氨炔基ψ[COCO]-OH正Leu(环)-Glv是指下式的结构片断
(a)N-Boc-L-α-氨基-ε-己内酰胺向搅拌着的(10g)的二噁烷/水(2/1 v/v)(30ml)的溶液中加入1N氢氧化钠溶液(7.8ml)，接着加入二碳酸二叔丁基酯(18.8g)，将混合物在室温下搅拌16小时，并真空浓缩。残留物溶解于乙酸乙酯中，用水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并真空蒸发。粗制的物质用己烷研磨，过滤，并真空干燥，产生N-Boc-L-α-氨基-ε-己内酰胺(16g)。
TLC:Rf=0.85,硅胶，乙酸乙酯/庚烷1/1 v/v。(b)Boc-正Leu(环)-Gly-OMe将N-Boc-L-α-氨基-ε-己内酰胺(10g)溶解于二氯甲烷(100ml)中。在-20℃下，缓慢加入双(三甲基甲硅烷基)酰胺在四氢呋喃/环己烷(1/1 v/v)中的1M溶液(1当量)，并将混合物搅拌30分钟。随后加入溴乙酸甲酯(4ml)，并将混合物在室温下搅拌2小时。加入另一份双(三甲基甲硅烷基)酰胺在四氢呋喃/环己烷(1/1 v/v)中的溶液，迫使反应完毕。混合物用二氯甲烷稀释，用0.1N盐酸溶液、水、5％碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并真空蒸发。残留物在硅胶上(洗脱液庚烷/乙酸乙酯/6/4v/v)色谱纯化，产生N-Boc-正Leu(环)-Gly-OMe(12g)。
TLC:Rf=0.55，硅胶，乙酸乙酯/庚烷6/4 v/v。(c)苄基SO2-正Leu(环)-Gly-OMe将N-Boc-正Leu(环)-Gly-OMe(5.4g)溶解于50％TFA/二氯甲烷1/1(v/v)(40ml)中，并在室温下搅拌1小时。反应混合物真空蒸发。粗制的胺溶解于二氯甲烷(40ml)中，冷却(0℃)，并加入苄基磺酰氯(3.43g)。加入三乙胺，在反应期间保持pH为8。混合物在室温下搅拌1小时，之后将混合物真空浓缩。将残留物溶解于乙酸乙酯中，用5％碳酸氢钠溶液、水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，并真空蒸发，产生苄基SO2-正Leu(环)-Gly-OMe(6.1g)。
TLC:Rf=0.88，硅胶，二氯甲烷/甲醇9/1 v/v。(d)苄基SO2-正Leu(环)-Glv-OH将苄基SO2-正Leu(环)-Gly-OMe(6.1g)的100ml二噁烷/水9/1的溶液用足够量的1N氢氧化钠处理，在室温下保持pH在13持续2小时。酸化后，混合物倒入水中，用二氯甲烷萃取。有机层用水洗涤，经硫酸钠干燥。过滤，接着蒸发溶剂，给出所需的化合物(6.3g)。
TLC:Rf=0.73,硅胶，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水63/20/6/11 v/v/v/v。(e)苄基SO2-正Leu(环)-Gly-赖氨炔基ψ[COCO]-OH与实施例3中描述的步骤相同，以苄基SO2-正Leu(环)-Gly-OH(385mg)和H-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe.TFA(520mg)为原料制备出标题化合物。将被保护的三肽(625mg)皂化，氧化和去保护(参见实施例4)，在HPLC纯化后，给出苄基SO2-正Leu(环)-Gly-赖氨炔基ψ[COCO]-OH(68mg)，为非对映体混合物。
Rt(LC):25.9分钟，20％A,80％B至20％A,20％B和80％C，经40分钟。实施例6乙基SO2-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OMe(a)Boc-D-Cha-Pro-OPac(-OPac=苯乙酮酯)类似于实施例2中描述的方法，使用Boc-D-Cha-OH和H-Pro-OPac，制备Boc-D-Cha-Pro-OPac。
TLC:Rf=0.5,硅胶，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(b)乙基SO2-D-Cha-Pro-OPac将Boc-D-Cha-Pro-OPac(3.8g)溶解于50％TFA/二氯甲烷(25ml)中，并在室温下搅拌30分钟。将反应混合物真空蒸发。粗制的胺溶解于二氯甲烷(50ml)中，并在-78℃下加入乙磺酰氯(0.8ml)。在反应期间，加入三乙胺，保持pH在8。在0℃下，将混合物搅拌3小时，之后加入水(25ml)。在室温下另外搅拌30分钟之后，反应混合物真空浓缩。残留物溶解于乙醚中，用1N盐酸溶液、水、5％碳酸氢钠溶液和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并真空蒸发。用甲醇研磨粗制的物质，产生乙基SO2-D-Cha-Pro-OPac(3.0g)。
TLC:Rf=0.6，硅胶，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(c)乙基SO2-D-Cha-Pro-OH向乙基SO2-D-Cha-Pro-OPac(10g)的四氢呋喃(250ml)溶液中加入四丁基氟化铵在四氢呋喃(84ml)中的1M溶液。反应混合物在室温下搅拌30分钟，并倒入水(1l)中。水溶液用乙酸乙酯萃取。合并的有机层依次用1N盐酸溶液和水洗涤，经硫酸钠干燥，并真空浓缩。残留物用乙酸乙酯/二异丙醚结晶来纯化，产生乙基SO2-D-Cha-Pro-OH(6.0g)。
TLC:Rf=0.2，硅胶，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水163/20/6/11 v/v/v/v。(d)乙基SO2-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OMe如实施例3(d)所述，偶合乙基SO2-D-Cha-Pro-OH(515mg)和H-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe.TFA，给出被保护的三肽(550mg)。氧化，接着脱保护(参见实施例2)，在HPLC纯化后，给出所需的产物(130mg)，为非对映体混合物。
Rt(LC):38.2分钟和38.5分钟，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C，经40分钟。实施例7乙基SO2-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH类似于实施例6，制备出乙基SO2-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[CHOHCO]-OMe(550mg)。随后根据实施例3和2中所述的方法，皂化，氧化和脱保护，在HPLC纯化后，给出180mg乙基SO2-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH(非对映体混合物)。
Rt(LC):35.7分钟和36.0分钟，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C。实施例81-Piq-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH(a)2-Cbz-(4aR,8aR)-全氢异喹啉-1(R,S)-羧酸(=N-(Cbz)-1-Piq-OH)如EP 0643073，实施例1所述，合成出N-(Cbz)-1-Piq-OH。
TLC:Rf=0.85，硅胶，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水63/30/6/11 v/v/v/v。(b)N-(Cbz)-1-Piq-Pro-OH根据实施例2中所述的方法，偶合N-(Cbz)-1-Piq-OH(500mg)和H-Pro-OtBu(270mg)，产生N-(Cbz)-1-Piq-Pro-OtBu(634mg)。在二氯甲烷(1ml)、三氟乙酸(3ml)、苯甲醚(0.15ml)的混合物中在室温下1小时来完成此叔丁基酯的去除。反应混合物在低温下真空浓缩，残留物溶解于pH为9.5的水中。水相用乙醚洗涤，之后水相用2M盐酸溶液酸化至pH2.5。水层用乙酸乙酯萃取，有机相用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，真空浓缩，产生N-(Cbz)-1-Piq-Pro-OH(588mg)。
TLC:Rf=0.54，硅胶，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水60/3/1/2 v/v/v/v。(c)1-Piq-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH根据实施例3所述的方法偶合N-(Cbz)-1-Piq-Pro-OH(478mg)和赖氨炔基部分。将纯化的保护三肽(667mg)皂化、氧化和脱保护(参见实施例2)，在HPLC纯化后，给出1-Piq-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH(33mg)的单异构体。
