专利名称：增强伽马干扰素活性的稠合吡咯并[2,3－c]咔唑－6－酮的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物化合物，该药物化合物在本专利文献中被称为“稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮”。也公开了这些化合物的制备方法和使用方法。
背景技术：
人伽马干扰素(IFN-γ)是一种天然的人免疫调节蛋白。它已被确认是一种对人肿瘤和病毒感染的治疗有效的试剂。IFN-γ体内抑制病毒和肿瘤生长的机制尚不明确。有证据表明，IFN-γ至少通过以下两种机制之一发挥作用(1)直接作用于病毒感染的细胞和肿瘤细胞，和/或(2)首先激活免疫系统细胞，然后该细胞破坏病毒感染的细胞或肿瘤细胞(《干扰素与其他具有调节作用的细胞活素》E.De Maeyer,J.De Maeyer-Guignard，纽约John Wiley &Sons出版公司(1988))。
免疫系统被刺激后的表现之一是在免疫细胞表面增强了对主要组织相容性复合体(MHC)蛋白质的表达。MHC由Ⅰ、Ⅱ与Ⅲ类基因组成，分别是Ⅰ、Ⅱ与Ⅲ类蛋白质的基因代码。Ⅰ类与Ⅱ类蛋白质存在于细胞表面，参与调节免疫应答，Ⅲ类蛋白质存在于血清中，与调节免疫应答无关。诸如单核细胞、B淋巴细胞、树突细胞等抗原抑制细胞上的Ⅰ类与Ⅱ类蛋白质将外部抗原交与T淋巴细胞，其后T淋巴细胞破坏含有该外部抗原的细胞。增强对Ⅰ类与Ⅱ类蛋白质的表达对动物免疫系统除去病毒感染的细胞以及促进特异性抗体的产生来说是必要的。由于IFN-γ能够增强对MHC的Ⅰ类与Ⅱ类蛋白质的表达，因而它成为免疫应答的主要调节因子之一。MHCI被IFN-γ增强的好处的一个例子是增强了病毒感染的细胞上的Ⅰ类蛋白质。病毒感染的细胞将在其细胞表面上合成的病毒抗原交与细胞毒T细胞(CD4细胞)上的T细胞受体，其后细胞毒T细胞破坏该病毒感染的细胞。MHCⅡ被IFN-γ增强的好处的一个例子是增强了单核细胞上的Ⅱ类蛋白质。单核细胞能够摄取侵入体内的微生物，单核细胞表面上的Ⅱ类蛋白质将来源于入侵微生物的肽交与辅助T细胞(CD8)上的T细胞受体，其后CD8细胞分泌淋巴因子。所分泌的淋巴因子引起能够合成抗体的B淋巴细胞的增殖，B淋巴细胞合成大量抗入侵微生物的抗体。
从上述实例可以看出，增强IFN-γ诱导MHC分子的化合物与IFN-γ结合将可用于治疗微生物感染。使用这样一种化合物将会减少IFN-γ的剂量，其有利之处在于达到与单用IFN-γ相同的治疗效果，但涉及IFN-γ的副作用较小。
至少有三份关于增强IFN-γ诱导MHC表达的报告(Coutinho.G.C.,Dudrieu-Trautmann,O.,Strosberg,A.D.,Couraud,P.O.，“儿茶酚胺刺激IFN-γ诱导的Ⅱ类MHC在牛脑毛细血管内皮细胞上的表达”《免疫学杂志》147,2525-2529(1991)；Zhu,J.,Mix,E.,Olsson,T.,Link,H，“体外离子通道调节对γ干扰素诱导的MHCⅠ类与Ⅱ类在巨噬细胞上的表达”《免疫药理学与免疫毒理学》17,109-136(1995)；Mothes,T.,Bendix,U.,Pfannschmidt,C.,Lehmann,I.，“麦胶蛋白及其他食物肽类对HT-29细胞诱导的MHCⅡ类分子表达的作用”《Gut》36,548-552(1995))。
发明概述本文公开了一种新颖的由式Ⅰ与式Ⅱ代表的分子，我们称之为稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮。
组分编号定义如下。以下还公开了这些化合物的优选制备方法。
我们发现，该稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮化合物(在Moody等《有机化学杂志》1992,57,2105中编号为K-252a和K-252c，并有详细说明)增强了人IFN-γ诱导相应细胞表面MHC表达的活性。本发明化合物显示能够提高免疫系统的功效，因而有利于增强对病毒和/或肿瘤的抑制作用。我们也发现，本发明的稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮化合物优选可用于增强神经营养素-3(NT-3)的活性。详细说明首先描述附图。
Ⅰ附1表示本发明的吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮促进IFN-γ诱导HLA-DRMHCⅡ分子表达的作用。
图2为式Ⅰ吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮的化学合成流程Ⅴ(A)-(D)部分略图。
图3表示吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮中间体的合成流程图。
图4表示吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮中间体的另一种合成流程图。
图5表示式Ⅱ吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮的合成流程图。
图6表示从相应的X为CH2的化合物合成X为C=O的吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮的流程图。
图7表示吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮中间体11的合成流程图。
Ⅱ稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮本发明的被称为稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮衍生物的新颖化合物是由下式所代表的
