硫酸软骨素在制备抗肿瘤免疫增强剂中的用途
【专利摘要】本发明涉及一种硫酸软骨素在制备抗肿瘤免疫增强剂中的用途，本发明首次发现硫酸软骨素可以调控特异miRNA的表达、增加细胞因子伽马干扰素和白细胞介素-2的合成和提高淋巴细胞的产生，从而增强机体的免疫能力以抑制肿瘤细胞的生长。所以，硫酸软骨素可以作为免疫增强剂用于癌症的治疗。
【专利说明】硫酸软骨素在制备抗肿瘤免疫增强剂中的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及硫酸软骨素在制备抗肿瘤免疫增强剂中的用途，属于硫酸软骨素的医药新用途。
【背景技术】
[0002]硫酸软骨素是由D-葡萄糖醛酸与2-乙酰氨基-2-脱氧-硫酸-D-半乳糖组成双糖基本单位构成的粘多糖类物质，是生物体内结缔组织基质的成分之一，可从动物的鼻骨、喉骨及其它软骨中提取。临床上，硫酸软骨素片用于治疗风湿、类风湿性关节炎、肩周炎、类软骨炎以及高脂血症；硫酸软骨素注射液用于神经性头痛、神经痛、关节痛、动脉硬化等疾病的辅助治疗；硫酸软骨素滴眼液用于眼疲劳、眼干燥症及角膜炎、角膜溃疡和角膜损伤的治疗。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供硫酸软骨素在制备抗肿瘤免疫增强剂中的用途，本发明首次发现硫酸软骨素可以调控特异miRNA的表达、增加细胞因子伽马干扰素和白细胞介素-2的合成和提高淋巴细胞的产生，从而增强机体的免疫能力以抑制肿瘤细胞的生长。所以，硫酸软骨素可以作为免疫增强剂用于癌症的治疗。
[0004]本发明解决上述技术问题的技术方案如下:硫酸软骨素在制备抗肿瘤免疫增强剂中的用途。
[0005]本发明的有益效果是:
[0006]本发明首次发现硫酸软骨素可以调控特异miRNA的表达、增加细胞因子伽马干扰素和白细胞介素-2的合成和提高淋巴细胞的产生，从而增强机体的免疫能力以抑制肿瘤细胞的生长。所以，硫酸软骨素可以作`为免疫增强剂用于癌症的治疗。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1为硫酸软骨素对小鼠体内B16F10黑色素瘤细胞生长的抑制作用图；
[0008]图2为硫酸软骨素对转移于小鼠肺部的B16F10黑色素瘤细胞生长的抑制作用图；
[0009]图3为硫酸软骨素对小鼠肺部B16F10黑色素瘤细胞生长抑制作用的统计结果图；
[0010]图4为硫酸软骨素对miR-223表达的抑制作用图；
[0011]图5为硫酸软骨素对伽马干扰素产生的促进作用图；
[0012]图6为硫酸软骨素对白细胞介素-2产生的促进作用图；
[0013]图7硫酸软骨素对淋巴细胞生长的促进作用图；
[0014]图8为硫酸软骨素对小鼠脾脏淋巴细胞的促进作用图。【具体实施方式】
[0015]以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0016]本发明所用硫酸软骨素的制备方法参考Fialkova，M.A.et al.，1989.The effectof chondroitin sulfate preparations on wound healing and the strength of thesurgical scar,Biull Eksp Biol Med， 108(9):350-351。
[0017]实验例:采用小鼠动物模型评价硫酸软骨素对抗肿瘤免疫的增强作用和对B16F10黑色素瘤的治疗效果
[0018]1、材料:
[0019]1.1处于生长对数期的B16F10黑色素瘤细胞购买自美国ATCC公司。
[0020]1.2小鼠购自美国Jackson实验室。
[0021]2、方法:
[0022]第一组小鼠共20只，每只小鼠皮下注射一百万B16F10黑色素瘤细胞；第一组小鼠又分为第一药物对照组和第一药物处理组。
[0023]第二组小鼠共20只，每只小鼠静脉注射五十万B16F10黑色素瘤细胞；第二组小鼠又分为第二药物对照组和第二药物处理组。
[0024]空白对照组小鼠共10只，每只小鼠未注射B16F10黑色素瘤细胞。
[0025]第一药物对照组和第二药物对照组的小鼠腹腔注射生理盐水，每只注射100微升生理盐水，第一药物处理组和第二药物处理组的小鼠隔一天静脉注射I毫克硫酸软骨素；然后，每天观察小鼠的体形变化和记录小鼠的体重。在第三天、第七天、第九天和第十一天，每组分别杀死三只小鼠，分析小鼠体内黑色素瘤细胞的生长和免疫系统的变化。
[0026]数据统计