Rt(LC):20.08分钟，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C。实施例9HOOC-CH2-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH类似于实施例3所述的方法，将685mgN-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-OH(参见实施例1)偶合到H-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe.TFA(参见实施例3c)，之后将被保护的三肽(658mg)皂化、氧化、脱保护和纯化，产生158mg HOOC-CH2-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH，为非对映体混合物。
Rt(LC):22.3分钟，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C。实施例10HOOC-CH2-D-Cha-N-环戊基-Gly-赖氨炔基ψ[COCO]-OH(a)N-环戊基-Gly-OMe将H-Gly-OMe.HCl(46.4g)溶解于400ml甲醇中，加入环戊酮(34g)和氰基硼氢钠(14g)，让反应在室温下进行16小时。反应混合物用6M盐酸骤止直到pH2，并在室温下搅拌30分钟。减压蒸发去除溶剂，残留物溶解于水中，用乙醚洗涤。pH通过加入6M氢氧化钠溶液调节到pH＞10，产物用二氯甲烷萃取，用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。化合物用乙酸乙酯结晶成HCl盐。产量43.5g。
TLC:Rf=0.71，硅胶，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水88/31/18/7 v/v/v/v。(b)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-N-环戊基-Gly-OH根据实施例1中对二肽部分描述的步骤，使用N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-OH和N-环戊基-Gly-OMe，制备出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-N-环戊基-Gly-OH。
TLC:Rf=0.30，硅胶，二氯甲烷/甲醇9/1 v/v。(c)HOOC-CH2-D-Cha-N-环戊基-Glv-赖氨炔基ψ[COCO]-OH按实施例3所述的方法，将N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-N-环戊基-Gly-OH(547mg)偶合到H-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe.TFA(参见实施例3c)，之后将被保护的三肽(660mg)皂化、氧化、脱保护和纯化，产生212mg HOOC-CH2-D-Cha-N-环戊基-Gly-赖氨炔基ψ[COCO]-OH，为非对映体混合物。Rt(LC):28.5和29.1分钟，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C。实施例11HOOC-CH2-D-Phe-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH根据实施例19所述方法，使用N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Phe-OH和H-Pro-OBzl.HCl，制备出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Phe-Pro-OH。
TLC:Rf=0.63，硅胶，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水664/31/18/7 v/v/v/v。HOOC-CH2-D-Phe-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH按实施例3所述的方法，将677mgN-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Phe-Pro-OH与H-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe.TFA偶合，之后将获得的三肽(814mg)皂化、氧化、脱保护和HPLC纯化，给出HOOC-CH2-D-Phe-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH(248mg)，为非对映体混合物。Rt(LC):16.1和17.0分钟，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C。实施例12HOOC-CH2-D-p-Cl-Phe-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH(a)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-OH根据实施例1中描述的类似步骤，将H-D-p-Cl-Phe-OH.HCl(10g)转化成N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-OH。产量16.7g。
TLC:Rf=0.27，硅胶，乙酸乙酯/甲醇9/1 v/v。(b)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-OSu(Su=琥珀酰亚胺)
将N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-OH(14.67g)的250ml乙腈溶液用N-羰基琥珀酰亚胺(4.11g)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(6.86g)在室温下处理过夜。将反应混合物蒸发至干，残留物溶解于乙酸乙酯中。有机相用水洗涤，经硫酸钠干燥，浓缩，给出19.11g活性酯，它直接用于下一步骤。(c)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-Pro-OH将H-Pro-OH.HCl(10.79g)溶解于100ml N,N-二甲基甲酰胺和100ml水中。反应混合物的pH用1N氢氧化钠溶液调节至8，之后滴加溶解于120ml N,N-二甲基甲酰胺中的N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-OSu(19.11g)。反应在室温下，pH约8下搅拌过夜。将反应混合物冷却，并用1N盐酸调节到pH约2。水层用二氯甲烷萃取。有机相用水洗涤，经硫酸钠干燥，并真空蒸发。硅胶纯化，使用梯度液乙酸乙酯/甲醇9/1→1/1，给出7.04g所需二肽。
TLC:Rf=0.24，硅胶，乙酸乙酯/甲醇8/2 v/v。(d)HOOC-CH2-D-p-Cl-Phe-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH按实施例3所述的方法，将N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-Pro-OH(500mg)与H-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe.TFA偶合，之后将获得的三肽(572mg)皂化、氧化、脱保护和通过HPLC纯化，给出HOOC-CH2-D-p-Cl-Phe-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH(129mg)，为非对映体混合物。
Rt(LC):22.3和23.1分钟，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C。实施例13HOOC-CH2-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-NH2如实施例1中的所述的方法制备出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-OH。如实施例3(b)中所述的方法制备出Boc-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OBu。(a)Boc-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH向Boc-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OBu(320mg)的二噁烷/水9/1v/v(11.2ml)的溶液中加入1ml 1N氢氧化钠溶液。反应混合物在室温下搅拌3小时。混合物通过加入1N盐酸溶液调节到pH7，且通过蒸发去除大多数的二噁烷。混合物倒入冷水中，用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并真空蒸发，产生308mg Boc-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH。