其中a)R1选自由下列基团组成的组H；1-4碳烷基；芳基；芳烷基；杂芳基；杂芳烷基；C(=O)R9，其中R9为1-4碳烷基或芳基；(CH2)nOR9，其中n为一个1-4的整数；OR10，其中R10为H或1-4碳烷基；(CH2)nOR14，其中R14为除去羧基的羟基后的氨基酸残基；OR14；NR7R8；(CH2)nNR7R8；和O(CH2)nNR7R8；其中
(1)R7与R8独立为H或1-4碳烷基；或(2)R7与R8结合共同构成一个通式-(CH2)2-X1-(CH2)2-的连接基团，其中X1为O、S或CH2；b)R2选自由H,SO2R9,CO2R9,C(=O)R9,1-8碳烷基，1-8碳链烯基，1-8碳炔基，和一个5-7碳单糖组成的组，其中所述单糖的每个羟基独立选自由未取代的羟基组成的组，取代所述羟基的取代部分选自由H,1-4碳烷基，2-5碳烷基羰基氧，和1-4碳烷氧基组成的组，其中1)每个1-8碳烷基，1-8碳链烯基，或1-8碳炔基是未取代的；或2)每个1-8碳烷基，1-8碳链烯基，或1-8碳炔基独立被1-3个选自由下列基团组成的组的基团取代6-10碳芳基，杂芳基，F,Cl,Br,I,CN,NO2,OH,OR9,O(CH2)nNR7R8,OCOR9,OCONHR9,O-四氢吡喃基，NH2,NR7R8,NR10COR9；NR10CHO2R9,NR10CONR7R8,NHC(=NH)NH2,NR10SO2R9；S(O)yR11，其中R11为H,1-4碳烷基，6-10碳芳基，或杂芳基，y为1或2；SR11,CO2R9,CONR7R8,CHO,COR9,CH2OR7,CH2OR9,CH=NNR11R12,CH=NOR11,CH=NR9,CH=NNHCH(N=NH)NH2；SO2NR12R13，其中(1a)R12与R13独立为H,1-4碳烷基，6-10碳芳基，或杂芳基；或(1a)R12与R13结合共同构成一个-(CH2)2-X1-(CH2)2-连接基团；PO(OR11)2,NHR14,NR10R14,OR14，和一个5-7碳单糖组成的组，其中所述单糖的每个羟基独立选自由未取代的羟基组成的组，取代所述羟基的取代部分选自由H,1-4碳烷基，2-5碳烷基羰基氧，和1-4碳烷氧基组成的组；(c)每个R3与R4独立选自由下列基团组成的组H,6-10碳芳基，杂芳基，F,Cl,Br,I,CN,CF3,NO2,OH,OR9,O(CH2)nNR7R8,OCOR9,OCONHR9,NH2,(CH2)nOR9,(CH2)nOR10,(CH2)nOR14,OR14,NHR14,NR7R8,NR7(CH2)nNR7R8,NR10COR9,NR10CONR7R8,SR11,S(O)yR11,CO2R9,COR9,CONR7R8,CHO,CH=NOR11,CH=NR9,CH=NNR11R12,(CH2)nSR9,(CH2)nS(O)yR9,CH2SR15，其中R15为1-4碳烷基；CH2S(O)yR14,(CH2)nNR7R8,(CH2)nNHR14,1-8碳烷基，1-8碳链烯基，和1-8碳炔基；和其中1)每个1-8碳烷基，1-8碳链烯基，或1-8碳炔基是未取代的；或2)每个1-8碳烷基，1-8碳链烯基，或1-8碳炔基独立被如上b)2)所述的取代基取代；d)R5选自由1-8碳烷基，1-8碳链烯基，和1-8碳炔基组成的组；和其中1)每个烷基，链烯基，或炔基是未取代的；或2)每个烷基，链烯基，或炔基被1-3个选自由下列基团组成的组的基团取代F,Cl,Br,I,CN,CF3,NO2,OH,OR9,O(CH2)nNR7R8,OCOR9,OCONHR9,NH2,(CH2)nOR9,(CH2)nOR14,NR7R8,NR7(CH2)nNR7R8,NR10COR9,NR10CONR7R8,SR11,S(O)yR11,CO2R9,COR9,CONR7R8,CHO,CH=NOR11,CH=NR9,CH=NNR11R12,(CH2)nSR9,(CH2)nS(O)yR9,CH2SR15,CH2S(O)yR14,(CH2)nNR7R8,和(CH2)nNHR14；e)X选自由下列基团组成的组-N-,-O-,-S-,-S(=O),-S(=O)2,1-3碳亚烷基，-C(=O)-,-C(R2)=C(R2)-,-C(R2)2-,-CH=CH-,-CH(OH)CH(OH)-,-C(=NOR11)-,-C(OR11)(R11)-,-C(=O)CH(R15)-,-CH(R15)C(=O)-；-CH2-Z-,-Z-CH2-,-CH2ZCH2-，其中Z选自由-C(OR11)(R11)-,O,S,C(=O)，和NR11组成的组；和被一个基团取代的1-3碳亚烷基，取代基选自由R5取代基，SR10,OR10,OR14,R15，苯基，萘基，和7-14碳芳烷基组成的组。
本文所用“芳基”一词指单环及多环芳族基团，例如包括苯基、萘基、联苯基、和二甲苯基。芳基可以是未取代的，也可以被例如烷基和卤素取代。卤素包括氟、氯、溴、和碘。优选的芳基含有6-10个碳。尤其优选的是苯基和萘基。
本文所用“杂芳基”一词指含有至少一个碱性氮原子和0-4个选自O、S、和N的杂原子的芳基部分。杂芳基例如包括吡咯基、吡喃基、噻喃基、呋喃基、咪唑基、吡啶基、噻唑基、三嗪基、苯二甲酰亚氨基、吲哚基、嘌呤基、和苯并噻唑基。
本文用于定义R14的“氨基酸”一词指既含有一个氨基又含有一个羧基的分子。它包括“α氨基酸”，通常是指在邻接羧基的碳上具有一个氨基官能度的羧酸。α氨基酸可以是天然来源的，也可以是非天然来源的。氨基酸也包括“二肽”，本文对其定义为两个氨基酸连接成为一个肽酰胺键。因此二肽的组分不限于α氨基酸，可以是任何既含有一个氨基又含有一个羧基的分子。优选为α氨基酸、诸如赖氨酰-β-丙氨酸的二肽、和诸如3-二甲氨基丁酸的2-8碳的氨基链烷酸。
优选的“烷基”、“链烯基”、和“炔基”含有1-4个碳原子。
优选的R1基团包括H,1-4碳烷基，取代或未取代的苯基，OR10，和O(CH2)nNR7R8。优选的苯基的取代基基团包括1-4碳烷基、和卤素。最优选为H。
