六聚体胆色素原合成酶作为开发抗生素和除草剂的靶的制作方法

专利名称：六聚体胆色素原合成酶作为开发抗生素和除草剂的靶的制作方法
对相关申请的交叉引用本申请要求2003年7月7日提交的临时申请60/485,253和2004年6月4日提交的临时申请60/577,312的优先权，以上两个申请在此以其全文引为参考。
对光盘中材料的引用存储在光盘中的序列表在此以其全文引为参考。
背景技术：
1.发明领域本发明涉及四吡咯的生物合成，并且更具体涉及抑制胆色素原合成酶活化的机制。
2.相关技术描述四吡咯生物合成是动物，植物和微生物包括细菌、古细菌、真菌，原生生物和病毒的关键途径。最常见的中间产物是5-氨基酮戊酸(ALA)。在所有生物体中从ALA到原卟啉IX的酶反应对四吡咯的生物合成而言是常见的。
胆色素原合成酶(PBGS)，也称作5-氨基酮戊酸脱水酶(ALAD)，是古老的和高度保守的蛋白，其催化四吡咯包括血红素、叶绿素、维生素B12和辅因子F430(1，2)生物合成最常见的步骤。PBGS催化两个5-氨基酮戊酸分子缩合形成四吡咯前体胆色素原。
PBGS以前被理解为是同型八聚体金属酶，其在催化位点和变构位点使用多种二价或一价阳离子。哺乳动物和酵母通常需要Zn(II)，一些原核生物的酶需要Mg(II)或Zn(II)或两者以达到最大活性，而植物的酶似乎只需要Mg(II)以实现酶活性。少量的生物体具有既不需要Zn(II)也不需要Mg(II)的PBGS。使用金属离子的差异是由至少两个金属结合区域的初级结构中残基的变化所引起的。
已经发现某些来源的PBGS的比活性依赖于蛋白浓度。例如已经在日本慢生根瘤菌(B.japonicum)，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，和豌豆PBGS中可见对比活性的蛋白浓度依赖性，但是还没有关于来自大肠杆菌(E.coli)，酵母，或哺乳动物来源(22)的PBGS的文献证明。
已知通过从活性位点除去金属，例如将PBGS用乙二胺四乙酸(EDTA)处理可以抑制PBGS。
关于PBGS的更多信息公开于参考文献(3-5)和(7)。
目前，更多的消费者要求个人健康护理产品比如湿巾，尿布等不仅能提供他们想要的功能，还能够治疗或预防由于接触例如细菌域，古细菌域，和/或真核生物域(eucarya)而导致的疾病或损伤，同时不损害消费者的健康。为满足这样的需求，已经在广泛范围的消费产品例如湿巾中掺入抗微生物剂，以抵抗皮肤上暂留或驻留的细菌。含抗微生物剂的产品目前以很多形式在市场出现，例如洗剂，祛味肥皂，硬表面清洁剂，湿巾，和外科消毒剂。
然而许多含有抗微生物剂的产品由于用于提供抗微生物效果的化学品的性质而对皮肤产生伤害或刺激。例如，一些硬表面清洁剂和外科消毒剂使用高水平醇和/或表面活性剂，其已经被重复显示使皮肤组织干燥并产生刺激。其他目前可用的湿巾使用苛刻的阳离子表面活性剂而不添加酸。尽管表面活性剂能够深入并杀死多种类型的细菌，其对皮肤产生刺激和伤害。
许多含有抗微生物剂的产品使用有机酸，与阴离子或阳离子表面活性剂组合作为抗微生物剂。尽管一些有机酸可以无需表面活性剂而安全地用于产品以控制微生物，大多数只掺入有机酸的产品抗细菌效果不佳，除非使用很高的浓度。在很高浓度下，这些酸使得最后的产品不经济并且甚至引起皮肤刺激的问题。
此外，生物膜也是某些表面存在的问题。生物膜可以在基本上任何存在充分湿气的环境表面上发现。它们在足够营养物可得的流动系统中的发展最快速。生物膜由吸附到环境表面的微生物种群或群落构成，其是细胞和多糖复杂的聚集体。这些微生物通常被包围在它们合成的细胞外多糖中。该生物膜，例如可以从铜绿假单胞菌，荧光假单胞菌(P.fluorescens)和肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumonia)的混合培养物形成。生物膜可以在与湿气接触的固体基层(substrate)上形成，在活生物体的软组织表面形成和在液体空气界面形成。产生生物膜通常的位置包括海洋或淡水环境的岩石和其他基质表面。生物膜还通常与活生物体有关，包括植物和动物。组织表面例如持久浸浴在丰富含水介质的牙齿和小肠粘膜快速发展包膜在它们自己产生的细胞外多糖中的微生物的复杂聚集体。口腔细菌在其细胞内部储存亲碘性多糖或糖原样分子的能力与牙齿龋洞有关，因为这些储存化合物能使可能形成乳酸的时间延长。正是暴露于乳酸的时间延长导致了牙釉质脱钙。
人们利用微生物生物膜，主要在生境补救区中。水处理工厂，废水处理工厂和与个人家庭相关的腐败系统通过与生物膜相互作用除去病原体并降低水或废水中有机物质的含量。在另一方面，生物膜可以是对健康的严重危害，尤其是在引入人工基层的病人中。此外，生物膜是对轮船底部的威胁，因为藤壶能在其表面生长并腐蚀该表面或管道例如油泵或除湿器的内壁。
尽管有如上所述的发展，对于提供具有普遍应用的抗微生物组合物仍然有着需求。还需要提供能够干扰多聚体蛋白质单元平衡的试剂，例如，能够抑制植物和/或细菌中四吡咯生物合成的抑制剂。还需要通过不适用于人或动物的机制来完成抑制，从而产生一种新的、高度特异的抑制细菌、抗生或除草剂活性的方法。
此处引用的所有参考文献以其全文引作参考。
发明简述因此，本发明提供一种包含试剂的组合物，该试剂通过结合到多聚体蛋白的结合位点并从而影响单元的平衡而影响多聚体蛋白，其中所述多聚体蛋白包括具有多个所述单元的集合，其中各所述单元包括第一互补表面和第二互补表面并且一个单元的第一互补表面与另一个单元的第二互补表面相关，假设该集合是至少一种下列不同的四级结构同工型，条件是所述多聚体蛋白中(1)各所述单元的结构决定所述不同的四级结构同工型的结构，(2)所述单元处于平衡中以及(3)所述不同四级结构同工型的结构影响该多聚体蛋白的功能。在某些实施方案中，影响所述多聚体蛋白包括影响四级结构同工型的形成。
在某些实施方案中，影响所述多聚体蛋白包括影响多聚体蛋白的功能。所述多聚体蛋白功能非限制性的例子是活性，而其中影响是指抑制或激活中的至少一种。
在某些实施方案中，该试剂结合到具有更低活性的四级结构同工型或具有更高活性的四级结构同工型中的至少一种。
在某些实施方案中，各所述单元选自单体、二聚体、三聚体、四聚体、六聚体和八聚体。
在某些实施方案中，所述多聚体蛋白选自胆色素原合成酶和Ia型核糖核苷酸还原酶。
在某些实施方案中，所述多聚体蛋白是包含八个胆色素原合成酶单体的胆色素原合成酶。在另外的实施方案中，多聚体胆色素原合成酶的活性形式具有少于八个单体。
在某些实施方案中，该试剂是结合到具有较低活性的四级结构同工型的抑制剂，并且其中四级结构同工型含有少于八个胆色素原合成酶单体。在某些实施方案中，抑制剂是迷迭香酸(rosmarinic acid)或其衍生物。
在某些实施方案中，所述多聚体蛋白是Ia型核糖核苷酸还原酶，该试剂通过选择性结合到对具有较低活性的四级结构同工型独特的结合位点而抑制Ia型核糖核苷酸还原酶。
还提供一种组合物，其含有抑制剂，该抑制剂通过结合到具有第二数量单体的多聚体胆色素原合成酶的较低活性形式而抑制具有第一数量单体的多聚体胆色素原合成酶活性形式的形成，其中第一数量单体多于第二数量单体。
在某些实施方案中，多聚体胆色素原合成酶衍生自细菌域，古细菌域或真核生物域，假设八聚体胆色素原合成酶包含变构的镁结合位点。在该实施方案的一个变体中，多聚体胆色素原合成酶包含催化的锌结合位点。
在某些实施方案中，多聚体胆色素原合成酶不包含变构的镁结合位点和催化的锌结合位点。
在某些实施方案中，所述较低活性形式是六聚体。在某些实施方案中，其中所述较低活性形式是二聚体。在某些实施方案中，多聚体胆色素原合成酶的活性形式是八聚体。
在某些实施方案中，抑制剂取代金属离子从而结合在金属离子结合位点处。在某些实施方案中，金属离子是锌和/或镁。
在某些实施方案中，抑制剂结合在活性位点。
在某些实施方案中，抑制剂不是金属阳离子。
在某些实施方案中，抑制剂抑制多聚体胆色素原合成酶活性形式的形成，所述活性形式是通过结合到含有少于八个单体的较低活性形式多聚体胆色素原合成酶的不能实施拥抱(hug-disabling)的结构域的八聚体胆色素原合成酶。
在某些实施方案中，抑制剂通过结合在活性位点和/或金属离子结合位点以外的位点处而抑制多聚体胆色素原合成酶活性形式的形成。
在某些实施方案中，抑制剂通过去除金属离子之外的机制抑制多聚体胆色素原合成酶活性形式的形成。
在某些实施方案中，该组合物还包括递送介质，所述递送介质选自药物可接受的介质，口服可接受的载体，抗细菌介质和有效除草介质。
有利的是，该组合物有效抑制或防止多聚体胆色素原合成酶的活性形式的形成，并从而抑制或防止细菌，古细菌和/或真核生物的增长或生长，假设多聚体胆色素原合成酶的活性形式含有变构的镁结合位点。在本实施方案的一个变体中，组合物有效治疗或预防由于接触细菌、古细菌和/或真核生物引起的疾病。在本实施方案的一个变体中，组合物是药物、牙膏、肥皂、消毒剂、抗生物膜组合物和除草剂中的至少一种。
在某些实施方案中，该组合物有效抑制或预防多聚体胆色素原合成酶的活性形式的形成并从而抑制或预防细菌，古细菌和/或真核生物的增长或生长，假设多聚体胆色素原合成酶的活性形式不含有变构的镁结合位点和催化的锌。在本实施方案的一个变体中，该组合物有效治疗或预防由接触细菌，古细菌和/或真核生物引起的疾病。在本实施方案的一个变体中，该组合物是药物、牙膏、肥皂、消毒剂中的至少一种。
还提供抗除草剂的植物，其对主要以拥抱二聚体的多聚体形式存在的多聚体胆色素原合成酶是转基因的。在某些实施方案中，该多聚体胆色素原合成酶来自人。在某些实施方案中，该多聚体胆色素原合成酶不含有变构的镁结合位点。
还提供一种组合物，其包含结合到不需要锌实现催化功能的多聚体胆色素原合成酶的抑制剂。