TLC:Rf=0.46，硅胶，二氯甲烷/甲醇8/2 v/v。(b)Boc-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-NH2将1-羟基-苯并三唑水合物(117mg)、N-甲基吗啉(132μl)、氯化铵(107mg)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(186mg)加入到Boc-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH(308mg)的N,N-二甲基甲酰胺(16.6ml)溶液中。反应混合物在室温下搅拌3小时。将混合物倒入水中，用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用1N盐酸溶液、水、5％碳酸氢钠溶液和水洗涤。有机层经硫酸镁干燥，过滤并蒸发。残留物在硅胶上(洗脱液二氯甲烷/甲醇98/2 v/v至96/4 v/v/的梯度液)色谱纯化，产生Boc-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-NH2(117mg)。
TLC:Rf=0.14，硅胶，二氯甲烷/甲醇97/3 v/v。(c)H-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-NH2.TFA如实施例1(h)所述，制备H-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-NH2.TFA(d)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-NH2在0℃下，将1-羟基-苯并三唑水合物(50mg)和二环己基碳化二亚胺(60mg)加入到N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-OH(119.6mg)的N,N-二甲基甲酰胺(2ml)溶液中。反应混合物在0℃下搅拌半小时。H-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-NH2.TFA(100mg)的N,N-二甲基甲酰胺(1ml)的溶液的pH用N,N-二异丙基乙胺调节至8，并将其加入冷溶液中。1小时后，让混合物升至室温并搅拌过夜。反应混合物冷却到-20℃，过滤，并将滤液减压浓缩。残留物溶解于乙酸乙酯中，用5％碳酸氢钠溶液、水、2％柠檬酸水溶液和盐水洗涤。有机层经硫酸镁干燥，过滤并蒸发。残留物在硅胶上(洗脱液二氯甲烷/甲醇97/3 v/v至95/5 v/v)色谱纯化，产生N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-NH2(93.5mg)。
TLC:Rf=0.34，硅胶，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(e)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-NH2如实施例2(g)中所述，制备N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-NH2。
混合物用硫代硫酸钠溶液、5％碳酸氢钠溶液和水洗涤。
TLC:Rf=0.38，硅胶，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(f)HOOC-CH2-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-NH2如实施例2(h)所述制备出HOOC-CH2-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-NH2。水层直接装填到制备HPLC DeltaPak柱，使用20％A,70％B,10％C至20％A,30％B,50％C的梯度洗脱体系，经40分钟，流速50ml/分钟。
(A:0.5M磷酸缓冲液pH2.1,B水，C乙腈/水=3/2v/v)87mg N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-NH2，产生35mgHOOC-CH2-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-NH2。
Massa:Cl+:478.4[M-H]+；Cl-:476.4[M-H]-；Rt(LC):21.10和21.41分钟(非对映体混合物)；20％A,80％B,0％C至20％A,20％B和60％C，经40分钟。实施例14HOOC-CH2-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OEt如实施例1中所述，制备出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-OH。如实施例3(b)所述，制备出Boc-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe。(a)H-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OEt.HCl在-20℃下，将Boc-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe(2.14g)溶解于在乙醇(100ml)中的3M盐酸溶液中。在反应混合物在室温下搅拌6小时之后，将其真空浓缩，给出H-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OEt.HCl(2.36g)。
TLC:Rf=0.17和Rf=0.25(非对映体混合物)，硅胶，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(b)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[COHCO]-OEt如实施例13(d)所述，由H-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OEt.HCl(2.40g)和N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-OH(2.38g)，但用三乙胺代替N,N-二异丙基乙胺，制备出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[COHCO]-OEt。粗制的产物在硅胶上(洗脱液庚烷/乙酸乙酯1/1 v/v至二氯甲烷/甲醇97/3 v/v至95/5 v/v的梯度)色谱纯化，产生N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[COHCO]-OEt(1.24g)。
TLC:Rf=0.5，硅胶，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(c)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-OEt如实施例13(e)所述，制备出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-OEt。
TLC:Rf=0.51，硅胶，二氯甲烷/甲醇97/3 v/v。(d)HOOC-CH2-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OEt如实施例13(f)所述制备出HOOC-CH2-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OEt。水层直接装填到制备HPLC DeltaPak柱，使用20％A,80％B,0％C至20％A,54％B,26％C的梯度洗脱体系，经45分钟，流速80ml/分钟。
(A:0.5M磷酸缓冲液pH 2.1,B水，C乙腈/水=3/2v/v)293mg N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-OEt，产生62mgHOOC-CH2-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OEt。
Massa:ESI+:507.9[MH]+Rt(LC):26.45和27.30分钟(非对映体混合物)20％A,80％B,0％C至20％A,20％B和60％C，经40分钟。实施例15HOOC-CH2-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-(1-氮杂环丁烷)如实施例1所述制备出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-OH。用类似于实施例13的方式，以Boc-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OBu为原料，制备出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-(1-氮杂环丁烷)。427mg N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-(1-氮杂环丁烷)脱保护(参见实施例13(f))，在HPLC纯化后，给出105mg产物。