优选的R2基团包括H,C(=O)R9,1-8碳烷基，和被一个OR9、OH、OCOR9、NR7R8、NH2、NR10COR9、或NR10R14取代的1-8碳烷基。最优选为H。
优选的R3与R4基团包括H，卤素，CN,OH,OR9,OR14,NH2,NR7R8,(CH2)nOR10,(CH2)nOR14,COR9,NR10COR9,NHR14，和O(CH2)nNR7R8。最优选为H。
优选的R5基团包括H，和1-4碳烷基。最优选为H。
优选的X基团包括-N-,-O-,-S-,1-3碳亚烷基，-C=O-,-CH2-Z-,和-Z-CH2-。最优选为-N-,-O-,-S-，和-CH2-。
Ⅲ稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮的应用稠合吡咯并[2，3-c]咔唑-6-酮已被证实是一种具有多种重要功能活性的药物(panoply)，应用于多种环境中，包括研究和治疗的场合。为便于表述，也为了不限制这些化合物的应用范围，该稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮的活性优选地可表现以下两方面A．强化IFN-γ诱导MHC分子；
B．增强营养因子应答细胞的功能和/或生存力。优选使用对IFN-γ产生应答的人单核细胞系来强化MHC分子的IFN-γ诱导作用；特别优选的细胞系可从美国典型培养物保芷中心(ATCC)得到，其入藏号为ATCC TIB-202，我们称之为THP-1。已知在THP-1细胞中IFN-γ诱导三种MHCⅡ杂二聚物的表达，HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。优选通过使用培养的脊髓胆碱乙酰转移酶(“ChAT”)化验法来确定营养因子应答细胞(如神经元谱系的细胞)的功能和/或生存力的增强作用。
本文用于修饰“功能”和“生存力”的“增强”一词指一种积极的改变或变化。积极的增强作用在本文中也可以用“加强”或“强化”表示。
本文用于修饰“功能”或“生存力”或“诱导”的“加强”或“加强的”或“强化”一词指稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮的存在对营养因子应答细胞的功能和/或生存力具有比较大的作用，或者在IFN-γ诱导MHC分子的情况下，比没有稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮存在的对比细胞的作用明显。
本文所用“神经元”、“神经元谱系的细胞”和“神经元细胞”一词包括但不限于具有单一或多种递质和/或单一或多种功能的神经元类型的不均匀细胞种群；这样的细胞优选为胆碱能神经元。本文所用“胆碱能神经元”指中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)的神经元，这些神经元的神经递质为乙酰胆碱；例如基底前脑神经元和脊髓神经元。
本文所用“营养因子”是直接或间接影响营养因子应答细胞生存力或功能的分子。营养因子例如包括睫状神经营养因子(CNTF)、基础成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素及胰岛素样生长因子(例如IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、IGF-Ⅱ)、干扰素、白细胞介素、细胞活素、和神经营养素，包括神经生长因子(NGF)、神经营养素-3(NT-3)、神经营养素-4/5(NT-4/5)和大脑衍化的神经营养因子(BDNF)。
“营养因子应答细胞”在本文中的定义为含有营养因子能与之特异性结合的受体的细胞；例如包括神经元(例如胆碱能神经元)和非神经元细胞(例如单核细胞和新生细胞)。
本文所用“营养因子活性”和“营养因子诱导活性”定义为因营养因子(例如NT-3)与含有营养因子受体的细胞结合而直接或间接引起的任何反应。
用于“营养因子活性”和“营养因子诱导活性”中的“营养因子”一词既包括内源性营养因子，也包括外源性营养因子，“内源性”指已经存在的营养因子，“外源性”指加入到系统中的营养因子。如定义所述，“营养因子诱导活性”包括由(1)内源性营养因子、(2)外源性营养因子、和(3)内源性与外源性营养因子的组合所诱导的活性。
A．强化IFN-γ诱导MHC分子本发明化合物可用于强化MHC分子的IFN-γ诱导作用。IFN-γ显示对治疗病毒感染及某些肿瘤的有效性。不过由于副作用其剂量的限制，使IFN-γ的用途也受到了限制。在免疫减弱的情况下，例如确诊为病毒感染的病人，考虑到IFN-γ诱导MHC分子的表达，提高以IFN-γ为媒介的免疫应答是有利的。本发明化合物的优点是使内源性IFN-γ或外部加入的IFN-γ诱导MHC表达的能力提高。
以下第Ⅴ节将详细说明优选使用THP-1细胞系评价稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮强化IFN-γ诱导MHC分子的活性。该细胞系证实了MHCⅡ杂二聚物HLA-DR的表达。在IFN-γ的存在下和在IFN-γ加一种或几种本发明的稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮的存在下，比较HLA-DR的表达是一种快速且有效的测定强化IFN-γ诱导MHC分子的方法。
本发明化合物可用于建立强化MHC分子表达、功能、识别的体外模型，或用于筛选具有类似于稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮活性的其他合成化合物。该化合物在研究条件下可被应用于确认、精制和测定与功能反应有关的分子目标。例如，通过放射性标记与具体细胞功能(如HLA-DR诱导)有关的稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮，可对与稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮结合的目标实体进行特征化鉴定、分离、和精制。还有另一个例子，稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮可作为一种筛选工具，用来发现一些具有边缘活性、但在与至少一种该公开的稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮联合使用时能够强化IFN-γ诱导MHC分子的试剂。因为该公开的稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮是用来强化IFN-γ诱导MHC分子的，因此该化合物有利于用作治疗剂。这种强化作用对免疫减弱病人是有价值的。