还提供影响多聚体蛋白的方法，该方法包括提供包括具有多个单元集合的多聚体蛋白，其中各所述单元包括第一互补表面和第二互补表面以及其中一个单元的第一互补表面与另一个单元的第二互补表面相关，假设该集合是不同四级结构同工型中的至少一种，条件是(1)各所述单元的结构决定所述不同的四级结构同工型的结构，(2)所述单元处于平衡中以及(3)所述不同四级结构同工型的结构影响该多聚体蛋白的功能；提供包括试剂的本发明的组合物，其中该试剂通过结合到该集合上的结合位点而影响平衡；并将该集合与试剂接触，其中该试剂通过结合到结合位点并由此影响所述多聚体蛋白而影响平衡。在该方法的某些实施方案中，影响所述多聚体蛋白包括影响四级结构同工型的形成。在该方法的某些实施方案中，影响所述多聚体蛋白包括影响所述多聚体蛋白的功能。
在该方法的某些实施方案中，单元是选自单体、二聚体、三聚体、四聚体、六聚体和八聚体。
在该方法的某些实施方案中，试剂影响所述多聚体蛋白的功能。
在该方法的某些实施方案中，所述多聚体蛋白的功能是活性并且其中影响是抑制或活化中的至少一种。
在该方法的某些实施方案中，试剂被结合到具有较低活性的四级结构同工型或具有较高活性的四级结构同工型中的至少一种。
在该方法的某些实施方案中，试剂结合到具有较高活性的四级结构同工型。
在该方法的某些实施方案中，所述多聚体蛋白选自胆色素原合成酶和Ia型核糖核苷酸还原酶。
在该方法的某些实施方案中，所述多聚体蛋白是包含八个胆色素原合成酶单体的胆色素原合成酶。
在该方法的某些实施方案中，所述多聚体蛋白是Ia型核糖核苷酸还原酶，而试剂通过选择性结合到对具有较低活性的四级结构同工型独特的结合位点而抑制Ia型核糖核苷酸还原酶。
还提供调节细胞、组织或生物体生理活性的方法，该方法包括提供细胞、组织和生物体，其中细胞、组织或生物体包括的多聚体蛋白含有具有多个单元的集合，其中各单元包括第一互补表面和第二互补表面以及一个单元的第一互补表面与另一个单元的第二互补表面相关，假设该集合是不同四级结构同工型中的至少一种，条件是(1)各所述单元的结构决定所述不同的四级结构同工型的结构，(2)所述单元处于平衡中以及(3)所述不同四级结构同工型的结构影响该多聚体蛋白的功能；并向细胞、组织或生物体提供本发明的组合物，该组合物包括试剂，其中该试剂通过结合到单元上的结合位点并由此影响四级结构同工型的形成和调整生理活性而影响平衡。
还提供抑制多聚体胆色素原合成酶形成活性形式的方法，该方法包括将本发明的组合物施用于多聚体胆色素原合成酶；将组合物与较低活性形式相连；抑制较低活性形式组装形成活性形式并从而抑制多聚体胆色素原合成酶形成活性形式。
还提供操纵植物生长或发育的方法，包括将作为除草剂的本发明组合物施用到植物，其中该植物是除草剂抗性的，并对基本以拥抱二聚体的多聚体形式存在的多聚体胆色素原合成酶是转基因的。在本方法的一个变体中，多聚体胆色素原合成酶不含有变构的镁结合位点。
还提供制备抗细菌表面的方法，该方法包括(1)提供本发明的组合物，其中该组合物有效抑制或防止多聚体胆色素原合成酶活性形式的形成并从而抑制或防止细菌、古细菌、和/或真核生物的增长或生长，假设多聚体胆色素原合成酶的活性形式包含变构的镁结合位点以及该组合物是药物、牙膏、肥皂、消毒剂、抗生物膜组合物和除草剂中的至少一种；(2)提供形成表面基质(matrix)；和(3)将组合物与表面形成基质结合，并从而制备抗细菌表面。在本方法的一个变体中，抗细菌表面防止和抑制生物膜的形成。
附图简述本发明结合下面的附图给予描述，其中对同样元件给予同样标号，其中

图1A显示野生型人PBGS相对于F12L变体的pH变化图。
图1B显示在mono-Q柱上色谱分离野生型人(Wt)PBGS和F12L。
图1C显示野生型(Wt)人PBGS和F12L在12.5％聚丙烯酰胺非变性凝胶电泳的泳动性差异。
图2A显示野生型人PBGS的二聚体、四聚体和八聚体的示意图。
图2B显示人PBGS变体F12L的二聚体、四聚体和六聚体的示意图。
图3A显示PBGS蛋白的两个峰在Q-Sepharose(KCl梯度(---)，A280(-))上的色谱分离。
图3B显示Wt和F12L的两个池相对于野生型(Wt)人PBGS和F12L在非变性凝胶电泳中的泳动性差异。
图3C显示在Sephacryl S300上进一步纯化后Wt和F12L的池I(●)和池II(■)的pH变化图。
图3D显示ALA的活性对浓度的图表，用于确定S300纯化的池I(圆圈)和池II(方块)在pH 7(黑色)和pH 9(灰色)的Km和Vmax值。
图4A显示大肠杆菌(E.coli)PBGS晶体结构的示意图，包括变构的镁的位置。
图4B显示人PBGS八聚体(左)相对于六聚体(右)的亚基界面的示意图。
图5A显示二聚体、六聚体和八聚体PBGS间存在的平衡的示意图。
图5B显示在存在镁的情况下分离的豌豆PBGS，在分析条件和EDTA浓度增加的情况下非变性凝胶电泳。
图6显示根据存在变构的镁(Mg)(方格区域)，没有变构的镁(白色区域)，存在活性位点锌(深灰色区域)，和不存在活性位点锌(白色区域)的独立隔离标准对PBGS的分类。得到的矩阵(最右)由四个象限组成，其中西北象限(NW象限)代表+Zn/-Mg，东北象限(NE象限)代表-Zn/-Mg，西南象限(SW象限)代表+Zn/+Mg，以及东南象限(SE象限)代表-Zn/+Mg。
图7A显示真核生物和古细菌PBGS序列活性位点金属结合残基的比对，序列于2002年4月在GenBank和其他可网络检索的基因组获得。
图7B显示真细菌PBGS序列活性位点金属结合残基的比对，序列于2002年4月在GenBank和其他可网络检索的基因组获得。
图8是包括细菌、古细菌和真核生物的PBGS来源的分类，其中PBGS的金属结合性质的分配根据图6编码。
图9A显示E.coli PBGS的一个二聚体的立体图，其中蛋白亚基显示为带状图。活性位点锌离子显示为浅灰色球(sphere)，而变构的镁离子显示为黑色球。
图9A显示E.coli PBGS的一个二聚体的立体图，其中蛋白亚基显示为带状图并以黑色和浅灰色着色。活性位点锌离子显示为灰色球(sphere)，而变构的镁离子显示为黑色球。活性位点配体未显示。
图9B显示活性位点锌的结构细节的立体图。半胱氨酸配体被标记而半胱氨酸的硫原子被显示为白色球。水被标记。活性位点配体4，7-DOSA被显示为灰色，而氧原子为球形。
图9C显示变构的镁结合位点的结构细节的立体图。白球表示在邻近残基的镁和氧和氮原子之间形成延伸的连接网络的水分子。包含在这个网络中的氨基酸显示为棒形，碳的颜色根据图9A的链为浅或深色。包含在连接网络中的氧或氮原子以对比的阴影显示。标记的氨基酸E231是镁的第一配位层中唯一的氨基酸。R11来自拥抱二聚体相邻亚基的N末端臂。
图10显示本发明抑制过程的实施方案的示意图，其中本发明的抑制剂(由圆圈表示)结合到二聚体或六聚体PBGS的一个或多个结构域以抑制形成八聚体，稳定结合的形式并移动平衡。
图11是蛋白的两个同工型之间平衡的两维示意图，其显示能够影响蛋白功能的试剂在单元的一种形式上具有结合位点而在另一种形式上不具有。在这两种情况下，多聚化的规则是将一条粗线与一条虚线并置。
图12是蛋白的两个同工型之间平衡的两维示意图，其显示平衡必需能经历不同单元的互换。
图13是多种四级结构同工型和单元与寡聚体之间的平衡的两维示意图。其显示蛋白亚基的四种不同构型(多聚体蛋白)。多聚体蛋白可以是二聚体(此处显示为椭圆形)，三聚体(显示为球形)，和四聚体(显示为方形)。单元的形状控制多聚体蛋白的形状，例如，有可以形成二聚体、三聚体和四聚体的单元；此外，也有不能寡聚化的单元。该图显示单元必须经历特定的构型转换以形成某种形状的寡聚体(同工型)。在各种情况下，单体的结构规定了寡聚体的状态，而寡聚体的状态规定了功能特征。在各种情况下，必须利用单元的两种不同构型以在多聚体之间平衡。
图14是单元和包含变构调节因子(试剂)的寡聚体之间平衡的两维示意图。变构调节因子显示为结合到单元或多聚体蛋白的填充的灰色体。变构调节因子能干扰寡聚体状态之间的平衡。
图15显示当S756393拟合到六聚体铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PBGS模型中的结构(空间填充)。
图16A在不同的分析时间测量的A555值(未填充的圆圈形成不使用抑制剂的曲线(Kd＝3.5μg/ml)而填充的圆圈形成使用迷迭香酸的曲线(Kd＝13.5μg/ml)。
图16B是显示比活性对抑制剂浓度的图(未填充的圆圈形成未使用迷迭香酸的曲线而填充的圆圈形成使用62.5mM迷迭香酸的曲线)。
图16C显示抑制与稳定豌豆PBGS的较小寡聚体形式有关(10mg/ml豌豆PBGS，与迷迭香酸预孵育30min。IC50＝62.5mM)。
发明详述本发明来自发明人对四吡咯生物合成基础科学的研究。本发明提供考虑不同的寡聚化状态，例如那些与信号和细胞周期调控相关的寡聚化状态是如何能够上调或下调途径的新方法。根据本发明，任何变构调节可以通过morpheins之间的平衡来定义的蛋白，其活性可以被结合到一个或另一个morpheins的独特表面特征并移动四级结构形式的平衡的试剂(如小分子)调节。
根据本发明的某些实施方案，四吡咯生物合成可以通过调节PBGS的morpheins之间的平衡而调节。根据本发明的某些实施方案，抑制剂分子可以被发现其优选与PBGS六聚体的独特表面组分相互作用，并取代morpheins向六聚体形式的分配(其在植物和一些细菌PBGS中被认为是非活性形式)。
有利的是，本发明提供一种组合物，其包括通过结合到多聚体蛋白的结合位点并从而影响单元的平衡而影响多聚体蛋白的试剂，其中所述多聚体蛋白包括具有多个所述单元的集合，其中各所述单元包括第一互补表面和第二互补表面以及其中一个单元的第一互补表面与另一个单元的第二互补表面相关，假设该集合是不同四级结构同工型中的至少一种，条件是在所述多聚体蛋白中(1)各所述单元的结构决定所述不同的四级结构同工型的结构，(2)所述单元处于平衡中以及(3)所述不同四级结构同工型的结构影响该多聚体蛋白的功能。本发明的组合物可以用于抑制或防止细菌、古细菌、和/或真核生物在人或动物宿主中的增长或生长。例如，本发明的组合物可以用于药物、牙膏、肥皂、消毒剂、抗生物膜组合物和除草剂形式。本发明提供选择靶生物体并影响该生物体以获得所需效果的指南。