HPLC条件DeltaPak柱，使用20％A,80％B,0％C至20％A,45％B,35％C的梯度洗脱体系，经45分钟，流速80ml/分钟。
(A:0.5M磷酸缓冲液pH 2.1,B水，C乙腈/水=3/2v/v)Massa:FAB+:518.3[M+H]+；FAB-:516.2[M+H]-；Rt(LC):26.24和26.70分钟(非对映体混合物)；20％A,80％B,0％C至20％A,20％B,60％C，经40分钟。实施例16HOOC-CH2-D-Cha-N-环戊基-Gly-赖氨炔基ψ[COCO]-(1-氮杂环丁烷)根据实施例1中的步骤制备N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-N-环戊基-甘氨酸。
类似于实施例15中描述的方式，制备N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-N-环戊基-Gly-赖氨炔基ψ[COCO]-(1-氮杂环丁烷)。401mg N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-环戊基-Gly-赖氨炔基ψ[COCO]-(1-氮杂环丁烷)脱保护，在HPLC纯化之后，给出107mg产物。
Massa:FAB+:546.2[M+H]-；FAB-:544.0[M+H]-；Rt(LC):35.85分钟20％A,80％B,0％C至20％A,20％B,60％C，经40分钟。实施例17HOOC-CH2-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-NHCH2Ph如实施例1中所述，制备出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-OH。如实施例3(c)所述，制备出H-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe。(a)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe
如实施例13(d)所述，由H-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe.TFA(1.09g)和N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-OH(1.18g)，制备出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe。粗制的产物在硅胶上(洗脱液庚烷/乙酸乙酯4/6v/v至3/7v/v)色谱纯化，产生N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe(0.99g)。
TLC:Rf=0.5，硅胶，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(b)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH向N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe(0.98g)在二噁烷/水9/1 v/v(20ml)混合物中的溶液中加入1ml 1N氢氧化钠溶液。混合物倒入冷水中，通过加入1N盐酸溶液调节至pH2，并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并真空蒸发，产生1.05g N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH。
TLC:Rf=0.4，硅胶，乙酸乙酯/甲醇7/3 v/v。(c)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-NHCH2Ph将1-羟基-苯并三唑水合物(150mg)、N-甲基吗啉(150μl)、苯胺(155μl)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(190mg)加入到N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH(502mg)的N,N-二甲基甲酰胺(16.6ml)溶液中。反应混合物在室温下搅拌17小时。将混合物倒入冷的1N盐酸溶液中，并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用水、5％碳酸氢钠溶液和水洗涤。有机层经硫酸镁干燥，过滤并蒸发，产生N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-NHCH2Ph(512.4mg)。
TLC:Rf=0.5，硅胶，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(d)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-NHCH2Ph如实施例13(e)所述制备出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-NHCH2Ph。
TLC:Rf=0.32，硅胶，二氯甲烷/甲醇97/3 v/v。(e)HOOC-CH2-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-NHCH2Ph如实施例13(f)所述，制备出HOOC-CH2-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-NHCH2Ph。Rt(LC):39.05分钟；20％A,80％B,0％C至20％A,20％B,60％C，经40分钟。实施例18HOOC-CH2-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-NH(CH3)2类似于实施例17所述，以N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH为原料，制备出HOOC-CH2-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-NH(CH3)2。Rt(LC):32.84分钟；20％A,80％B,0％C至20％A,20％B,60％C，经40分钟。实施例19HOOC-CH2-D-Dpa-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)(a)Boc-D-Dpa-Pro-OBzl向Boc-D-Dpa-OH(5.2g)的N,N-二甲基甲酰胺(50ml)的冷0℃溶液依次加入1-羟基苯并三唑(3.1g)、二环己基碳化二亚胺(3.3g)、H-Pro-OBzl.HCl(4.07g)和三乙胺(2.46ml)。混合物在0℃下搅拌1小时，然后在室温下保持过夜。混合物冷却到-20℃，通过过滤去除二环己基脲。蒸发滤液至干。残留物溶解于乙酸乙酯中，依次用5％的碳酸氢钠、水和盐水依次洗涤，经硫酸钠干燥，并真空浓缩。残留物在硅胶上(洗脱液庚烷/乙酸乙酯4/6 v/v)色谱，产生Boc-D-Dpa-Pro-OBzl(8.7g)。TLC:Rf=0.95,硅胶，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水520/31/18/7 v/v/v/v。(b)Boc-D-Dpa-Pro-OH将10％的炭载钯(1g)加入Boc-D-Dpa-Pro-OBzl(7.0g)的甲醇(140ml)溶液中。混合物在室温下在常压下氢化1小时。钯催化剂通过过滤去除，减压蒸发去除溶剂，产生Boc-D-Dpa-Pro-OH(5.5g)。
TLC:Rf=0.59，硅胶，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水520/31/18/7 v/v/v/v。(c)Boc-D-Dpa-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)根据实施例22中的描述的步骤，将混合酐偶合在Boc-D-Dpa-Pro-OH和H-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(参见实施例1)间，产生N-Boc-D-Dpa-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)(560mg)。