B．增强营养因子应答细胞的功能和/或生存力本发明的稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮可用于提高神经元谱系细胞的功能和/或生存力。该稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮可以单独或与其他稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮联合使用，或者与其他有益的分子联合使用如吲哚并咔唑，它也具有增强指定细胞的功能和/或生存力的能力。在稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮用于提高生物学活性(如神经营养活性)的情况下，可将外源性神经营养素(如NT-3)与稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮结合使用。
大量神经性疾病的特征在于神经元细胞在功能上死亡、受伤、在死亡时发生轴突变性等。这些疾病包括但不限于阿尔茨海默症；运动神经元疾病(例如肌萎缩性脊髓侧索硬化)；帕金森症；脑血管疾病(例如多发性硬化)；外周神经病(例如与化疗有关的影响DRG神经元的外周神经病)；兴奋性氨基酸诱导的疾病；与大脑或脊髓的震伤或穿透伤有关的疾病。
如下第Ⅴ节所述，利用基底前脑ChAT活性测试化验法可测定稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮提高神经元谱系细胞功能和/或生存力的能力。ChAT催化神经递质乙酰胆碱的合成，被认为是功能性胆碱能神经元的酶标志物。功能性神经元也能够生存。通过比较有或没有稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮的存在下神经营养素(如NT-3)的功能活性，可测定神经营养素的增强作用。
稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮的药学上可接受的盐也在本发明范围之内。本文所用“药学上可接受的盐”一词指一种无机酸加成盐，如盐酸盐、硫酸盐、和磷酸盐，或一种有机酸加成盐，如乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、和柠檬酸盐。药学上可接受的金属盐实例为碱金属盐如钠盐和钾盐，碱土金属盐如镁盐和钙盐，铝盐，和锌盐。药学上可接受的铵盐实例为铵盐和四甲基铵盐。药学上可接受的有机胺加成盐实例为吗啉的盐和哌啶的盐。药学上可接受的氨基酸加成盐实例为赖氨酸、甘氨酸、和苯丙氨酸的盐。
通过与药学上可接受的非毒性赋型剂和载体混合，可将这里所提出的化合物制成药物组合物。可将该组合物制成适用于胃肠外给药的剂型，特别是液体溶液或混悬液；或口服给药的剂型，特别是药片或胶囊；或鼻内给药的剂型，特别是药粉、滴鼻剂、或气雾剂；或皮肤给药的剂型，例如通过透皮吸收的贴剂。
组合物以单元剂量的方式可方便地给药，可按照任何药学领域所熟知的方法进行制备，例如《雷明顿药物科学》(Mack出版公司，宾州，伊斯顿，1980)所述。胃肠外给药制剂可含有灭菌水或盐水诸如聚乙二醇的聚亚烷基醇、油及植物来源、氢化萘等作为一般的赋型剂。尤其是可生物相容的、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物可用作控制活性化合物释放的赋型剂。其他可能适用于这些活性化合物的胃肠外释放系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物微粒、渗透泵、可植入的输液系统、和脂质体。吸入法给药的制剂含有赋型剂例如乳糖，或可以是水溶液例如含有聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘氨胆酸盐和去氧胆酸盐，或以滴鼻剂给药的油溶液，或鼻内用药的凝胶。胃肠外给药制剂也可包含适用于颊内给药的甘氨胆酸盐、适用于直肠给药的水杨酸盐、或适用于阴道给药的柠檬酸。透皮贴剂优选为亲脂性乳剂。
本发明化合物可用作药物组合物中的单一活性试剂。或者可与其他活性成分联合使用，例如合成的IFN-γ和/或其他促进增强NT-3的生长因子，如美国专利5468872号和国际申请WO95/07911号(申请日1995年3月23日)。
本发明化合物在治疗组合物中的浓度可以是不同的。该浓度所取决于的因素例如给药的药物总剂量、所用化合物的化学性质(如疏水性)、和给药途径。本发明化合物一般是以含水的生理缓冲溶液的形式，其中胃肠外给药含有大约0.1至10％w/v的化合物。一般剂量范围约为每日1μg/kg至1g/kg体重；优选的剂量范围约为每日0.01mg/kg至100mg/kg体重。优选的给药剂量可能取决于不确定因素，例如疾病或疾患的类型与进展程度、具体病人的整体健康状态、所选择的化合物的相对生物功效、化合物赋型剂的组成、和其给药途径。