[0027]数据均采用了数据统计分析，图中的p < 0.0001、p < 0.01、p < 0.005和p< 0.05，表明对照组与处理组有显著的差别。
[0028]3、结果:
[0029]第一药物对照组的小鼠皮下注射一百万B16F10黑色素瘤细胞后，黑色素瘤细胞在体内不断长大，而第一药物处理组的小鼠在皮下注射一百万B16F10黑色素瘤细胞后，静脉注射了硫酸软骨素，硫酸软骨素明显抑制了 B16F10黑色素瘤细胞在小鼠体内的生长，结果如图1所示，从图1可以看到，第一药物对照组的小鼠，在皮下注射一百万B16F10黑色素瘤细胞后的第16天，侧背可见肿瘤小块，随后迅速增大，到第30天肿瘤块已达350立方毫米以上。而注射硫酸软骨素的第一药物处理组小鼠，在皮下注射一百万B16F10黑色素瘤细胞后的第20天以后，才见肿瘤小块的出现，并且肿瘤块没有继续明显增大，到第30天肿瘤块也仅有25立方毫米。
[0030]第二组小鼠每只小鼠静脉注射了五十万B16F10黑色素瘤细胞，正常小鼠的肺颜色均一，第二药物对照组的小鼠由于B16F10黑色素瘤细胞转移至肺部生长，因此，在肺部表面形成密密麻麻的B16F10黑色素瘤，而第二药物处理组的小鼠由于注射了硫酸软骨素，显著减少了转移的B16F10黑色素瘤细胞在肺部的生长，因此，第二药物处理组小鼠的肺部B16F10黑色素瘤明显少于第二药物对照组，如图2所示。硫酸软骨素对小鼠肺部B16F10黑色素瘤细胞生长抑制作用的统计结果如图3所示，从图3可以看出，第二药物对照组的小鼠在静脉注射了五十万B16F10黑色素瘤细胞后的第11天，在小鼠的肺部平均可发现170个肿瘤小块。而注射硫酸软骨素的第二药物处理组小鼠，在静脉注射了五十万B16F10黑色素瘤细胞后的第11天，在小鼠的肺部平均只发现40个肿瘤小块，显著少于第二药物对照组的小鼠。当然，未静脉注射B16F10黑色素瘤细胞的空白对照组小鼠，在其肺部没有发现任何肿瘤块。
[0031]经测定和分析表明，硫酸软骨素能降低miRNA-223分子的表达，如图4所示，从而增加细胞因子伽马干扰素的合成增加，如图5所示，因此，增强抗肿瘤的免疫系统，如图6~8所示。从小鼠脾脏中分离淋巴细胞，在24孔培养板每孔加入2毫升RPM1-1640培养基，然后每孔加入一百万小鼠淋巴细胞。实验共分三组，每组8孔淋巴细胞。第一组为对照组，无额外添加物；第二组为肿瘤抗原gplOO处理组，每孔添加10_5摩尔gplOO肿瘤抗原；第三组为硫酸软骨素处理组，每孔添加1(T5摩尔gplOO肿瘤抗原和50微克/毫升硫酸软骨素。在37°C、5%C02培养箱培养三天后，收集淋巴细胞。然后从淋巴细胞中分离RNA样品，逆转录合成cDNA，进行荧光实时定量PCR测定miR-223的表达水平并进行比较。结果如图4显示，与第一对照组相比，在第二组中gplOO肿瘤抗原处理明显降低miR-223的表达水平；在第三组中，硫酸软骨素处理进一步降低miR-223的生成。结果表明，硫酸软骨素能降低miRNA-223分子的表达。研究已经证实，miR-223能够抑制伽马干扰素的产生。通过不同浓度硫酸软骨素培养淋巴细胞显示，硫酸软骨素能够增加细胞因子伽马干扰素的合成增加，如图5所示。因此，硫酸软骨素可能降低miRNA-223合成从而增加伽马干扰素的产生。同样地，通过不同浓度硫酸软骨素培养淋巴细胞显示硫酸软骨素能促进白细胞介素-2的产生，如图6所示；氚标记的胸腺嘧啶核苷同位素示踪试验表明，硫酸软骨素也促进淋巴细胞的分裂，如图7所示。脾脏淋巴细胞计数显示，硫酸软骨素处理明显增加淋巴细胞的数目，如图8所示。因此，硫酸软骨素能增强抗肿瘤的免疫系统。
[0032]上述实验中，每次试验至少重复3次。每次试验结果一致。图中的数据是每次试验结果的平均值，并表明了实验误差。
[0033]由上述实施例表明，硫酸软骨素对B16F10黑色素瘤具有良好的抑制作用，主要是通过增强抗肿瘤的免疫反应从而抑制B16F10黑色素瘤细胞的生长。由此证明，硫酸软骨素具有间接的抗黑色素瘤活性，能用于制`备增强抗肿瘤免疫反应的药物，治疗癌症病人。
[0034]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.硫酸软骨素在制备抗肿瘤免疫增强剂中的用途，所述硫酸软骨素的结构式如下所示:
【文档编号】A61K31/737GK103610689SQ201310539374
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月4日 优先权日:2013年11月4日
【发明者】周菊华 申请人:鲁东大学