TLC:Rf=0.1，硅胶，甲苯/乙酸乙酯3/7 v/v。(d)H-D-Dpa-Pro-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA将N-Boc-D-Dpa-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)(560mg)溶解于无水二氯甲烷(2.5ml)和三氟乙酸(2.5ml)中，并在室温下搅拌1小时。将溶液真空浓缩，与甲苯共蒸发，产生H-D-Dpa-Pro-Lys(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(670mg)。TLC:Rf=0.51，硅胶，甲苯/乙酸乙酯1/1 v/v。(e)N-(叔丁氧羰基甲基)-D-Dpa-Pro-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)
将H-D-Dpa-Pro-Lys(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(570mg)溶解于乙腈(10ml)中，加入溴乙酸叔丁基酯(141μl)。用N,N-二异丙基乙胺将溶液保持在pH8，在室温下搅拌2小时。反应混合物真空浓缩，溶解于乙酸乙酯中，用水和盐水洗涤，用硫酸镁干燥，再浓缩。残留物在硅胶上使用乙酸乙酯/甲苯1/4作洗脱液色谱，产生N-(叔丁氧羰基甲基)-D-Dpa-Pro-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)(499mg)。TLC:Rf=0.47，硅胶，二氯甲烷/甲醇96/4 v/v。(f)HOOC-CH2-D-Dpa-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)根据实施例22中描述的方法，进行N-(叔丁氧羰基甲基)-D-Dpa-Pro-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)的脱保护和纯化。产生二种非对映体的混合物177mg。Rt(LC):32.57和33.22分钟；20％A和80％B至20％A,20％B和60％C，经40分钟。实施例20HOOC-CH2-D-Cha-N-环戊基-Gly-赖氨炔基ψ[COCO]-NH2根据实施例1中制备二肽的方法，制备N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-N-环戊基-甘氨酸。
用类似于实施例13中描述的方式，以Boc-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe为原料，制备出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-N-环戊基-Gly-赖氨炔基ψ[COCO]-NH2。Rt(LC):34.09分钟；20％A,80％B,0％C至20％A,20％B和60％C，经40分钟。实施例21HOOC-CH2-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-NHCH3用类似于实施例17中描述的方式，以N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-赖氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH为原料，制备HOOC-CH2-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-NHCH3。Rt(LC):29.61分钟；20％A,80％B,0％C至20％A,20％B和60％C，经40分钟。实施例22N-Me-D-Nle-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)(a)H-D-Nle-OMe.HCl向冷却至-15℃的270ml甲醇中加入18.2g亚硫酰氯。随后，让温度升至-10℃，保持在此温20分钟后，加入10g H-D-Nle-OH。温度缓慢升高，并在回流下保持恒定5小时。产物用甲醇和乙醚在4℃下结晶，由此产生12.9g。
TLC:Rf=0.61，硅胶，正丁醇/乙酸/水10/1/3 v/v/v。(b)Boc-D-Nle-OMe将H-D-Nle-OMe.HCl(12.9g)溶解于200ml无水甲醇中，接着加入二碳酸二叔丁基酯(15.5g)和三乙胺(19.8ml)。反应在室温下搅拌3小时，之后，混合物真空浓缩。接着，残留物溶解于乙酸乙酯中，用水洗涤。产物在硅胶上使用庚烷/乙酸乙酯3/1 v/v色谱。产量16.9g。
TLC:Rf=0.55，硅胶，庚烷/乙酸乙酯3/1 v/v。(c)N-Me-Boc-D-Nle-OMe在氮气下，将Boc-D-Nle-OMe(16.9g)溶解于20ml无水N,N-二甲基甲酰胺。接着，加入甲基碘(24.9ml)，冷却至0℃，加入氢化钠(3.31g,60％油分散液)，让混合物在室温下反应16小时。混合物真空浓缩，溶解于乙酸乙酯中，用0.1N盐酸、水、碳酸氢钠(5％)和水洗涤，干燥和再浓缩。由此产生18.8g烷基化的产物。
TLC:Rf=0.56,硅胶，庚烷/乙酸乙酯3/1 v/v。(d)N-Me-Boc-D-Nle-OH将N-Me-Boc-D-Nle-OMe(18g)溶解于400ml二噁烷/水9/1(v/v)中，溶液的pH用1N NaOH调节到12。让反应进行2小时，保持pH恒定在12。后处理步骤涉及用盐酸酸化，用冰冷却，加入另外的水(400ml)，用二氯甲烷萃取。有机层用盐水洗涤，干燥，过滤和真空浓缩。由此产生18.9g。
TLC:Rf=0.26,硅胶，二氯甲烷/甲醇9/1 v/v。(e)N-Me-Boc-D-Nle-Pro-OH先由N-Me-Boc-D-Nle-OH为原料，制备N-琥珀酰亚胺酯。18g的此衍生物溶解于乙腈(250ml)，并加入1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]-碳化二亚胺盐酸盐(EDCI)(14.5g)和N-羟基-琥珀酰亚胺(HONSu)(8.7g)。反应需要在室温下16小时，之后去除溶剂，残留物溶解于乙酸乙酯中，用水洗涤，并干燥。由此产生24.3g粗制的ONSu酯。下一步是将脯氨酸.HCl(20.9g)溶解于300ml N,N-二甲基甲酰胺和300ml水中，pH用2NNaOH溶液调节到8。将ONSu酯(24.3g溶于300ml N,N-二甲基甲酰胺)溶液在pH为8下滴加入此溶液中。5小时后，反应完毕，之后通过真空蒸发去除大量的有机溶剂。加入另一份(300ml)水，将混合物酸化。产物用乙酸乙酯萃取，用水洗涤。在干燥后，过滤并浓缩，获得的产物为黄色油状物，22.2g。粗产物在硅胶上使用乙酸乙酯/甲醇8/2 v/v作洗脱液色谱。产量13.2g。
TLC:Rf=0.65,硅胶，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水=163/20/6/11v/v/v/v。(f)N-Me-Boc-D-Nle-Pro-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)将N-Me-Boc-D-Nle-Pro-OH(376mg)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(3ml)中。在加入N,N-二异丙基乙胺(0.19ml)后，反应混合物放置在氮气下，并冷却到-20℃。随后加入氯甲酸异丁基酯(136μl)，让混合物在-20℃搅拌15分钟。将H-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(参见实施例1)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(3ml)中，并滴加入冷的混合酐溶液中，通过加入N,N-二异丙基乙胺，保持pH在8.5。反应混合物在-20℃下搅拌15分钟，并在室温下搅拌1小时。反应混合物蒸发至干。残留物溶解于乙酸乙酯中，依次用5％碳酸氢钠水溶液、水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，真空浓缩。残留物通过在硅胶上(洗脱液乙酸乙酯/庚烷1/1 v/v)色谱纯化，产生Boc-N-Me-D-Nle-Pro-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)(408mg)。
TLC:Rf=0.21，硅胶，乙酸乙酯/庚烷1/1 v/v。(g)N-Me-D-Nle-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)根据描述于实施例1p中的步骤制备Boc-N-Me-D-Nle-Pro-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)(408mg)。粗制的产物装填到制备HPLC Deltapack C18RP柱上，使用20％A/80％B至20％A/30％B/50％C的梯度洗脱体系，经40分钟，流速80ml/分钟。