Ⅳ合成方法的一般说明使用两种合成途径制备本发明的稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮衍生物。方法A(图2)中，在一种催化剂(如三氟乙酸(TFA))的存在下，吲哚环(R3)的碳4-7位(单举)是未取代或取代的或者(杂)芳基部分(R4)是取代或未取代的2-(芳基)或2-(杂芳基)吲哚衍生物(1-4)与马来酰亚胺反应，得到式Ⅰ的稠合吡咯并咔唑-6-酮衍生物(实施例Ⅰ-Ⅳ)。也可使用另外的路易斯酸催化剂，如SnCl4、AlCl3、EtAlCl2、或Et2AlCl来作用于该反应。反应也可在一种溶剂中进行，如TFA、甲苯、CH2Cl2、或1,2-二氯乙烷。
使用标准的文献方法(Hudkins,R.L.等《有机化学杂志》1995,60,6218)，可制得双芳基吲哚中间体2,2’-双吲哚1(X=N,R2、R3、R4=H)、2-(2-呋喃基)吲哚2(X=O,R2、R3、R4=H)和2-(苯并噻吩基)吲哚3(X=S,R2、R3、R4=H)(图2)。使1-羧基-2-(三丁基甲锡烷基)吲哚5或被一个R3基团取代的1-羧基-2-(三丁基甲锡烷基)吲哚(Hudkins,R.L.等《有机化学杂志》1995,60,6218)与2-溴茚6(《有机化学杂志》1982,47,705)或被一个R4基团取代的2-溴茚反应，可制得2-(2-茚基)吲哚4(图3)(X=CH2,R2、R3、R4=H)或被一个R3或R4基团取代的2-(2-茚基)吲哚衍生物。或者，通过将1H-吲哚或其含有一个R3基团的衍生物，保护为引哚-1-羧酸锂中间体(《四面体快报》26∶5935(1985))，然后用一种强碱如叔丁基锂处理，然后用一种适当的2-茚酮或被一个R4基团取代的2-茚酮衍生物进行烷基化反应，得到相应的叔醇7，可制得2-(2-茚基)吲哚4(X=CH2,R2、R3、R4=H)或被一个R3或R4基团取代的2-(2-茚基)吲哚衍生物(图4)。所得叔醇7用一种稀酸(例如2N HCl的丙酮溶液)处理，得到相应的2-(2-茚基)吲哚4(美国专利5475110)。在如图4所示的反应流程中使用其他的苯并环烷-2-酮、如2-四氢萘酮将得到2-(2-(3,4-二氢萘基)吲哚8(X=CH2CH2,R2、R3、R4=H)(美国专利5475110)。钯催化的交叉偶合法(Stille反应)可用于制备其他衍生物，例如图3中若X有1-3个(单举)碳，通过使相应的环酮的2-(三氟甲磺酸酯)、或2-碘或2-溴乙烯基衍生物与1-羧基-2-三丁基甲锡烷基吲哚偶合，得到2-(2-苯并环烯基)吲哚。
按照标准方法，将前述起始1H-吲哚衍生物转化为1-取代的吲哚衍生物(R2不是H)，例如用碱和烷基化试剂处理1H-吲哚，得到1-取代的吲哚。这些实例中，吲哚衍生物可以直接用强碱(如叔丁基锂、仲丁基锂、正丁基锂、二异丙酰胺锂)处理，然后用2-茚酮衍生物进行烷基化反应，得到相应的叔醇7，它在吲哚环的一个位置上含有R2取代基。按照适用于上述吲哚衍生物的方法，可将2-(芳基)或2-(杂芳基)吲哚衍生物(1-3)、2-(2-茚基)吲哚4、或2-(2-(1,2-二氢萘基)吲哚8转化为在吲哚环的一个位置上含有R2取代基的中间体。
可以从适当的R1取代的马来酰亚胺入手，制备含有R1基团不是H的通式Ⅰ和Ⅱ化合物(图2，方法A)。在碱(例如碱金属或碱土金属或有机锂化合物的氢化物、醇盐、氢氧化物)的存在下，用R1L处理其中R1为氢的通式Ⅰ和Ⅱ化合物进行烷基化反应(其中L为离去基团，如卤素、甲磺酸酯或甲苯磺酸酯)，得到具有一个与内酰胺氮结合的R1基团的稠合吡咯并咔唑-6-酮衍生物。用一当量或过量的强碱(例如碱金属或碱土金属或有机锂化合物的氢化物、醇盐、氢氧化物)与R5L处理稠合吡咯并咔唑-6-酮衍生物，其中L为离去基团，如卤素，或者通过使稠合吡咯并咔唑-6-酮衍生物与含有R5的酮羰基或醛羰基衍生物缩合，可将其中R5为氢的通式Ⅰ和Ⅱ化合物转化为加入了一或两个R5基团的稠合吡咯并咔唑-6-酮衍生物。来自酮或醛缩合反应的衍生物中，R5为乙烯基。
使用标准方法制备吲哚衍生物(美国专利3976639；美国专利3732245；《杂环化合物化学》吲哚部分一与二，Houlihan编，Wiley-Interscience公司(1972))。使用前述方法可制得2-茚酮衍生物(见美国专利4192888；美国专利4128666；《美国化学会志》89∶4524(1967)；《四面体快报》43∶3789(1974)；《化学Ber.》122∶1791(1989)；《加拿大化学杂志》60∶2678(1982)；《HelveticaChimica Acta》70∶1791(1987)；《化学药物公报》33∶3336(1985)；《有机化学杂志》55∶4835(1990)；《四面体》45∶1441(1989)；《合成》818(1981))。
方法B(图2)中，在一种催化剂、如SnCl4、AlCl3、EtAlCl2、Et2AlCl或TFA的存在下，在CH2Cl2、C2H4Cl2或甲苯溶剂中，使2-(杂芳基)吲哚衍生物(1-3)或2-(芳基)吲哚衍生物如2-(2-茚基)吲哚4与顺式-β-氰基丙烯酸乙酯反应，得到本发明式Ⅰ的6-氧-咔唑化合物。
式Ⅱ化合物的制备方法概括在图5中。向琥珀酰亚胺、或R1取代的琥珀酰亚胺衍生物中加入2-(芳基)或2-(杂芳基)吲哚基锌试剂(《四面体快报》1994,35,793；《四面体快报》1994,35,7123；《四面体快报》1993,34,5955；《四面体快报) 1993,34,6425)，进行Reformatzsky型反应(《合成》1975,685)，然后脱水，得到通式结构9的化合物。钯催化的闭环反应(美国专利5475110；《四面体快报》1993,34,8361)得到式Ⅱ的吡咯并[2,3-c]咔唑化合物。
使用标准的氧化剂(例如SeO2、CrO3、NaCrO7、或MnO2)氧化其中X=CH2的通式Ⅰ(或Ⅱ)衍生物，制得其中X=(C=O)的化合物(通式结构10)(图6)。或者，2-(2-茚基)吲哚4可被氧化为2-(2-(1-氧代茚基)吲哚，并用于制备其中X=(C=O)的通式Ⅰ或Ⅱ化合物，其方法如图2和图5所示。或者，可使用钯催化的交叉偶合法(图3)制备2-(2-(1-氧代茚基)吲哚11,方法是使1-羧基-2-三丁基甲锡烷基吲哚5或其衍生物与2-(三氟甲磺酰)氧基茚-1-酮或2-溴茚-1-酮12或其衍生物之一偶合(图7)(《有机化学杂志》1994,59,3453)。通式结构10(X=(C=O))的化合物可进行各种有机合成领域的技术人员已知的烯化、加成和缩合反应，所得衍生物例如但不限于X=(C=C(R2)R2)、C(R2)R2、C(OR11)(R11)。按照与氧化X=(C=O)衍生物类似的方法，氧化X=S衍生物，可制得其中X为S(=O)或S(=O)2的稠合吡咯并咔唑-6-酮衍生物。