多聚体蛋白的单元可以是，例如单体、二聚体、三聚体、四聚体、六聚体和八聚体。在某些实施方案中，影响所述多聚体蛋白包括影响四级结构同工型的形成。在某些实施方案中，影响所述多聚体蛋白包括影响所述多聚体蛋白的功能。所述多聚体蛋白功能非限制性的例子是活性并且其中影响是抑制或活化中的至少一种。如下文所述，根据本申请，试剂可以结合到具有较低活性的四级结构同工型或具有较高活性的四级结构同工型中的至少一种，从而抑制或活化多聚体蛋白。
示例性的多聚体蛋白是胆色素原合成酶和Ia型核糖核苷酸还原酶。因此，在某些实施方案中，该试剂是结合到具有较低活性的四级结构同工型的抑制剂，以及其中四级结构同工型含有少于八个胆色素原合成酶单体。相似地，当多聚体蛋白是Ia型核糖核苷酸还原酶，该试剂通过选择性结合到对较低活性四级结构同工型独特的结合位点而抑制Ia型核糖核苷酸还原酶。
本发明现在将描述使用PBGS作为多聚体蛋白的例子。因此，本发明提供一种组合物，其包括抑制剂，该抑制剂通过结合到具有第二数量单体的较低活性形式的多聚体胆色素原合成酶而抑制具有第一数量单体的多聚体胆色素原合成酶活性形式的形成，其中单体的第一数量多于第二数量。
本发明发现PBGS能够以至少两种替换的四级结构，八聚体和六聚体存在。具有较少数量PBGS单体的多聚体PBGS也包括在本发明中。之前，只知道存在八聚体形式。在两种形式中，单体包含包括C末端300个氨基酸的α8β8桶，其中α8β8桶的中央包含活性位点。该亚基的可变长度N末端部分形成延伸的臂结构，其与两种寡聚体形式即八聚体和六聚体中广泛的亚基间相互作用有关。这两个四级结构的主要差别是N末端臂的构型。
在某些实施方案中，多聚体胆色素原合成酶来自细菌、古细菌或真核生物，假设八聚体胆色素原合成酶包含变构的镁结合位点。在本实施方案的一个变体中，多聚体胆色素原合成酶包含催化的锌结合位点。
下面的概念和定义用于帮助本领域技术人员理解对本发明的详细描述。
MORPHEINS概念现代生物化学的一个教条是蛋白质的三维结构是该蛋白质的氨基酸序列直接决定的。结果，我们被教导一个蛋白的序列决定了其天然结构。朊病毒的发现挑战了一个结构的概念，但是如果有人认为那是“错误折叠”的话，则他会坚持上述的教条。本发明得出了新的发现，即morpheins，其是交替的蛋白四级结构，单体单元的构型改变的生理学相关的结果。就morpheins而言，交替的天然状态彼此能量接近，但是各状态规定不同的有限四级结构多样性，如图11-14示意性所示。morpheins的第一个例子是胆色素原合成酶(PBGS)系统，其中四级结构平衡形成变构现象的结构基础。
在图11-14中，基础结构单元是单体，任何两个单元的结合受到邻近粗线放置虚线的驱动。这是集合的规则。图13两维地显示集合的多样性受基础结构单元(显示为单体)形状和集合规则的指导的概念。在图13中基础单元有四种不同形状。左下角的单体pac-man-like形状不能与其自身以相邻粗线放置虚线的方式结合在一起，该单体不能寡聚化。半椭圆单体形状能够与其自身结合到一起形成二聚体。一旦形成二聚体，所有的虚线与所有的粗线相邻，寡聚化以二聚体结束。馅饼楔形物形状可以以相同的方式与其自身结合，但一个形状需要三个单元以使得所有的虚线与所有的粗线相邻。这个馅饼楔形物单体的命运是寡聚化为三聚体。最后，根据相同的逻辑，方形单体形式的命运是形成四聚体集合。采用morphein概念，各单体具有不同的生理相关的功能特征，例如不同的Km和Vmax值。例如，一个多聚体可以是变构的“打开状态”具有高酶活性而另外的多聚体可以是变构的“关闭状态”具有低活性。或者，不同的寡聚体的功能可以是寡聚体分子表面差异的结果。例如，图11-14中三聚体的圆形表面将与和二聚体的椭圆表面和四聚体的尖表面不同的受体和结合伴侣相互作用。这些分子表面差异规定复合物的细胞定位。
变构是总的概念，其中酶的活性受变构调节分子结合到蛋白上非催化位点的结合位点的影响。大多数变构调节的模型建议活性的和非活性的状态是相同多样性的寡聚体，以及这两种形式处于彼此的平衡，并且变构调节分子的结合可以移动该平衡。总的来说，结构信息(例如三维X射线晶体结构)不足以了解变构调节因子结合的位置，两种形式彼此如何产生差异，为什么一种形式比其他形式活性更高。我们最近发现胆色素原合成酶(PBGS)的两种不同的四级结构形式，其中可以检查这些形式并推断一些生物体通过镁变构调节PBGS的合理解释。该发现是morpheins的第一个具体例子并详细描述于本申请中。然而，对PBGS交替的四级结构的观察导致对morpheins概念作为蛋白功能的调节机制的总描述和对能够捕获一种或另一种morpheins形式以指导蛋白功能的试剂的描述。图11示例了使用例如图13所示的四聚体和三聚体的这种概念，但添加了裂片以说明变构调节因子只能结合到四聚体。裂片的结合干扰四级结构的平衡并使系统朝向四聚体形式。图14说明能捕获蛋白的所需四级结构状态并因此将平衡拉向这个状态的试剂(显示为楔形物)的概念。因此，这些将干扰morpheins四级结构平衡的试剂能够抑制或活化蛋白。在本发明的一个实施方案中，该试剂是抑制剂，其捕获非活性形式并因此阻止形成活性形式。在一个实施方案中，该蛋白是PBGS，非活性形式是六聚体而活性形式是八聚体。该抑制剂的非限制性的例子是迷迭香酸或其衍生物。在本发明的另一个实施方案中，试剂是激活剂，其捕获该蛋白的活性形式。
术语“启动子”或“启动子区域”指通常在编码序列上游(5’)发现的核酸序列，其通过提供RNA聚合酶的识别位点或在正确的位置启动转录必需的其他因子来控制信使RNA(mRNA)的产生而控制编码序列的表达。这里所述的启动子或启动子区域包括通过连接到各种调控序列，随机的或控制的突变，和添加或重复增强子序列而衍生的启动子变化。此处公开的启动子序列，和生物功能等同物当被作为合适的重组载体的一部分引入到宿主中后负责驱动在其控制之下的编码序列转录，正如其产生mRNA的能力来体现。
“再生”指从植物细胞(例如植物原生质体或外植体)生长植物的过程。
“转化”指向细胞或原生质体中引入外源核酸序列(例如，载体，重组核酸分子)的方法，其中外源核酸被整合到染色体中或能够自主复制。
“转化细胞”是已经通过引入外源核酸分子到细胞中而改变DNA的细胞。
术语“基因”指染色体DNA，质粒DNA，cDNA，合成DNA，或其他编码肽、多肽、蛋白的DNA，或RNA分子和与表达调控有关的编码序列的两翼区域。
短语“对启动子区域异源的DNA片段”表示编码DNA区段不天然存在于与目前和启动子连接的相同基因中。
术语“编码DNA”指编码此处讨论的任何酶的染色体DNA，质粒DNA，cDNA，或合成DNA。
术语“基因组”当其用于细菌时既包括细菌宿主细胞内的染色体也包括质粒。引入到细菌宿主细胞中的本发明的编码DNA因此或是染色体整合或是定位于质粒中。术语“基因组”当其应用于植物细胞时不仅包括在细胞核内发现的染色体DNA中，还包括在细胞的亚细胞组分中发现的细胞器DNA中。本发明引入到植物细胞中的DNA因此或是染色体整合或是定位于质粒中。
术语“除草剂”指用于杀死或抑制植物、植物细胞、植物种子或植物组织生长的化学物质。
术语“抑制剂”指灭活蛋白例如对生物体的生长或生存来说关键的生物合成酶、受体、信号转导蛋白、结构基因产物和运输蛋白的酶活性的化学物质。在本发明的上下文中，抑制剂是灭活胆色素原合成酶的酶活性的化学物质。术语“除草剂”此处用来定义施用于植物、植物细胞、植物种子或植物组织的抑制剂。
术语“微生物”或“微生物体”指藻类、细菌、古细菌、真菌和原生动物。
“过量表达”指由引入到宿主细胞的DNA编码的多肽或蛋白的表达，其中所述多肽或蛋白或是不正常地存在于宿主细胞中，或是所述多肽或蛋白以比通常由编码所述多肽或蛋白的内源基因表达更高的水平存在于所述宿主细胞中。
术语“植物”指处于任何发育阶段的植物或植物的部分。此处还包括插条，细胞或组织培养物和种子。本发明中使用的术语“植物组织”包括但不限于整个植物、植物细胞、植物器官、植物种子、原生质体、愈伤组织、细胞培养物和组织形成结构和/或功能单元的植物细胞的任何群体。
术语“质体”指包括造粉体，叶绿体，有色体，造油体，eoplasts，黄化质体，白色体和原质体的植物细胞细胞器种类。这些细胞器是自主复制度并包含通常称作“叶绿体基因组”的环状DNA分子，其大小范围从大约120kb到大约217kb，取决于植物种类，并通常包含反向重复区域。
术语“固体”指块茎(如土豆中)或果实(如西红柿中)的非水性组分，主要包括淀粉和其他多糖，简单糖，非结构糖类，氨基酸和其他有机分子。
术语“耐受/抵抗”指当暴露于抑制剂或除草剂后继续正常生长或起作用的能力。
术语“转化”指向细胞、组织或植物中引入异源DNA的过程。转化的细胞，组织或植物被理解为不仅包括转化过程的终产物，还包括其转基因后代。
“口用组合物”是一种产品，其在通常使用过程中为全身给药具体治疗剂的目的不是有意被吞服，而是为口腔活性的原因保留在口腔中一段足够长的时间以基本接触所有的牙齿表面和/或口腔组织。口用组合物可以是单相口用组合物或可以是两种或更多种口用组合物的组合。
此处使用的术语“口服可接受的载体”表示合适的媒介，其能被用于以安全和有效的方式施用本发明组合物至口腔。这样的媒介物包括的材料例如氟离子源、另外的抗结石剂，缓冲剂、其他的研磨材料，过氧化物源，碱金属碳酸氢盐，增稠剂，保湿剂，水，表面活性剂，二氧化钛，香料系统，甜味剂，木糖醇，着色剂及其混合物。
术语“morpheins”在本发明公开中被用于描述具有不同功能特性(例如，不同的催化性质)的蛋白的不同四级结构同工型。用于这些四级结构同工型的另外的术语包括“quatreins”，“isoquatomers”和”selkeins”。选择后面的术语是根据神话中的selkie，其能够对应于特异的刺激而改变形式和功能。就植物和一些细菌PBGS而言，在morpheins之间转换的刺激是变构调节因子，即，试剂(如，镁)。