产生二种非对映体105mg。Rt(LC):19.17分钟，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C，经40分钟。110mg。Rt(LC):21.47分钟，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C，经40分钟。实施例23N-Me-D-Phe-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)(a)N-Me-Boc-D-Phe-Pro-OH用H-D-Phe-OH为原料，根据实施例2中描述的步骤，合成N-Me-Boc-D-Phe-Pro-OH。(b)N-Me-D-Phe-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)根据实施例22中描述的步骤，将混合酐偶合在N-Me-Boc-D-Phe-Pro-OH和H-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(参见实施例1)，脱保护和纯化。
产生二种非对映体89mg。Rt(LC):8.45分钟，20％A,60％B和20％C至100％C，经40分钟。63mg。Rt(LC):10.98分钟，20％A,60％B和20％C至100％C，经40分钟。实施例24N-Me-D-Cha-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)(a)N-Me-Boc-D-Cha-Pro-OH用H-D-Cha-OH为原料，根据实施例3中描述的步骤，合成N-Me-Boc-D-Cha-Pro-OH。(b)N-Me-D-Cha-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)根据实施例22中描述的步骤，将混合酐偶合在N-Me-Boc-D-Cha-Pro-OH和H-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(参见实施例1)，脱保护和纯化。
产生二种非对映体140mg。Rt(LC):12.93分钟，20％A,60％B和20％C至100％C，经40分钟。139mg。Rt(LC):14.31分钟，20％A,60％B和20％C至100％C，经40分钟。实施例25乙基SO2-D-Cha-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)(a)乙基SO2-D-Cha-Pro-OH用Boc-D-Cha-OH和H-Pro-OPac为原料，根据实施例6中描述的步骤，合成乙基SO2-D-Cha-Pro-OH。(b)乙基SO2-D-Cha-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)根据实施例22中描述的步骤，将混合酐偶合在乙基SO2-D-Cha-Pro-OH和H-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(参见实施例1)，脱保护和纯化。产生非对映体127mg。
Rt(LC):44.52分钟和45.58分钟，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C，经40分钟。实施例262-丙基戊酰基-Asp(OMe)-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)(a)Boc-Asp(OMe)-OH将H-Asp(OMe)-OH(10.0g)溶解于二噁烷/水2/1(150ml)中，用冰冷却。分批加入碳酸氢钠(4.6g)和二碳酸二叔丁基酯(13.1g)。将混合物搅拌16小时，用碳酸氢钠保持pH在8.5。加入水(400ml)，混合物用庚烷彻底洗涤，用冰冷却，用1N盐酸酸化至pH2.5，用乙酸乙酯萃取(300ml)。有机层用水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并真空蒸发，产生Boc-Asp(OMe)-OH(10.25g)。
TLC:Rf=0.58，硅胶，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水163/20/6/11 v/v/v/v。(b)Boc-Asp(OMe)-Pro-OBzl如WO 95/35312，实施例中所描述的，用N-乙基吗啉代替N-甲基吗啉，合成出Boc-Asp(OMe)-Pro-OBzl。
TLC:Rf=0.40，硅胶，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(c)H-Asp(OMe)-Pro-OBzl.HCl将Boc-Asp(OMe)-Pro-OBzl(7.25g)溶解于无水乙酸乙酯(25ml)中，并用冰冷却。加入用盐酸(45ml)饱和的乙酸乙酯，混合物在0℃下搅拌5小时。过量的盐酸通过氮气流去除，所得的溶液真空浓缩，产生H-Asp(OMe)-Pro-OBzl.HCl，为白色固体(6.21g)。
TLC:Rf=0.17，硅胶，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(d)2-丙基戊酰基-Asp(OMe)-Pro-OBzl将H-Asp(OMe)-Pro-OBzl.HCl(6.21g)、无水二氯甲烷(10ml)和N,N-二异丙基乙胺(200μl)的溶液在0℃下加入到2-丙基戊酸酐溶液中，该2-丙基戊酸酐溶液已通过下述方法制备将2-丙基戊酸(1.63ml)溶解于无水二氯甲烷(15ml)中、在冰中冷却，加入1,3-二环己基碳化二亚胺(1.11g)、并将此溶液搅拌5分钟。混合物在室温下搅拌，通过加入N,N-二异丙基乙胺，保持pH在8.5,16小时后，加入0.5当量的2-丙基戊酸酐，并将溶液再搅拌4小时。之后通过过滤去除1,3-环己基脲。滤液真空浓缩，残留物溶解于乙酸乙酯中。此溶液依次用1N盐酸、饱和碳酸氢钠和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，真空浓缩。残留物在硅胶上使用甲苯/乙酸乙酯8/2 v/v作洗脱液色谱纯化，产生2-丙基戊酰基-Asp(OMe)-Pro-OBzl(6.54g)。
TLC:Rf=0.65，硅胶，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(e)2-丙基戊酰基-Asp(OMe)-Pro-OH将10％的炭载钯(750mg)加入到2-丙基戊酰基-Asp(OMe)-Pro-OBzl(705mg)的甲醇(10ml)溶液。混合物在室温、常压下氢化2小时。过滤去除钯催化剂，减压蒸发去除溶剂，产生2-丙基戊酰基-Asp(OMe)-Pro-OH(580mg)。
TLC:Rf=0.48,硅胶，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水163/20/6/11v/v/v/v。(f)2-丙基戊酰基-Asp(OMe)-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)根据实施例22中描述的步骤，将混合酐偶合在2-丙基戊酰基-Asp(OMe)-Pro-OH和H-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(参见实施例1)间，脱保护和纯化。
产生二种非对映体的混合物186mg。Rt(LC):23.16分钟和24.30分钟，20％A,60％B和20％C至100％C，经40分钟。实施例271-Piq-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)(a)1-Piq-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)根据实施例8中描述的步骤，合成1-Piq-Pro-OH。(b)1-Piq-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)根据实施例22中描述的步骤，将混合酐偶合在1-Piq-Pro-OH和和H-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(参见实施例1)间，脱保护和纯化。
产生二种非对映体92mg。Rt(LC):23.75分钟，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C，经40分钟。97mg。Rt(LC):25.72分钟，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C，经40分钟。实施例28HOOC-CH2-D-Cha-N-环戊基-Gly-赖氨炔基-(2-噻唑基)(a)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-N-环戊基-Gly-OH
根据实施例10中描述的步骤，用H-D-Cha-OH.HCl为原料，合成N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-N-环戊基-Gly-OH。(b)HOOC-CH2-D-Cha-N-环戊基-Gly-赖氨炔基-(2-噻唑基)根据实施例22中描述的步骤，将混合酐偶合在N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-N-环戊基-Gly-OH和H-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(参见实施例1)间，脱保护和纯化。