实施例Ⅴ．合成方法的具体说明给出下列实施例的目的在于解释说明，无论如何不应把它们看作是对本发明范围的限制。
A．例Ⅰ:5H,7H,13H-苯并呋喃并[2,3-a]吡咯并[2,3-c]咔唑-6(6H)酮(X=O,R1、R2、R3、R4、R5=H)将在三氟乙酸(2ml)中的2-(2-苯并呋喃基)吲哚2(250mg,1.0mmol)与马来酰亚胺(110mg,1.2mmol)混合物在密闭反应容器中在125℃下加热18小时。收集固体沉淀，用TFA洗涤并干燥，得到150mg(48％)产物。重结晶(TFA)得到一褐色固体；mp＞300℃,MS(ES+)312(M+),1H NMR(DMSO-d6)δ4.00(s,2H),4.13(s,2H),7.12(t,1H),7.37(t,2H),7.45(t,2H),7.71(d,1H),7.95(d,1H),8.54(d,1H),10.12(s,1H),11.79(s,1H)。C20H12N2O20.4H2O分析计算值C,75.18；H,4.04；N,8.77；实测值C,75.29；H,3.86；N,8.60。
B．例Ⅱ:5H,7H,13H-苯并噻吩并[2,3-a]吡咯并[2,3-c]咔唑-6(6H)酮(X=S,R1、R2、R3、R4、R5=H)将在三氟乙酸(2ml)中的2-(2-苯并噻吩基)吲哚3(100mg,0.4mmol)与马来酰亚胺(40mg,0.4mmol)混合物在密闭反应容器中在125℃下加热16小时。收集固体沉淀，用冷甲醇洗涤并干燥，得到80mg(58％)产物。重结晶(TFA)得到一褐色固体；mp＞300℃,MS(ES+)328(M+),1H MR(DMSO-d6)δ4.10(s,2H),7.20(t,1H),7.40-7.60(m,4H),8.10(d,1H),8.80(m,1H),10.86(s,1H),11.80(s,1H)。C20H12N2SO0.5H2O分析计算值C,71.20；H,3.88；N,8.30；实测值C,70.86；H,3.61；N,8.39。
C．例Ⅲ:5H,7H,12H,13H-吲哚并[2,3-a]吡咯并[2,3-c]咔唑-6(6H)酮(X=N,R1、R2、R3、R4、R5=H)(1)方法A向悬浮在甲苯(50ml)中的2-2’-双吲哚1(250mg,1.0mmol)与马来酰亚胺(110mg,1.2mmol)混合物中加入三氟乙酸(0.5ml)。溶液回流加热18小时后，冷却至室温，并浓缩至约20ml。溶液在冰浴中冷却，收集固体沉淀，用冷乙醚洗涤并干燥，得到150mg(55％)产物。柱色谱法精制(EtOAc∶己烷∶2∶1)，得到一褐色固体；mp＞320℃,MS(ES+)311(M+),1H NMR(DMSO-d6)δ4.00(s,2H),7.17-7.22(m,2H),7.37-7.42(m,2H),7.67(d,2H),8.03(d,1H),8.58(d,1H),10.87(s,1H),10.92(s,1H),11.18(s,1H)。C20H12N2O20.5H2O分析计算值C,74.99；H,4.41；N,13.12；实测值C,75.24；H,4.02；N,13.05。(2)方法B向悬浮在二氯甲烷(10ml)中的2-2’-双吲哚1(100mg,0.43mmol)与顺式-β-氰基丙烯酸乙酯(50mg,0.4mmol)混合物中加入25ml SnCl4。混合物在室温下搅拌30分钟。混悬液在冰浴上冷却，收集固体，用冷乙醚洗涤并干燥，得到36mg(27％)产物。柱色谱法精制(EtOAc∶己烷∶2∶1)，得到一褐色固体；mp＞320℃,MS(ES+)311(M+),1H NMR(DMSO-d6)δ4.00(s,2H),7.17-7.22(m,2H),7.37-7.42(m,2H),7.67(d,2H),8.03(d,1H),8.58(d,1H),10.87(s,1H),10.92(s,1H),11.18(s,1H)。该化合物的光谱分析特征与方法A制得的化合物相同。
D．例Ⅳ:5H,7H,12H,13H-茚并[2,3-a]吡咯并[2,3-c]咔唑-6(6H)酮(X=CH2,R1、R2、R3、R4、R5=H)(1)方法A将三氟乙酸(2ml)中的2-(2-茚基)吲哚4(300mg,1.3mmol)与马来酰亚胺(160mg,1.6mmol)混合物在密闭容器中在160℃下加热18小时。溶液蒸发，将固体溶于乙酸乙酯，然后用水洗涤并干燥(MgSO4)，得到褐色固体产物。该粗产物经色谱法精制(硅胶，EtOAc∶己烷∶1∶1)，所得产物用THF处理并过滤。浓缩后的残余物用MeOH研制得到终产物；mp275-280℃,MS(ES+)310(M+),1H NMR(DMSO-d6)δ4.00(s,2H),4.13(s,2H),7.17(t,1H),7.25-7.42(m,3H),7.50(d,1H),7.71(d,1H),8.00(d,1H),8.37(d,1H),10.75(s,1H),11.33(s,1H)。IR(KBr)1650-1700cm-1。C21H14N2O0.7H2O分析计算值C,78.10；H,4.81；N,8.65；实测值C,78.13；H,4.41；N,8.10。(2)方法B
将三氟乙酸(1ml)中的2-(2-茚基)吲哚4(75mg,0.32mmol)与顺式-β-氰基丙烯酸乙酯(81mg,0.64mmol)混合物在密闭容器中在120℃下加热1小时，然后在160℃下加热4小时。混合物减压蒸发，残余物用乙醚研制。所得固体经色谱法精制(硅胶，EtOAc∶己烷∶1∶1)，得到12mg(12％)褐色固体产物；mp275-280℃,MS(ES+)310(M+)。该化合物的光谱数据与方法A制得的化合物相同。