给定的蛋白的Morpheins在二级和三级结构上有部分差异，这些差异决定了四级结构的差异。在某些方面，morpheins类似朊蛋白；一个蛋白的序列可以经历构型改变，其产生四级结构的变化(聚集状态)。然而，在另外的方面，morpheins与朊蛋白的差异在于寡聚体属于固定多样性而且四级结构的改变是不可逆的，非致病性的，以及是正常生理调控过程的一部分。
因此，在本发明中，建议使用morpheins(四级结构同工型)的变构调节的总机制。在该机制中，单体结构不同于他们的二级/三级结构的某些方面，而这些差异决定了集合成为一种或另一种morphein。该机制示意性显示于图11-14中。
图11是蛋白(morpheins)的两种形式之间的平衡的两维表示。一种形式的单元(如，单体)(此处显示为方块)含有四种不同的表面，为线、粗线、虚线和曲折线。自然相连的互补表面在此描述成粗线和虚线。这种联系限定了单元之间接合的规则。当方块的亚基联系潜能被满足(换句话说当所有的粗线与所有的虚线联系时)，得到的最优化的集合是四聚体。因此，寡聚体集合由单体的结构和接合的规则规定。如图11所示，方块结构与“裂片(splinter)”联系，其是试剂(例如，变构调节因子分子)的图示形式；将方块单体和方块四聚体与裂片联系影响多聚体蛋白的功能，例如就植物和一些细菌PBGS而言，镁提供这些蛋白形式的稳定性。
方块单元与另一结构处于平衡，后者与前者有一些然而不是全部的二级和三级结构相同，因此只共有一些表面特性。交替的单元显示于图11中的区段。该单体含有由粗线和虚线描述的表面；这些表面之间接合的规则与方形单元的规则相同。结果，遵循这一接合规则，交替的单元组装成为三聚体。三聚体结构和其单独的组分不含变构调节因子分子(裂片)的结合位点是重要的。因为裂片稳定方块及其寡聚体，存在裂片将把四级结构的平衡拉向方块和其寡聚体。
对六聚体PBGS的观察提供了四级结构如何用作变构调节蛋白功能的结构基础的第一个例子。在来自光合成生物和一些细菌的PBGS中，比活性的蛋白浓度依赖性提供了全活性(假定是八聚体)形式和灭活(假定是六聚体)形式之间的平衡的证据(参见图5A)。
图11是对PBGS行为总体的描述。就PBGS而言，方形是拥抱二聚体而区段是分开的二聚体。在各情况下，有些结构相同，但不是所有的表面特征相同，表面之间的接合规则必定是在两个交替的结构之间共有的第一近似值。就PBGS而言，寡聚体结构的差异转变为功能特性的差异。可以合理地假设其他蛋白的不同四级结构也转变为功能特性的差异。已经公知受体的二聚化与信号转导有关。在本发明之前尚未被认识的是，二聚体结构内单体的结构可以与当该单体的结构不处在二聚体结构时是不一样的。
含有morpheins的蛋白另一个非限制性的例子是Ia型核糖核苷酸还原酶。为Ia型核糖核苷酸还原酶变构调节提出的最新模型描述四聚体和六聚体之间的平衡(Cooperman和Kashlan，2003，Adv.In EnzymeRegulation，43167-187)。在该例子中，模型只是用于示例的目的而作者不具有蛋白结构来定义假定的morpheins的差别。然而，核糖核苷酸还原酶对于DNA的从头生物合成是关键的，Ia型酶在所有真核生物中发现，而抑制DNA的从头生物合成是癌症化学治疗的合理途径。因此可以通过选择性地将效应物结合到对较低活性morphein独特的表面而实现影响Ia型核糖核苷酸还原酶的功能(例如，抑制)。
本发明的多聚体蛋白应该具有至少一个特性，例如蛋白浓度依赖的比活性或通过例如离子交换、非变性凝胶电泳，分析超离心，大小排阻层析(依据大小)而分离成为不同的集合的能力。
为证明上述平衡，可以进行动力学研究以显示例如Km和Vmax；适用MM等式的作为底物浓度函数的活性；morpheins不能很好地拟合双曲线而是拟合双双曲线(参见Nature Structure Biology)。
多聚体蛋白功能非限制型的例子是酶活性和与其他分子相互作用的能力，例如，结合不同蛋白的能力。该功能可以被抑制或增强。监测功能的改变可以通过例如监测本领域技术人员理解的动力学参数Km和Vmax来进行。在本发明的某些实施方案中，通过稳定较低活性的morphein来抑制蛋白的功能。
在某些实施方案中，试剂影响多聚体蛋白的功能。多聚体蛋白的功能非限制性的例子是活性，其中影响是抑制或活化中的至少一种。在某些实施方案中，试剂与具有较低活性的四级结构同工型有关。在某些实施方案中，试剂结合到具有较高活性的四级结构同工型。下文描述抑制八聚体PBGS的试剂的非限制性的例子。
PBGS的八聚体形式以生理相关的浓度范围结合到底物，并且在生理pH下是有活性的。八聚体由四个拥抱二聚体组成，其中一个亚基的臂以强的桶对桶相互作用抱紧相邻亚基的桶状结构。
新发现的八聚体形式PBGS是在生物体的子集中调控四吡咯生物合成的关键组分，该子集包括植物和一些致病细菌，但不包括人，动物和真菌。六聚体形式在生理条件下基本是无活性的。具体而言，六聚体不能在生理相关浓度范围内结合底物，因为其Km值比八聚体的Km值大至少两个数量级。六聚体由三个分开的二聚体组成，其中N末端臂不与相邻亚基以强的桶对桶接触相互作用。
六聚体和八聚体形式之间的转换包括蛋白结构的显著改变。参见，如图5A。本发明的某些实施方案涉及抑制从六聚体到八聚体的结构变化，以抑制植物和/或细菌中PBGS的活化和四吡咯的生物合成。由于抑制机制对植物和细菌有效，而对动物无效，本发明提供了抑制细菌、抗菌和除草剂应用的新途径。
因此，在某些实施方案中，本发明包括那些PBGS在生理条件下被镁调控后从六聚体向八聚体转换的抑制剂。抑制剂可以是已知的或新的化合物。抑制剂在植物和细菌病原体的生长和增长过程中生理上显著进行六聚体向八聚体转换的时候有效抑制四吡咯的生物合成。对从六聚体PBGS向八聚体PBGS的四级结构转换的抑制是开发抗生素和除草剂的新靶。
PBGS蛋白的系统发生过程中有一些变异，其中一些蛋白具有变构的镁，而其他蛋白不具有。具有变构的镁的PBGS包括古细菌域，除红细菌(Rhodobacter)属以外的所有细菌和所有光合成的真核生物域(如绿色植物)(24)。最近另一例外是疟疾寄生虫疟原虫(Plasmodiumfalciparum)。根据发明人先前确定的大肠杆菌(E.coil)PBGS的晶体结构和此处公开的六聚体PBGS的结构，看来变构的镁的作用是诱导低活性六聚体和高活性八聚体之间的结构转换。Mg作用于PBGS上的六聚体-八聚体转换是变构调节蛋白功能的新型结构范例。
E.coli PBGS的结构显示于图9A-C并用于显示PBGS结构中常见的金属结合变异。各E.coli PBGS单体含有两个金属离子，这两个在系统发生上都不是保守的。活性位点含有对E.coli PBGS活性关键的锌离子，但其三个半胱氨酸配体在许多PBGS中不存在。锌在第二底物分子(33)的结合和反应性中起作用。锌位点的细节显示于图9B。此外，变构的镁可见与相邻亚基的N末端臂在各α，β桶的界面处结合，结构细节显示于图9C。结合变构的镁的序列决定簇不存在于所有PBGS中。
图6显示根据PBGS是否使用活性位点锌和是否使用变构的镁将其分为四类(24)的示意图。第一矩阵(最左)分为两类(a)左边的活性位点锌(阴影)，和(b)右边的无活性位点锌(无阴影)。第二矩阵被分为两类(a)顶部的无变构的镁(菱形)，和(b)底部的变构的镁(方块)。组合两个矩阵提供由四个象限组成的矩阵(最右)，其中西北象限(QNW)代表+Zn/-Mg，东北象限(QNE)代表-Zn/-Mg，西南象限(QSW)代表+Zn/+Mg，东南象限(QSE)代表-Zn/+Mg。
发明人以前定量了(24)已知序列向四个象限的下列分配QNW＝9；QNE＝2；QSW＝55和QSE＝63。因此，目前可用序列大约一半编码需要的活性位点锌，而另外一半相反(即，QNW+QSW～QNE+QSE)。与活性位点金属模式的分配相反，超过90％的PBGS序列含有变构的镁结合的决定簇(即，QSW+QSE＞＞QNW+QNE)。
抑制剂对于含有变构的镁而不含有活性位点锌的PBGS的亚组(即，QSE内的PBGS)最有效。这些亚组是光合成的真核生物和细菌的亚组，包括病原体例如铜绿假单胞菌。这些PBGS蛋白引发蛋白浓度依赖的比活性性质，其指示了活性较大的四级结构形式和活性较小的四级结构形式之间的相互转换。另外参考NE象限，其中初步证据表明活性形式是六聚体。
因此，在某些优选的实施方案中，本发明的抑制剂有效抑制来自细菌、古细菌或真核生物的八聚体PGBS的形成，假设八聚体PGBS含有变构的镁结合位点。可以被本发明的组合物抑制的八聚体PGBS源的非限制性的列表显示于图8，其是包括细菌域、古细菌域和真核生物域的生物体的分类。图7A和7B代表于2002年4月从GenBank和其他可网络检索的基因组获得的PBGS序列的活性位点金属结合残基的比对。基于图7显示的信息将生物体分配到图6的四个象限之一。富含半胱氨酸的丛(人PBGS第122，124和132位)结合位于活性位点盖子(lid)上的精氨酸残基(人PBGS第221位)显示活性位点锌结合位点的存在。不具有富含半胱氨酸位点锌结合丛的种类反而含有富含天冬氨酸的区域和活性位点盖子残基是赖氨酸。
在本发明的某些实施方案中，抑制剂取代金属离子从而结合在金属离子结合位点，优选金属离子是锌或镁。在本发明的某些实施方案中，抑制剂结合在活性位点。抑制剂可以结合在任何地方，但结合位点必须稳定一种四级结构。优选结合至在一种多聚体而不在另一种多聚体中存在的位点。
本发明的抑制剂可以使用以下方案鉴定。首先，提供包含变构的镁而不包含活性位点锌的六聚体形式PBGS的模型。最初的模型可以是例如豌豆PBGS之一。其次，计算机虚拟筛选小分子数据库以寻找会适合到与亚基的N末端部分相邻的不能实施拥抱的结构域的分子。不能实施拥抱的结构域是分开的二聚体的至少一个区域，抑制剂结合到该区域上抑制二聚体的臂抱紧二聚体的桶，而这是形成另一个二聚体以形成活性八聚体所必须的。参见图10，其中圆圈代表抑制剂。不能实施拥抱的结构域的可能位点位于抱紧臂结合亚基主体的结合处(即，位于“腋窝”处)之下。理论上合适的分子将通过测定它们对豌豆PBGS的蛋白浓度依赖的比活性的作用而在体外按经验测定，这可以使用人工基因构建体获得。这些以蛋白浓度方式抑制蛋白比活性的分子是良好的候选抑制剂。