产生二种非对映体的混合物107mg。Rt(LC):20.39分钟和20.82分钟，20％A,60％B和20％C至100％C，经40分钟。实施例29HOOC-CH2-D-Phe-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)(a)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Phe-Pro-OH根据实施例11中描述的步骤，用H-D-Phe-OH.HCl为原料，合成N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Phe-Pro-OH。(b)HOOC-CH2-D-Phe-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)根据实施例22中描述的步骤，将混合酐偶合在N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Phe-Pro-OH和H-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(参见实施例1)间，脱保护和纯化。
产生二种非对映体143mg。Rt(LC):24.98分钟，20％A,80％B至和20％A,20％B和60％C，经40分钟。
149mg。Rt(LC):26.91分钟，20％A,80％B至和20％A,20％B和60％C，经40分钟。实施例30HOOC-CH2-D-p-Cl-Phe-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)(a)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-Pro-OH根据实施例12中描述的步骤，用H-D-p-Cl-Phe-OH.HCl为原料，合成N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-Pro-OH。(b)HOOC-CH2-D-p-Cl-Phe-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)根据实施例22中描述的步骤，将混合酐偶合在N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-Pro-OH和H-赖氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(参见实施例1)间，脱保护和纯化。
产生二种非对映体的混合物187mg。Rt(LC):28.86分钟和30.63分钟，20％A和80％B至20％A,20％B和60％C，经40分钟。实施例31另外，可以用本发明的方法制备下列化合物-HOOC-CH2-D-Cha-Pec-赖氨炔基ψ[COCO]-OH-HOOC-CH2-D-Cha-Pec-赖氨炔基-(2-噻唑基)-HOOC-CH2-D-Cha-(N-环己基)-Gly-赖氨炔基ψ[COCO]-OH-HOOC-CH2-D-Cha-(N-环己基)-Gly-赖氨炔基-(2-噻唑基)-HOOC-CH2-D-Cha-(N-环丙基)-Gly-赖氨炔基ψ[COCO]-OH-HOOC-CH2-D-Cha-(N-环丙基)-Gly-赖氨炔基-(2-噻唑基)-N-Me-D-Phe-(N-环戊基)-Gly-赖氨炔基ψ[COCO]-OH-N-Me-D-Phe-(N-环戊基)-Gly-赖氨炔基-(2-噻唑基)-2-丙基-戊酰基-Asp(OMe)-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH-2-丙基-戊酰基-Asp-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH-2-丙基-戊酰基-Asp-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)-2-羟基-3-环己基-丙酰基-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH-2-羟基-3-环己基-丙酰基-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)1-Piq-(N-环戊基)-Gly-赖氨炔基ψ[COCO]-OH1-Piq-(N-环戊基)-Gly-赖氨炔基-(2-噻唑基)-二苯基丙酰基-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)-N-Me-D-Nle-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH-乙基SO2-D-Phe-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH-乙基SO2-D-Phe-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)-乙基SO2-N(Me)-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OH-乙基SO2-N(Me)-D-Cha-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)-乙基SO2-N(Me)-D-Cha-Pro-赖氨炔基-(2-噁唑基)-HOOC-CH2-N(Me)-D-Cha-Pro-赖氨炔基ψ[COCO]-OHHOOC-CH2-N(Me)-D-Cha-Pro-赖氨炔基-(2-噻唑基)-HOOC-CH2-N(Me)-D-Cha-Pro-赖氨炔基-(2-噁唑基)实施例32抗凝血酶试验凝血酶(凝血因子Ⅱa)是一种凝血级联中的因子。
本发明化合物的抗凝血酶活性通过分光光度测定由凝血酶对显色底物s-2238的水解速率来评价。此在缓冲体系中的抗凝血酶活性试验用来评价试验化合物的IC50值。
试验介质缓血酸胺-NaCl-聚乙二醇6000(TNP)缓冲液。参照化合物I2581(Kabi)载体TNP缓冲液。增溶作用可以借助于二甲基亚砜、甲醇、乙醇、乙腈或叔丁醇，它们在终反应混合物浓度达2.5％时无不利作用。技术试剂*1．缓血酸胺-NaCl(TN)缓冲液。该缓冲液组成如下缓血酸胺(Tris)6.057g(50mmol),NaCl 5.844g(100mmol)，水至1升。溶液的pH在37℃用HCl(10mmol/l)调节至7.4。2．TNP缓冲液聚乙二醇6000溶解于TN缓冲液中，给出3g/l的浓度。3．S-2238溶液一小瓶的S-2238(25mg,Kabi Diagnostica,瑞典)溶解于20ml TN缓冲液中，给出1.25mg/ml(2mmol/l)的浓度。4．凝血酶溶液人凝血酶(16000nKat/小瓶；Centraal Laboratorium voor Bloedtransfusie，阿姆斯特丹，荷兰)溶解于TNP缓冲液中，给出835nKat/ml的备用溶液。在使用前一刻，将此溶液用TNP缓冲液稀释，给出3.34nKat/ml的浓度。-*所用的成分均为分析级-对于水溶液，使用超纯水(Milli-Q品级)试验和参照化合物溶液的制备试验和参照化合物溶解于Milli-Q水中，给出10-2mol/l的备用浓度。每一种浓度再逐级用载体稀释，给出10-3、10-4和10-5mol/l的浓度。稀释液，包括备用溶液，用于试验(在反应混合物中的终浓度分别为3×10-3、10-3、3×10-4、10-4、3×10-5、10-5、3×10-6和10-6mol/l)。步骤在室温下，将0.075ml和0.025ml试验化合物或参照化合物的溶液或载体分别移液至微量滴定板的孔中，这些溶液分别用0.115ml和0.0165mlTNP缓冲液稀释。向每一孔中加入一等分量的0.030ml S-2238溶液，并将此滴定板在37℃下温箱(Amersham)中预热和振荡下预温育10分钟。预温育之后，通过向每孔中加入0.030ml凝血酶溶液来开始S-2238的水解。此滴定板在37℃下温育(震荡30秒钟)。温育1分钟之后，使用动力学微量滴定板读数器(Twinreader plus,Flow Laboratories)，每2分钟测定一次每种样品在405nm下的吸光度，持续90分钟。
所有的数据使用LOTUS-MEASURE收集在IBM个人计算机中。对于每一化合物浓度(以mol/l反应混合物表达)和对于空白，相对于以分钟计的反应时间画出吸光度曲线图。应答的评价对于每一终浓度，由试验曲线图计算出最大吸光率。根据Hafner等(Arzneim.-Forsch./Drug Res.1977；27(Ⅱ)；1871-3)的对数值变换，计算IC50-值(终浓度，以μmol/l表达，造成空白的最大吸光度的50％抑制)。
在下列表格中，列出本发明化合物的IC50-值
权利要求
1．一种式Ⅰ化合物