E．例Ⅴ稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮增强IFN-γ诱导MHCⅡ抗原HLA-DR的作用来自人单核细胞的人THP-1(ATCC TIB 202)细胞种系用于证明稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮对HLA-DR的增强作用，该细胞种系是对IFN-γ产生应答的。
在37℃、5％CO2:95％空气的大气中、100％湿度条件下，将THP-1细胞在含有20μM巯基乙醇和10％牛胎血清的RPMI培养基中培养。为测定本发明化合物对HLA-DR的增强作用，将细胞分别不经处理作为对照，仅用100单位/ml的IFN-γ处理，或用最终浓度为1μM的本发明化合物处理30分钟、再加入100单位/ml的IFN-γ。复制这些培养物用于所有实验。处理过的THp-1细胞在37℃下恒温48小时，然后准备用流动血细胞计数法分析HLA-DR。按照如《干扰素和其他起调节作用的细胞活素》第9章，EdwardDe Maeyer,Jacqneline De Maeyer Guignard著，纽约John Wiley & Sons出版公司1988年版所述的标准方法进行HLA-DR的诱导。按照《当代免疫学备忘录》第1卷第5.0.1-5.8.8页，John Wiley & Sons出版公司1994年版的指导，将细胞准备用血细胞计数法分析HLA-DR。每次处理后离心收集一百万个细胞，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次。将细胞再次悬浮在含有10μg精制兔IgG的100μl PBS中，以阻滞细胞表面的非特异性部位。在冰上冷却20分钟后，加入20μl用荧光标记过的FITC标记的抗HLA-DR单克隆抗体，细胞在冰上再冷却30分钟，使抗体与HLA-DR结合。然后细胞用PBS洗涤2次，固定在0.5ml0.5％仲甲醛。固定的细胞在进行流动血细胞计数法分析之前一直在4℃下贮存。
典型稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮对HLA-DR的增强作用如
图1所示。Y轴上IFN-γ单独对HLA-DR的增强作用记为100％。1μM下典型化合物单独诱导HLA-DR的作用是不明显的(图1)。所有典型化合物增强IFN-γ诱导HLA-DR的作用与单用IFN-γ的诱导作用比较，即与100％比较。四种化合物对单用IFN-γ所提高的百分比如表1所示。例如在2μM下，第Ⅴ(D)节的化合物(例Ⅳ)增强IFN-γ诱导HLA-DR比单用IFN-γ提高了60％。
表1
*将单用IFN-γ定义为100％。
F．例Ⅵ吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮增强NT-3在基底前脑培养物中的ChAT活性用胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性作为胆碱能神经元功能或生存力的量度，测定吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮增强NT-3在基底前脑培养物中的活性的能力。单用该化合物对ChAT活性没有影响。不过在NT-3存在下，典型化合物对ChAT活性具有剂量依赖的增强作用，并使其活性水平高于单用NT-3激发产生的活性。表2所示结果为在培养开始的当天一次使用NT-3和供试化合物的结果，说明对基底前脑胆碱能神经元的生存力或功能具有长效。所用方法如美国专利5468872第18和19栏所述。
表2
与未经处理的对照培养物相比，NT-3(100ng/ml)提高了163±5％(平均±SD)的ChAT活性。活性水平以单用供试化合物为基础(100％)。*根据Dunnett统计学方法，p＜0.05，与单用NT-3活性相比有统计学上的显著差异对本发明的优选实施方式可以作出许多修改和改变，而且可以在不背离本发明精神的前提下作出该修改和改变，这对本领域的技术人员来说是可以接受的。因此附在后面的权利要求意在涵盖落在本发明真实精神和范围内的所有等效变化。贯穿本专利公开的引证文献结合在此作为参考。
权利要求
1．一种稠合吡咯并[2,3-c]咔唑-6-酮，由选自由式Ⅰ与式Ⅱ组成的组之一代表，
其中a)R1选自由下列基团组成的组H；1-4碳烷基；芳基；芳烷基；杂芳基；杂芳烷基；C(=O)R9，其中R9为1-4碳烷基或芳基；(CH2)nOR9，其中n为一个1-4的整数；OR10，其中R10为H或1-4碳烷基；(CH2)nOR14，其中R14为除去羧基的羟基后的氨基酸残基；OR14；NR7R8；(CH2)nNR7R8；和O(CH2)nNR7R8，其中(1)R7与R8独立为H或1-4碳烷基；或(2)R7与R8结合共同构成一个通式-(CH2)2-X1-(CH2)2-的连接基团，其中X1为O,S或CH2；b)R2选自由H,SO2R9,CO2R9,C(=O)R9,1-8碳烷基，1-8碳链烯基，1-8碳炔基，和一个5-7碳单糖组成的组，其中所述单糖的每个羟基独立选自由未取代的羟基组成的组，取代所述羟基的取代部分选自由H,1-4碳烷基，2-5碳烷基羰基氧，和1-4碳烷氧基组成的组，其中1)每个1-8碳烷基，1-8碳链烯基，或1-8碳炔基是未取代的；或2)每个1-8碳烷基，1-8碳链烯基，或1-8碳炔基独立被1-3个选自由下列基团组成的组的基团取代6-10碳芳基，杂芳基，F,Cl,Br,I,CN,NO2,OH,OR9,O(CH2)nNR7R8,OCOR9,OCONHR9,O-四氢吡喃基，NH2,NR7R8,NR10COR9；NR10CHO2R9,NR10CONR7R8,NHC(=NH)NH2,NR10SO2R9；S(O)yR11，其中R11为H,1-4碳烷基，6-10碳芳基，或杂芳基，y为1或2；SR11,CO2R