以下的方法将允许鉴定结合到任何地方的抑制剂，不必须在PBGS上的不能实施拥抱的结构域以抑制八聚体形成。PBGS比活性的功能分析将被首先用于从计算机筛选中鉴定的可得到的分子中选择潜在的抑制剂，所述分子例如对人无害的物质。在选择了潜在的抑制剂后，它们将根据蛋白浓度进一步筛选对比活性的影响。
因此，本发明提供影响多聚体蛋白的方法，该方法包括提供包括具有多个单元集合的多聚体蛋白，其中各所述单元包括第一互补表面和第二互补表面以及其中一个单元的第一互补表面与另一个单元的第二互补表面相关，假设该集合是不同四级结构同工型中的至少一种，条件是(1)所述单元的结构决定所述不同的四级结构同工型的结构，(2)所述单元处于平衡中以及(3)所述不同四级结构同工型的结构影响该多聚体蛋白的功能；提供包括试剂的本发明的组合物，其中该试剂通过结合到该集合上的结合位点而影响平衡，并将该集合与试剂接触，其中该试剂通过结合到结合位点并由此影响所述多聚体蛋白而影响平衡。在该方法的某些实施方案中，影响所述多聚体蛋白包括影响四级结构同工型的形成。在该方法的某些实施方案中，影响所述多聚体蛋白包括影响所述多聚体蛋白的功能。
还提供抑制多聚体胆色素原合成酶形成活性形式的方法，该方法包括将本发明的组合物施用于多聚体胆色素原合成酶；将组合物与较低活性形式联系；抑制较低活性形式组装形成活性形式并从而抑制多聚体胆色素原合成酶形成活性形式。抑制剂非限制性的例子是迷迭香酸或其衍生物。
本发明组合物物优选的应用是用于抑制或防止人或动物宿主中细菌域、古细菌域和/或真核生物域的增长或生长。本发明组合物的其他应用包括预防或抑制各种表面包括牙齿、管道、轮船或浸没于水/空气混合物中的任何表面的生物膜，上述各种表面可能发现导致损失的细菌。因此，例如，本发明的组合物可以有效预防或抑制藤壶在轮船表面的生长。
取决于靶向的生物体，本发明的组合物可以用于预防或防止由某些种类导致的损失。QSE中的生物体的例子在表1，所以这些生物体是施用本发明的组合物的主要靶。使用表1作为指南，本发明组合物的各种应用可以设想为，例如药物、牙膏、肥皂、消毒剂、抗生物膜组合物和除草剂。
表1具有SE象限的PBGS的细菌
有利的是，本发明的组合物有效治疗或预防由细菌、古细菌和/或真核生物引起的疾病。该组合物有效防止形成多聚体PBGS(如，八聚体PBGS或具有较少数量单体的其他活性形式)并从而抑制或防止细菌、古细菌和/或真核生物的增长或生长。在某些实施方案中，多聚体PBGS含有变构的镁结合位点。在该实施方案的一个变体中，该组合物有效治疗或预防由于接触细菌、古细菌和/或真核生物而导致的疾病。在该实施方案的另一个变体中，该组合物是药物、牙膏、肥皂、消毒剂、抗生物膜组合物和除草剂中的至少一种。
在某些实施方案中，该组合物不包括变构的镁结合位点和催化的锌。在该实施方案的一个变体中，该组合物有效治疗或预防由于接触细菌、古细菌和/或真核生物而导致的疾病。在该实施方案的另一个变体中，该组合物是药物、牙膏、肥皂、消毒剂中的至少一种。
抗生素，除草剂和杀真菌剂通常基于对细菌、植物或真菌特异的而不存在于人/动物中的关键途径的抑制。例如，1)青霉素类抗生素针对细菌细胞壁的生物合成，而动物细胞没有细胞壁，或2)除草剂草甘膦针对芳香氨基酸生物合成，而人不具有该途径，我们必须食用芳香氨基酸。随着我们对不同蛋白/酶的序列和结构的差异了解越多，越有可能靶向普遍存在于动物、植物、细菌、真菌中的关键途径。通过抑制PBGS而靶向四吡咯生物合成途径作为抗微生物剂或除草剂的基础就是这样的情况。在系统发生中各种生物PBGS金属结合位点的变异为开发不抑制人PBGS的抑制剂提供了足够的结构差异。就PBGS而言，PBGS在morphein形式和在morphein表面的氨基酸序列之间平衡的固有能力，不同生物有着显著的差异。就通过选择性稳定一种morphein形式而更普遍地抑制蛋白功能而言，可能的情况是，靶是不存在于人中的途径，或者可能的情况是，靶只在活性位点外具有足够的系统发生变异，因morpheins的表面差别很大。
在某些实施方案中，该组合物除了试剂外包括药物可接受的介质。“药物可接受的介质”表示的介质，例如能够以相对安全和有效的方式递送抑制剂以及组合物中其他任何活性试剂至靶生物体的溶剂。该介质本身不需要具有任何药物活性。
这里使用的“药物可接受的介质”包括任何和所有的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和延缓吸收剂等。这种介质和试剂用于药物活性物质是本领域公知的。除了目前所知的任何与本发明的抑制剂不匹配的常规介质或试剂之外，都可考虑在药物组合物中的应用。补充的活性成分也可以掺入到组合物中。
作为游离碱或药物可接受盐的活性成分的溶液可以通过在水中与表面活性剂，例如羟丙基纤维素合适地混合而制备。分散系还可以在甘油、液体聚乙二醇，以上两者的混合物和在油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制品包括防止所有微生物生长的防腐剂。
本发明的组合物可以包括传统的药物制品。本发明组合物的给药将经由任何常见途径，只要靶组织可以通过该途径是可获得的。途径包括口、鼻、颊、直肠、阴道或局部。另外，给药可以通过原位的、皮内的、皮下的、肌内的、腹膜内的或静脉内的注射。这些组合物正常情况下将以上述药物可接受的组合物给药。
本发明的组合物以液体溶液或悬液的可注射组合物的形式有利地给药，也可以制备注射前在液体中适于制成溶液或悬液的固体。这些制品也可以被乳化。用于这一目的的典型组合物按每毫升磷酸盐缓冲液包括50mg或直至大约100mg的人血清白蛋白。其他药物可接受的载体包括水溶液，无毒赋形剂，包括盐、防腐剂、缓冲剂等。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。水相载体包括水、醇/水溶液、盐水溶液，胃肠道外的媒介例如氯化钠、Ringer氏葡萄糖等。静脉内媒介包括液体和营养补充物。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。药物中不同组分的pH和实际浓度根据公知的参数调整。
其他的制品适合用于口服给药。口服制品包括典型的赋形剂，例如药物等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。组合物采取溶液、悬液、片剂、丸剂、胶囊、缓释剂或粉末的形式。当给药途径是局部时，药物形式可以是乳膏、油膏、软膏或喷剂。
治疗剂的有效量根据预计的目标来决定。术语“单位剂量”指适合给对象使用的物理上不连续的单位，各单位包含预定量的药物组合物，该量被计算以产生与其给药有关的所需反应，所述给药即合适的途径和治疗方案。待给药的量，根据治疗的次数和单位剂量，取决于待治疗的对象、对象的状态和所需的保护。药物组合物的精确量还取决于执业医师的判断并且对各个体是独特的。
本发明组合物的另一应用是除草剂，其中该组合物另外包括有效除草的介质。“有效除草的介质”表示介质，例如能对靶生物体递送抑制剂以及组合物中其他任何活性试剂的溶剂。该介质本身不需要具有任何除草活性。
对作物施用抗细菌组合物的指南提供如下由于所有的光合成真核生物都落入图6的QSE象限，它们本身是本发明抑制剂的靶。然而，图10显示的腋窝抑制剂结合位点在植物和细菌之间具有显著的系统发生的差异。
因此，作为作物抗细菌喷剂的试剂必须是那些结合到细菌PBGS的该位点上，而不结合到植物PBGS位点的试剂。
本发明的组合物包括准备立即使用的稀释组合物和需要在使用前通常用水稀释的浓缩组合物。
固体组合物可以是颗粒，和粉末的形式，其中活性成分与磨碎的固体稀释剂，例如高岭土、斑脱土、硅藻土、白云石、碳酸钙、云母、氧化镁粉、Fuller氏土或石膏或其组合相混合。它们还可以采用可分散的粉末或颗粒的形式，包括湿润剂以促进粉末或颗粒在液体中的分散。粉末形式的固体组合物可以作为粉尘施用。
液体组合物可以包括活性组分在水中的溶液、悬液和分散系，所述水任选含有表面活性剂，或可以包括活性组分在水可混溶的有机溶剂中的溶液或分散系，其以小滴分散在水中。除草剂组合物适合在罐中混合以制备准备立即使用的稀释组合物或用于形成浓缩物。
溶液或分散系的制备方法是使活性组分溶解在任选包括湿润剂或分散剂的水或有机溶剂中，然后当使用有机溶剂时，将如上获得的混合物加到任选包含湿润剂或分散剂的水中。合适当有机溶剂包括，例如，二氯乙烯、异丙醇、丙二醇、双丙酮醇、甲苯、煤油、甲基萘、二甲苯或三氯乙烯或其组合。
其他的添加剂和佐剂也可存在于本发明的组合物中。例子包括抗冻剂例如乙二醇和丙二醇；染料；分散剂；流变剂；止泡剂例如基于硅酮的试剂；和湿润剂例如乙二醇。
在此基础上除草剂的开发允许开发除草剂抗性作物，其方法是使这些抗性作物对图6的四个象限中的上部两个象限中的PBGS，例如人PBGS为转基因(即，包含从另外的物种人工转移的遗传物质)。
除草剂抗性植物还提供多聚体胆色素原合成酶转基因的除草剂抗性植物，所述酶基本以拥抱二聚体的多聚体形式存在。在某些实施方案中，多聚体胆色素原合成酶来自人。在某些实施方案中，多聚体胆色素原合成酶不含有变构的镁结合位点。下面提供制备适应于多聚体胆色素原合成酶转基因的除草剂抗性植物的指南。
以双链DNA形式存在的基因在植物中的表达包括信使RNA(mRNA)从DNA的一条链被RNA聚合酶转录，和随后mRNA初级转录本在细胞核内的加工。该加工涉及到3′非翻译区，在RNA的3’末端加上聚腺苷酸。DNA转录为RNA受到通常称作启动子的DNA区域的调节。启动子区域包含发信号给RNA聚合酶，使其与DNA连接并使用DNA的一条链作为模板启动mRNA转录而产生对应mRNA互补链的碱基序列。该mRNA然后被用作模板，通过细胞生物合成机器生产其中编码的蛋白。