其中A是H、任选取代的D,Lα-羟基乙酰基、R1、R1-O-C(O)-、R1-C(O)-、R1-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-、H2NCO-(CHR2)m-、或N-保护基团，其中R1选自(1-12C)烷基、(2-12C)链烯基、(2-12C)炔基和(3-8C)环烷基，这些基团可任选由(3-8C)环烷基、(1-6C)烷氧基、氧代、OH、COOH、CF3或卤素取代，和选自(6-14C)芳基、(7-15C)芳烷基和(8-16C)芳链烯基，它们中的芳基可以任选由(1-6C)烷基、(3-8C)环烷基、(1-6C)烷氧基、OH、COOH、CF3或卤素取代；每个基团R2独立地是H或具有与R1相同的含意；m是1、2或3；B是一个键，式-NH-CH[(CH2)pC(O)OH]-C(O)-的氨基酸或其酯衍生物且p是0、1、2或3,-N((1-12C)烷基)-CH2-CO-、-N((2-12C)链烯基)-CH2-CO-、-N((2-12C)炔基)-CH2-CO-、-N(苄基)-CH2-CO-、D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Piq、D-3-Piq或具有疏水、碱性或中性侧链的L-或D-氨基酸，这些氨基酸可以任选是N-(1-6C)烷基取代的；或A与B一起是残基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中R3和R4独立地是R1、R1-O-C(O)-、R1-C(O)-、R1-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-、H2NCO-(CHR2)m-、或N-保护基团，或R3和R4之一与R5相连与它们键合的“N-C”一起形成5-或6-元环，这些环可以与脂族或芳族6-元环稠合；且R5是疏水、碱性或中性侧链；X是带有疏水侧链的L-氨基酸、丝氨酸、苏氨酸、任选含有另外的选自N、O或S的杂原子和任选由(1-6C)烷基、(1-6C)烷氧基、苄氧基或氧代取代的环状氨基酸，或X是-NR2-CH2-C(O)-或片断
其中n是2、3或4，且W是CH或N；Y是H、-CHF2、-CF3、-CO-NH-(1-6C)亚烷基-C6H5、-COOR6且R6是H或(1-6C)烷基、-CONR7R8且R7和R8独立地是H或(1-6C)烷基或R7和R8一起是(3-6C)亚烷基，或Y是选自下列的杂环2-噻唑、2-噻唑啉、2-苯并噻唑、2-噁唑、2-噁唑啉和2-苯并噁唑，这些杂环可任选由(1-6C)烷基、苯基、(1-6C)烷氧基、苄氧基或氧代取代；且r是0、1、2或3；或者其前药或者其可药用的盐。
2．权利要求1的化合物，其中X是带有疏水侧链的L-氨基酸、丝氨酸、苏氨酸或-NR2-CH2-C(O)-。
3．权利要求1的化合物，其中A如前面所定义；B是一个键，式-NH-CH[(CH2)pC(O)OH]-C(O)-的氨基酸或其酯衍生物且p是0、1、2或3,-N((1-6C)烷基)-CH2-CO-、-N((2-6C)链烯基)-CH2-CO-、-N(苄基)-CH2-CO-、D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Piq、D-3-Piq或具有疏水侧链的D-氨基酸，这些氨基酸可以任选由N-(1-6C)烷基取代；或A与B一起是残基R3R4N-CHR5-C(O)-；且X是任选含有另外的选自N、O或S的杂原子和任选由(1-6C)烷基、(1-6C)烷氧基、苄氧基或氧代取代的环状氨基酸，或X是-NR2-CH2-C(O)-或片断
4．权利要求3的化合物，其中A是H、2-羟基-3-环己基-丙酰基-、9-羟基-芴-9-羧基、R1、R1-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-、H2NCO-(CHR2)m-、或N-保护基团，其中R1选自(1-12C)烷基、(2-12C)链烯基、(6-14)芳基、(7-15C)芳烷基和(8-16C)芳链烯基；每个基团R2独立地是H或具有与R1相同的含意；B是一个键，D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Piq、D-3-Piq或具有疏水侧链的D-氨基酸，这些氨基酸可以任选是N-(1-6C)烷基取代的；或A与B一起是残基R3R4N-CHR5-C(O)-；Y是-CO-NH-(1-6C)亚烷基-C6H5、-COOR6、-CONR7R8，或Y是选自下列的杂环2-噻唑、2-噻唑啉、2-苯并噻唑、2-噁唑、2-噁唑啉和2-苯并噁唑。
5．权利要求4的化合物，其中A是H、R1-SO2-或R2OOC-(CHR2)m-；B是一个键，D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Piq、D-3-Piq或具有疏水侧链的D-氨基酸；或A与B一起是残基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中至少R3和R4之一是R2OOC-(CHR2)m-或R1-SO2-，另一个独立地是(1-12C)烷基、(2-12C)链烯基、(2-12C)炔基、(3-8C)环烷基、(7-15C)芳烷基、R1-SO2-或R2OOC-(CHR2)m-，且R5是疏水侧链；Y是-CO-NH-(1-6C)亚烷基-C6H5、-COOR6且R6是H或(1-3C)烷基、-CONR7R8,R7和R8独立地是H或(1-3C)烷基或R7和R8一起是(3-5C)亚烷基，或Y是选自下列的杂环2-噻唑、2-苯并噻唑、2-噁唑或2-苯并噁唑。
6．权利要求5的化合物，其中A是R2OOC-(CHR2)m-；B是具有疏水侧链的D-氨基酸；或A与B一起是残基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中至少R3和R4之一是R2OOC-(CHR2)m-，且另一个独立地是(1-12C)烷基、(2-6C)链烯基、(3-8C)环烷基、苄基、R1-SO2-或R2OOC-(CHR2)m-；和X是2-氮杂环丁烷羧酸、脯氨酸、2-哌啶酸、4-噻唑烷羧酸、3,4-脱氢-脯氨酸、2-八氢吲哚羧酸或-[N(3-8C)环烷基]-CH2-C(O)-。
7．权利要求6的化合物，其中A是HOOC-CH2-；B是D-Phe、D-Cha、D-Coa、D-Dpa、p-Cl-D-Phe、p-OMethyl-D-Phe、p-OEthyl-D-Phe、D-Nle、m-Cl-D-Phe、3,4-二-OMe-D-Phe、D-Chg；或A与B一起是残基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中至少R3和R4之一是HOOC-CH2-，另一个独立地是(1-4C)烷基、(1-4C)烷基-SO2-或HOOC-CH2-，且R5是(3-8C)环烷基、(3-8C)环烷基(1-4C)烷基、苯基、苄基、任选由氯或(1-4C)烷氧基取代。
8．权利要求7的化合物，其中Y是选自下列的杂环2-噻唑、2-苯并噻唑、2-噁唑或2-苯并噁唑。
9．权利要求5的化合物，其中A是R1-SO2-；B是一个键、D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Piq、D-3-Piq或具有疏水侧链的D-氨基酸；或A与B一起是残基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中至少R3和R4之一是R1-SO2-，另一个独立地是(1-12C)烷基或R1-SO2-；X是2-氮杂环丁烷羧酸、脯氨酸、2-哌啶酸、4-噻唑烷羧酸、3,4-脱氢-脯氨酸、2-八氢吲哚羧酸、-[N(环戊基)]-CH2-C(O)-或片断
10．权利要求9的化合物，其中A是乙基-SO2-或苄基-SO2-；B是一个键、D-Phe、D-Cha、D-Coa、D-Dpa、p-Cl-D-Phe、p-OMethyl-D-Phe、p-OEthyl-D-Phe、D-Nle、m-Cl-D-Phe、3,4-二-OMe-D-Phe、D-Chg；或A与B一起是残基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中至少R3和R4之一是乙基-SO2-或苄基-SO2-，另一个独立地是(1-12C)烷基或R1-SO2-，且R5是(3-8C)环烷基、(3-8C)环烷基(1-4C)烷基、苯基、苄基、二苯基次甲基，这些基团任选由氯或(1-4C)烷氧基取代。
11．权利要求10的化合物，其中Y是-CO-NH-CH2-C6H5、-CO-NH-CH2CH2-C6H5或-CONR7R8,R7和R8独立地是H或(1-3C)烷基或R7和R8一起是(3-5C)亚烷基，或Y是选自下列的杂环2-噻唑、2-苯并噻唑、2-噁唑或2-苯并噁唑。
12．权利要求1至11中任一项的化合物，其中r是1。
13．一种药物组合物，它包含权利要求1至12中任一项的化合物和可药用的载体。
14．用于治疗的权利要求1至12中任一项的化合物。
15．权利要求1至12中任一项的化合物用于生产用于治疗或防止凝血酶相关疾病的药物的应用。
全文摘要
本发明涉及具有式(Ⅰ)的化合物,其中A、B、X、Y和r如说明书中所定义,或其前药或其可药用的盐。本发明的化合物具有抗凝血活性,且可以用于治疗或防止与凝血酶相关的疾病。
文档编号A61K38/05GK1212704SQ97192682
公开日1999年3月31日 申请日期1997年2月26日 优先权日1996年3月1日
发明者A·E·P·阿丹 申请人:阿克佐诺贝尔公司