9,CONR7R8,CHO,COR9,CH2OR7,CH2OR9,CH=NNR11R12,CH=NOR11,CH=NR9,CH=NNHCH(N=NH)NH2；SO2NR12R13，其中(1a)R12与R13独立为H,1-4碳烷基，6-10碳芳基，或杂芳基；或(1a)R12与R13结合共同构成一个-(CH2)2-X1-(CH2)2-连接基团；PO(OR11)2,NHR14,NR10R14,OR14，和一个5-7碳单糖组成的组，其中所述单糖的每个羟基独立选自由未取代的羟基组成的组，取代所述羟基的取代部分选自由H,1-4碳烷基，2-5碳烷基羰基氧，和1-4碳烷氧基组成的组(c)每个R3与R4独立选自由下列基团组成的组H,6-10碳芳基，杂芳基，F,Cl,Br,I,CN,CF3,NO2,OH,OR9,O(CH2)nNR7R8,OCOR9,OCONHR9,NH2,(CH2)nOR9,(CH2)nOR10,(CH2)nOR14,OR14,NHR14,NR7R8,NR7(CH2)nNR7R8,NR10COR9,NR10CONR7R8,SR11,S(O)yR11,CO2R9,COR9,CONR7R8,CHO,CH=NOR11,CH=NR9,CH=NNR11R12,(CH2)nSR9,(CH2)nS(O)yR9,CH2SR15，其中R15为1-4碳烷基；CH2S(O)yR14,(CH2)nNR7R8,(CH2)nNHR14,1-8碳烷基，1-8碳链烯基，和1-8碳炔基；其中1)每个1-8碳烷基，1-8碳链烯基，或1-8碳炔基是未取代的；或2)每个1-8碳烷基，1-8碳链烯基，或1-8碳炔基独立被如上b)2)所述的取代基取代；d)R5选自由1-8碳烷基，1-8碳链烯基，和1-8碳炔基组成的组；其中1)每个烷基，链烯基，或炔基是未取代的；或2)每个烷基，链烯基，或炔基被1-3个选自由下列基团组成的组的基团取代F,Cl,Br,I,CN,CF3,NO2,OH,OR9,O(CH2)nNR7R8,OCOR9,OCONHR9,NH2,(CH2)nOR9,(CH2)nOR14,NR7R8,NR7(CH2)nNR7R8,NR10COR9,NR10CONR7R8,SR11,S(O)yR11,CO2R9,COR9,CONR7R8,CHO,CH=NOR11,CH=NR9,CH=NNR11R12,(CH2)nSR9,(CH2)nS(O)yR9,CH2SR15,CH2S(O)yR14,(CH2)nNR7R8,和(CH2)nNHR14；e)X选自由下列基团组成的组-N-,-O-,-S-,-S(=O),-S(=O)2,1-3碳亚烷基，-C(=O)-,-C(R2)=C(R2)-,-C(R2)2-,-CH=CH-,-CH(OH)CH(OH)-,-C(=NOR11)-,-C(OR11)(R11)-,-C(=O)CH(R15)-,-CH(R15)C(=O)-；-CH2-Z-,-Z-CH2-,-CH2ZCH2-,其中Z选自由-C(OR11)(R11)-,O,S,C(=O)，和NR11组成的组；和被一个基团取代的1-3碳亚烷基，取代基选自由R5取代基，SR10,OR10,OR14,R15，苯基，萘基，和7-14碳芳烷基组成的组。
2．权利要求1的化合物，其中R9选自由1-4碳烷基、苯基、和萘基组成的组。
3权利要求1的化合物，其中R11、R12、和R13每个独立选自由H、1-4碳烷基、苯基、萘基、和杂芳基组成的组。
4．权利要求1的化合物，其中R1选自由H、1-4碳烷基、取代的苯基、未取代的苯基、OR10、和O(CH2)nNR7R8组成的组。
5．权利要求1的化合物，其中R2选自由H、C(=O)R9、1-8碳烷基、和被一个取代基取代的1-8碳烷基组成的组，该取代基选自由OR9、OH、OCOR9、NR7R8、NH2、NR10COR9、和NR10R14组成的组。
6．权利要求1的化合物，其中R3与R4每个独立选自由H、卤素、CN、OH、OR9、OR14、NH2、NR7R8、(CH2)nOR10、(CH2)nOR14、COR9、NR10COR9、NHR14、和O(CH2)nNR7R8组成的组。
7．权利要求1的化合物，其中R5选自由H和1-4碳烷基组成的组。
8．权利要求1的化合物，其中X选自由-N-、-O-、-S-、1-3碳亚烷基、-C=O-、-CH2-Z-、和-Z-CH2-组成的组。
9．权利要求8的化合物，其中X选自由-N-、-O-、-S-、和-CH2-组成的组。
10．权利要求9的化合物，其中R1、R2、R3、R4、和R5均为H。
11．权利要求1的化合物，该化合物是由式Ⅰ代表的。
12．权利要求11的化合物，其中R1选自由H、1-4碳烷基、取代的苯基、未取代的苯基、OR10、和O(CH2)nNR7R8组成的组。
13．权利要求11的化合物，其中R2选自由H、C(=O)R9、1-8碳烷基、和被一个取代基取代的1-8碳烷基组成的组，该取代基选自由OR9、OH、OCOR9、NR7R8、NH2、NR10COR9、和NR10R14组成的组。
14．权利要求11的化合物，其中R3与R4每个独立选自由H、卤素、CN、OH、OR9、OR14、NH2、NR7R8、(CH2)nOR10、(CH2)nOR14、COR9、NR10COR9、NHR14、和O(CH2)nNR7R8组成的组。
15．权利要求11的化合物，其中R5选自由H和1-4碳烷基组成的组。
16．权利要求11的化合物，其中X选自由-N-、-O-、-S-、1-3碳亚烷基、-C=O-、-CH2-Z-、和-Z-CH2-组成的组。
全文摘要
本发明文献公开了合成的、具有生物学活性的分子,该分子被称为稠合吡咯并[2,3－c]咔唑－6－酮。这些分子由通式Ⅰ和Ⅱ代表。也公开了稠合吡咯并[2,3－c]咔唑－6－酮的制备方法和使用方法。
文档编号A61K31/404GK1211254SQ9719237
公开日1999年3月17日 申请日期1997年2月20日 优先权日1996年2月21日
发明者罗伯特·L·赫德金斯, 詹姆斯·L·迪博尔德, 小欧内斯特·柰特 申请人:塞弗朗公司