在本发明中，选择的启动子应当具有所需的组织和发育的特异性。因此，启动子功能应当通过选择具有所需的组织表达能力和启动力接近的启动子和选择产生所需的PBGS活性的转化子而被优化。从转化子池筛选的方法通常在植物的异源结构基因表达中采用，这是因为植物基因组内的基因插入位点导致在含有相同异源基因的转化子之间存在差异(通常称为“位置效应”)。除了已知导致植物细胞中DNA转录(组成型或组织特异)的启动子，其他的启动子可以通过筛选植物cDNA文库查找选择性地或优选地在所需的时间内表达的基因，然后通过本领域已知的方法分离启动子区域而被鉴定用于本发明中。
在本发明优选的实施方案中，PBGS转基因将响应光而在叶绿体中表达。更具体地，PBGS转基因在细胞核中被转录成mRNA，而mRNA在细胞质中被翻译为前体多肽(叶绿体转运肽(CTP)/PBGS)。前体多肽然后备转运(引入)到叶绿体中。在植物细胞中具活性的数个叶绿体可光诱导的启动子已经在文献中描述。这样的启动子的例子包括来自非常丰富的植物多肽核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)的小亚基的可光诱导的启动子，叶绿素a/b结合蛋白基因启动子和近来被用于光可控启动子系统的光敏色素启动子(Shimizu-Sato等，2002)。这些启动子中一些已经被用于产生在植物中表达的各种类型的DNA构建体；参见例如PCT公开WO 84/02913。
其他已知的或发现导致DNA在植物细胞内响应于光而转录的启动子可以用于本发明。这样的启动子可以从各种来源获得，例如植物和植物病毒，包括但不限于增强的CaMV35S启动子和从植物基因例如核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)的小亚基的基因分离到的启动子。如下文所述，优选选择的具体启动子应该能够导致充分的表达以产生有效量的PBGS酶来生产足够的四吡咯维持生长。在一个实施方案中，所述启动子是渗漏的以提供植物中非光合成功能所必需的四吡咯。
PBGS活性的质体指导的表达在本发明优选的实施方案中，PBGS基因融合到CTP上，以将PBGS蛋白靶向到质体。如下文中使用的叶绿体和质体将包括各种形式的质体，包括造粉体。许多定位于质体的蛋白从核基因表达为前体并通过CTP靶向到质体，CTP在随后的引入步骤中被除去。这样的叶绿体蛋白的例子包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO，SSU)的小亚基，5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)，铁氧还蛋白，铁氧还蛋白氧化还原酶，捕光复合体蛋白I和蛋白II，和硫氧还蛋白F。耐草甘膦的EPSP合成酶植物基因也编码含CTP的多肽，其使得EPSP合成酶多肽被转运进入植物细胞内的叶绿体(U.S.专利5310667)。已经显示非质体蛋白可以通过使用具有CTP的蛋白融合被靶向到叶绿体，而CTP序列足以将蛋白靶向到质体。本领域技术人员也将认识到可以生产利用具体质体转运肽的功能将PBGS酶引入到植物细胞质体中的各种其他嵌合构建体。PBGS基因还可以通过将基因转化到叶绿体基因组而被靶向到质体(Daniell等，1998)。一般来说，诸如CTP的叶绿体吸收信号富含Ser，Thr和小的疏水氨基酸残基。
本发明的DNA构建体产生的RNA还可以包含5′非翻译引导序列。该序列可以衍生自选择用于表达基因地启动子并可以被特异性修饰以增强mRNA的翻译。5′非翻译区还可以从病毒RNAs，从合适的真核基因，或从合成的基因序列获得。本发明不限于非翻译区来自伴随着启动子序列的5′非翻译区的构建体。相反，非翻译的引导序列可以来自不相关的启动子或编码序列。
在单子叶植物中，优选在基因构建体中包含内含子以利于或增强编码序列的表达。合适的内含子的例子包括HSP70内含子和水稻肌动蛋白内含子，两者都是本领域公知的。另一个合适的内含子是蓖麻子过氧化氢酶内含子(Suzuki等，1994)。
多腺苷酸信号嵌合植物基因的3′非翻译区包含在植物中向RNA的3’末端添加多腺苷酸的多腺苷酸化信号。合适的3′区的例子是(1)3′转录的非翻译区，含有农杆菌肿瘤诱导(Ti)质粒基因例如胭脂碱合成酶(NOS)基因的多腺苷酸化信号，和(2)植物基因，如大豆储存蛋白基因和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO，SSU)基因的小亚基。
植物转化/再生在开发本发明的核酸构建体时，构建体的各种组分或其片段将通常被插入到方便的克隆载体，例如能在细菌宿主如E.coli中复制的质粒中。存在许多已经在文献中描述的载体，其中许多可以从商业购得。在各克隆之后，具有所需的插入物的克隆载体可以被分离，并进一步操作，例如限制性酶消化，插入新的片段或核苷酸，连接，缺失，突变，切除等以适应所需序列的组分。一旦构建体已经完成，其然后可以被转移到合适的载体中，根据宿主细胞的转化方式用于进一步操作。
本发明的重组DNA分子通常包括可选择的标记以便转化的细胞可以被容易地鉴定并从未转化的细胞中选择出来。这样的例子包括但不限于新霉素磷酸转移酶(nptII)基因(Potrykus等，1985)，其赋予卡那霉素抗性。表达nptII基因的细胞可以使用合适的抗生素例如卡那霉素或G418选择。其他常用的可选择标记物包括bar基因，其赋予双丙氨膦抗性；突变的EPSP合成酶基因(Hinchee等，1988)，其赋予草甘膦抗性；腈水解酶基因，其赋予溴苯腈(bromoxynil)抗性(Stalker等，1988)；突变的乙酰乳酸合成酶基因(ALS)，其赋予咪唑啉酮或磺脲抗性(欧洲专利申请154,204，1985)；和甲氨蝶呤抗性DHFR基因(Thillet等，1988)。
可以用于表达PBGS转基因的植物包括但不限于，刺槐，紫花苜蓿，小茴香，苹果，杏，朝鲜蓟，芝麻菜，芦笋，鳄梨，香蕉，大麦，豆，甜菜，黑莓，越桔，椰菜，球芽甘蓝，卷心菜，油菜，罗马甜瓜，胡萝卜，木薯，花椰菜，芹菜，樱桃，芫荽叶，柑橘属，克莱门氏小柑橘，咖啡，玉米，棉花，黄瓜，花旗松，茄子，菊苣，茅菜(escarole)，桉树，茴香，无花果，葫芦，葡萄，葡萄柚，蜜瓜(honey dew)，豆薯，猕猴桃，生菜，青蒜，柠檬，酸橙，火炬松，芒果，甜瓜，蘑菇，坚果，燕麦，油菜(oil seed rape)，秋葵，洋葱，橙，观赏植物，番木瓜，欧芹，豌豆，桃子，花生，梨，辣椒，柿子，松树，菠萝，车前草，李子，石榴，白杨，土豆，南瓜，温柏，辐射松(radiata pine)，红菊苣，萝卜，悬钩子，水稻，黑麦，高粱，南方松，大豆，菠菜，南瓜(squash)，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，甘薯，枫香，橘子(tangerine)，茶，烟草，番茄，黑小麦，草皮，藤，西瓜，小麦，山药，和西葫芦(zucchini)。
PBGS基因可以通过任何合适的方法插入到植物基因组中。合适的植物转化载体包括来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti质粒，以及在例如由Herrera-Estrella等(1983)，Bevan(1984)，Klee等(1985)和EPO公开120,516中揭示的载体。除了来自农杆菌的Ti质粒或根诱导(Ri)质粒的植物转化载体，替代的方法也可以用于将本发明的DNA构建体插入到植物细胞中。这样的方法可以包括，例如，利用脂质体、电穿孔、增加游离DNA吸收的化学品，利用微注射轰击的游离DNA递送，和使用病毒或花粉的转化。DNA还可以被插入到叶绿体基因组(Daniell等，1998)。
适合使用微注射轰击在单子叶植物中引入PBGS基因的质粒表达载体包括如下CTP；光可诱导的启动子；PBGS基因；提供利于基因表达的剪切位点的内含子例如Hsp70内含子(PCT公开WO93/19189)；和3′多腺苷酸化序列例如胭脂碱合成酶3′序列(NOS 3′；Fraley等，1983)。这个表达盒可以在适合用于生产大量待注射到植物中的DNA的高拷贝复制子上组装。
用于转化双子叶植物特别有用的基于农杆菌的植物转化载体是质粒载体pMON530(Rogers等，1987)。质粒pMON530是通过向pMON526中转移pMON316 2.3kb StuI-HindIII的片段而制备的pMON505的衍生物(Rogers等，1987)。质粒pMON526是pMON505的简单衍生物，其中SmaI位点通过用XmaI消化，Klenow聚合酶处理和连接而除去。质粒pMON530保留pMON505和CaMV35S-NOS表达盒的所有性质，并且现在在启动子和多腺苷酸化信号之间包含独特的SmaI切割位点。
双载体pMON505是pMON200(Rogers等，1987)的衍生物，其中Ti质粒同源区域LIH被微型RK2质粒pTJS75(Schmidhauser和Helinski，1985)的3.8kb HindIII-SmaI片段取代。该片段包含RK2复制起始点oriV，和转移起始点oriT，用于通过三亲交配方法(tri-parental matingprocedure)(Horsch和Klee，1986)结合到农杆菌中。质粒pMON505保留pMON200的所有重要特征，包括用于插入所需片段的合成的多接头，植物细胞卡那霉素抗性的嵌合NOS/NPTII′/NOS基因，用于在E.coli和根癌农杆菌(A.tumefaciens)中选择的奇放线霉素/链霉素抗性决定簇，易于对转化子及后代中的遗传性进行评估的完整胭脂碱合成酶基因，和便于在E.coli中制备大量载体的pBR322复制起始点。质粒pMON505含有来自pTiT37胭脂碱-型T-DNA右端的的单个T-DNA边界。Southern杂交分析显示质粒pMON505和其携带的任何DNA被整合到植物基因组中，即，整个质粒是插入到植物基因组中的T-DNA。整合的DNA的一端位于右边界序列和胭脂碱合成酶基因之间，而另一端位于边界序列和pBR322序列之间。
另一个特别有用的Ti质粒盒式载体是pMON17227。该载体描述在PCT公开WO 92/04449中并含有编码赋予草甘膦抗性的酶的基因(命名为CP4)，其是对包括土豆和西红柿的许多植物而言优异的选择性标记基因。该基因被融合到拟南芥(Arabidopsis)EPSPS叶绿体转运肽(CTP2)并通过此处描述的FMV启动子表达。
当获得了足够数量的含有PBGS基因的细胞(或质体)时，该细胞(或质体)被再生到整个植物中。再生步骤的方法的选择不是关键的，对下列宿主而言，合适的方案是可用的豆科(Leguminosae)(紫花苜蓿，大豆，苜蓿等)，伞形科(Umbelliferae)(胡萝卜，芹菜，欧洲防风草)，十字花科(Cruciferae)(甘蓝，萝卜，油菜/油菜籽等)，葫芦科(Cucurbitaceae)(甜瓜和黄瓜)，颖花科(Gramineae)(小麦，大麦，水稻，玉米等)，茄科(Solanaceae)(马铃薯，烟草，番茄，胡椒)，各种开花作物，比如向日葵，和结坚果的树，比如杏仁，腰果，胡桃，和美洲山核桃树。参见例如Ammirato等(1984)；Shimamoto等(1989)；Fromm(1990)；Vasil等(1990)；Vasil等(1992)；Hayashimoto(1990)；和Datta等(1990)。
在一个实施方案中，PBGS基因来自不包含Mg2+而包含Zn2+的PBGS酶的物种。在优选的实施方案中，该物种是酵母或人。在另一个优选的实施方案中，突变的PBGS基因被用于产生转基因植物。在另一个实施方案中，PBGS基因通过同源重组被引入到植物基因组中。可用于生成转基因植物的野生型人PBGS基因组DNA和全长cDNA如下所示人PBGS基因(SEQ ID NO1)cttacgcggtctgtgggagaccggagcgggagacagcggtgacaggagcagcggccgggagcccttagggaggcagacagagcctgcagccaatgccccaggagccctcggttccaaccaactgatgcccctgtgcccactggcccacgccatgcagccccagtccgttctgcacagcggctacttccacccactacttcgggcctggcagacagccaccaccaccctcaatgcctccaacctcatctaccccatctttgtcacggatgttcctgatgacatacagcctatcaccagcctcccaggagtggccaggtatggtgtgaagcggctggaagagatgctgaggcccttggtggaagagggcctacgctgtgtcttgatctttggcgtccccagcagagttcccaaggacgagcggggttccgcagctgactccgaggagtccccagctattgaggcaatccatctgttgaggaagaccttccccaacctcctggtggcctgtgatgtctgcctgtgtccctacacctcccatggtcactgcgggctcctgagtgaaaacggagcattccgggctgaggagagccgccagcggctggctgaggtggcattggcgtatgccaaggcaggatgtcaggtggtagccccgtcggacatgatggatggacgcgtggaagccatcaaagaggccctgatggcacatggacttggcaacagggtatcggtgatgagctacagtgccaaatttgcttcctgtttctatggccctttccgggatgcagctaagtcaagcccagcttttggggaccgccgctgctaccagctgccccctggagcacgaggcctggctctccgagctgtggaccgggatgtacgggaaggagctgacatgctcatggtgaagccgggaatgccctacctggacatcgtgcgggaggtaaaggacaagcaccctgacctccctctcgccgtgtaccacgtctctggagagtttgccatgctgtggcatggagcccaggccggggcatttgatctcaaggctgccgtactggaggccatgactgccttccgcagagcaggtgctgacatcatcatcacctactacacaccgcagctgctgcagtggctgaaggaggaatgatggagacagtgccaggcccaagaactagaactttaaaacgttcccggggcctcagacaagtgaaaaccaaagtaaatgctgcttttagaactgtgccctcatgccctcttcctgctcacatgctagcggggcccagcagccctgggtggttttgccagcatgctaactcttgtaactcgcagctgcatcctatgagctctcccaagcttccccgcccctcccctgggtcagccgtgaggcccacctttgccaccctcagctctttcctctggtgtggcttcagcttgaaagcaacctggagtcgggggcacagcctttggggcctggctgggagagggtcttggagcattaggggaagaagagagcagtgggatcttggggcctgagaagccttggaacgcttctggcagcagagctgggtgtgggaatgaggcctagatcgatatccctgggttagagttgaaatttgccgcaattccactggaaggcatttcccacgaggccagaggttgccaggctgcctgaggtctcctattctactctgaaccataaacccagagaagaattactcattaaccagcataaatactgcctgaggatcaaaactcagaggcaaagagggagttcctgactgctagaggtgccaccaccacaaacactttttattcaggagatactttttgagaatctctgctctgttcctaggttcagtgctgggtcctgggaatacagcaggacagacctcagcttatctcttcatagaaattatacaaagagaattggggagacagctaagaagaaaacaaagaaataaagcagttacaaattgtgataagtgctttgaaggaaagaaggggtctgagacaacaacagggaaggggcctctcttgaaacagtagttgggaaggaggcagacatgcaccagtgatgtggtgacaggtgctctgaaggaggtcaccaggacctgacctctttgaaggatcagaaaatacttccctgaaggactgacatttgagcctagacctgaagggtgagccatcaagctaagacaattggggaagagcattccagggagagggaggagttgtgcaaaggccctggggctccttctagctggaggaatgcaaggctagcttgtctggagcactgagaggatggcctgaactgagtggagagagacagaccaggaccaaaccatgcagaggtcaagggccacattcaccttttcagagtgactcaatcaaatttgtagtttgtaaaagtattttaacagctctgcggcaaagtgcaaatgaaaagtcttgatggcatggactggagcggggacagtggggatggagaaaggggaatggattgtggatgtgtttagaaggtagattcgatgtgaaggatgaatctggcttgaccttctgggtggctgatgggccatttactgagatggggcagcctggaagaggaacagaagcagggtcggggtggagggagaatactaaacttagcttgagacattttgcaataaggaagctatatctagagtgcttatgtgactcacctaaggccactcaacaagtttgtggcagaactggattagaactgcacagaaaacagccaagctgggatttgaacccatgtagtccaactccaaggcctctgcccctaaccactgtgccataccacctcccaataatcaacagcaaaattataggtctaacaatgttttatagacacccctccatttatgtgatgggtttgcatcctgataaacccatcataagttgaaaatatgatcataagttgaaaatatgatcataagtcaaaaatgtatttaatatacctaacctaccaaacatcatagcttagcctagcctgccttaaacatgctcagaacacttacattagcctacagtgggcaaaactatccaacacaaaatctatattgtaataaagttgtaaagaattttgaataaaaattcaatatttgaaaaaaaaaaaaaaaaa人PBGS cDNA(SEQ ID NO2)gcagccaaagccccaggagccctaggttccaaccaactgatgcccctgtgcccactggcccacgccatgcagccccagtccgttctgcacagcggctacttccacccactacttcgggcctggcagacagccaccaccaccctcaatgcctccaacctcatctaccccatctttgtcacggatgttcctgatgacatacagcctatcaccagcctcccaggagtggccaggtatggtgtgaagcggctggaagagatgctgaggcccttggtggaagagggcctacgctgtgtcttgatctttggcgtccccagcagagttcccaaggacgagcggggttccgcagctgactccgaggagtccccagctattgaggcaatccatctgttgaggaagaccttccccaacctcctggtggcctgtgatgtctgcctgtgtccctacacctcccatggtcactgcgggctcctgagtgaaaacggagcattccgggctgaggagagccgccagcggctggctgaggtggcattggcgtatgccaaggcaggatgtcaggtggtagccccgtcggacatgatggatggacgcgtggaagccatcaaagaggccctgatggcacatggacttggcaacagggtatcggtgatgagctacagtgccaaatttgcttcctgtttctatggccctttccgggatgcagctaagtcaagcccagcttttggggaccgccgctgctaccagctgccccctggagcacgaggcctggctctccgagctgtggaccgggatgtacgggaaggagctgacatgctcatggtgaagccgggaatgccctacctggacatcgtgcgggaggtaaaggacaagcaccctgacctccctctcgccgtgtaccacgtctctggagagtttgccatgctgtggcatggagcccaggccggggcatttgatctcaaggctgccgtactggaggccatgactgccttccgcagagcaggtgctgacatcatcatcacctactacacaccgcagctgctgcagtggctgaaggaggaatgatggaggacagtgccaggcccaagaactagaactttcaaacgttcccggggcctcagacaagtgacaaccaaagtaaatgctgcttttagaactgt人PBGS氨基酸序列(SEQ ID NO3)MQPQSVLHSGYFHPLLRAWQTATTTLNASNLIYPIFVTDVPDDIQPITSLPGVARYGVKRLEEMLRPLVEEGLRCVLIFGVPSRVPKDERGSAADSEESPAIEAIHLLRKTFPNLLVACDVCLCPYTSHGHCGLLSENGAFRAEESRQRLAEVALAYAKAGCQVVAPSDMMDGRVEAIKEALMAHGLGNRVSVMSYSAKFASCFYGPFRDAAKSSPAFGDRRCYQLPPGARGLALRAVDRDVREGADMLMVKPGMPYLDIVREVKDKHPDLPLAVYHVSGEFAMLWHGAQAGAFDLKAAVLEAMTAFRRAGADIIITYYTPQLLQWLKEE本发明的组合物适合作为个人护理制品中的抗微生物活性成分，所述个人护理制品例如洗发水，沐浴添加剂，头发护理产品，液体和固体肥皂(基于合成的表面活性剂和饱和的和/或不饱和的脂肪酸的盐)，乳液和乳霜，除味剂，其他水性或醇的溶液，例如皮肤的清洁溶液，湿润清洁布，油或粉。因此本发明还涉及包含本发明组合物的个人护理制品，和Holzl等的美国专利6,689,372描述的任选的美容可耐受的载体或佐剂。该组合物将以有效具有抗微生物效果，即抑制或防止微生物活性的量使用。可以使用其他的组分，例如，螯合剂，着色剂，香料油，增稠或固化(稠度调节)剂，润肤剂，UV吸收剂，皮肤保护剂，抗氧化剂，提高机械性质的添加剂例如二羧酸和/或脂肪酸的Al，Zn，Ca和Mg盐，和任选的防腐剂。此外，本发明提供皮肤、粘膜或毛发抗微生物治疗的方法，包括将需要所述抗微生物治疗的人的皮肤、粘膜或毛发与抗微生物有效量的本发明组合物接触。
根据本发明的个人护理制品可以配制成油包水或水包油的乳液，醇或含醇的制品，离子或非离子的两性脂的囊泡分散系，凝胶，固体棍或气溶胶制品。
作为水包油或油包水的乳液，美容可耐受的佐剂包含例如5-50％的油相，5-20％乳化剂和30-90％的水。油相可以包含任何适合用于美容制品的油，例如一种或多种烃油，蜡，天然的油，硅酮油，脂肪酸酯或脂肪醇。优选的一元醇或多元醇是乙醇，异丙醇，丙二醇、己二醇、甘油和山梨糖醇。
根据本发明的美容制品可以包含在Holzl等的U.S专利6,689,372所述的多种美容制品中。尤其考虑下列制品，例如皮肤护理制品，如采用片剂或液体肥皂形式的皮肤清洗和清洁制品，无皂的去污剂或洗涤软膏；沐浴制品，例如液体(沐浴泡沫，乳液，淋浴制品)或固体沐浴制品，如洗浴香精块和浴盐；皮肤护理制品，如皮肤乳液，多乳液或皮肤油；美容个人护理制品，如采用日霜或粉霜形式的面部彩装，面部粉底(散状或压缩)，腮红(rouge)或粉底霜(cream make-up)，眼部护理制品，如眼影制品，睫毛膏，眼线，眼霜或固眼霜(eye-fix creams)；唇部护理制品，如唇膏，唇彩，唇线笔，指甲护理制品，例如指甲油，洗甲水，指甲强化剂或表皮去除器；私密卫生制品，如私密洗液或私密喷剂；足部护理制品，如足浴液，足粉，足乳或足部香膏，特别的除味剂和止汗剂或除茧制品；防晒制品，例如防晒奶，防晒液，防晒霜，和防晒油，防晒乳或tropicals，晒黑前(pre-tanning)制品或晒后护理制品；皮肤晒黑制品，如自助晒黑霜；去除色素制品，如漂白皮肤的制品或皮肤发光制品；驱虫剂，如驱虫油，驱虫液，驱虫喷雾或驱虫棒；除味剂，例如除味喷雾，泵作用的喷雾，除味凝胶，除味棒或除味滚珠；止汗剂，如止汗棒，止汗霜或止汗珠；清洁和护理皮肤斑的制品，如无皂去污剂(固体或液体)，磨砂制品或磨砂面膜；化学形式的脱毛制品，如脱毛粉，液体脱毛制品，霜或膏形式的脱毛制品，凝胶形式或气溶胶泡沫的脱毛制品；剃须制品，如剃须皂，泡沫剃须霜，无泡剃须霜，泡沫和凝胶，干剃须的须前制品，须后水或须后液；香味制品，如香料(古龙水(eau de Cologne)，盥用水(eau de toilette)，淡香水，盥用香水(parfum de toilette)，香水)，香精油或膏体香氛；牙齿护理、假牙护理和口腔护理制品，如牙膏，凝胶牙膏，牙粉，浓缩漱口水，抗牙菌斑漱口水，假牙清洁剂或假牙固着剂；美容头发处理制品，如洗发水或护发素形式的洗发制品，头发护理制品，如预处理制品，头发滋润剂，造型霜，造型凝胶，润发油，毛发漂洗剂，处理包(treatment packs)，加强型头发处理，头发构造制品，如产生持久波浪的头发波浪制品(热烫，温烫，冷烫)，头发顺直制品，液体头发固定制品，泡沫，喷发剂，漂白制品；如过氧化氢溶液，发光洗发水，漂白霜，漂白粉，漂白膏或油，暂时的、半持久的或持久的头发着色剂，含有自氧化染料的制品，或天然的头发着色剂，例如指甲花(henna)或甘菊。
根据本发明的口用组合物可以是，例如，凝胶、膏、霜或水性制品(漱口水)形式。
根据本发明的口用组合物还可以包括释放有效抵抗龋齿形成的氟离子的化合物，例如无机氟盐，如氟化钠、氟化钾、氟化铵或氟化钙，或有机氟盐，如氟化胺，其以商品名Olafluor而公知。
本发明的组合物还适合用于处理纺织品纤维材料。这样的材料是如丝，羊毛，聚酰胺或聚氨酯的未染色的和染色的或印花纤维材料，和尤其是各种纤维素纤维材料。这样的纤维材料是，例如，天然纤维素纤维，例如棉、亚麻、黄麻和大麻，以及纤维素和再生的纤维素。优选的合适的纺织纤维材料由棉制成。本发明的组合物还可以用于洗涤和清洁制品，如用于液体或固体洗涤剂或柔软剂。
本发明的组合物还适合给予塑料以抗微生物性质，所述塑料如聚乙烯、聚丙烯、聚氨酯、聚酯、聚酰胺、聚碳酸酯、乳胶等。因此应用的领域为，例如，地板覆盖物，塑料涂层，塑料容器和包装材料，厨房和浴室用具(如，刷子、浴帘、海绵、防滑垫)，乳胶过滤器材料(空气和水过滤器)，用于医药领域中的塑料物品，如敷料，注射器、导管等，所谓“医疗器械”，手套和垫子。
纸，例如用于卫生目的的纸，还可以使用本发明的组合物使其具有抗微生物性质。
根据本发明，使无纺布，如尿布，卫生巾，紧身衬里(panty liners)和用于卫生和家居的布具有抗微生物性质也是可能的。
该组合物还可以尤其用于家居和全能的清洁剂以清洁和消毒硬表面。
除了对化妆品和家居产品防腐之外，技术产品例如纸处理液、淀粉或纤维素衍生物的印花增稠剂，表面涂层和涂料也可以被防腐和具有抗微生物性质。
本发明的组合物还适合于对木材的抗微生物处理和对皮革的抗微生物物处理并使皮革具有抗微生物性质。
本发明的化合物还适合于保护化妆品产品和家居产品免受微生物损坏。
此外，本发明的组合物还可以用作口用组合物，例如White，Jr.等的U.S.专利6,740,311描述的与口腔可接受的载体结合的牙粉组合物。这种口用组合物的非限制性的例子是适用于人和动物的牙膏、牙粉、预防性牙膏、糖锭、口香糖等。
此外，本发明的组合物可以用于制备抗微生物表面。此外提供制备抗微生物表面的方法，该方法包括(1)提供本发明的组合物，其中该组合物有效抑制或防止形成多聚体胆色素原合成酶的活性形式并从而抑制或防止细菌、古细菌和/或真核生物的增长或生长，假定多聚体胆色素原合成酶的活性形式包含变构的镁结合位点和该组合物是药物、牙膏、肥皂、消毒剂、抗生物膜组合物和除草剂中的至少一种；(2)提供表面形成基质；和(3)将组合物与表面形成基质组合并从而制备抗细菌表面。在本方法的一个变体中，抗细菌表面适应于防止或抑制生物膜的形成。
这里使用的术语“表面形成基质”包括生物可降解和不可降解的聚合物、硅石、陶瓷及其组合，用于将组合物和基质混合、分层或连接。该组合物还可以置于基质的顶部或底部表面。
在本发明中，提供操纵植物生长或增长的方法，包括对植物施用作为除草剂的本发明的组合物，其中该植物是除草剂抗性的并适应于对基本以拥抱二聚体的多聚体形式存在的多聚体胆色素原合成酶是转基因的。在本方法的一个变体中，多聚体胆色素原合成酶不含有变构的镁结合位点。
本发明将通过以下是实施例更详细地解释，但应当理解本发明不限于此。
实施例作为例子的胆色素原合成酶或MORPHEINS下面的实施例揭示了PBGS可以以替代的四级结构状态存在以及在一些物种中这些状态形式的相互转换形成该PBGS变构调控的结构基础。PBGS公知的四级结构状态是八聚体，由拥抱二聚体构成。还已知一些PBGS，尤其是图6中QSE的那些，以对比活性的蛋白浓度依赖性所显示的四级结构形式的平衡存在。对比活性的蛋白浓度依赖性表明最大活性的寡聚体可以解离或重结合成为更小的活性较低的形式。之前认为更小的活性较低的形式，也是拥抱二聚体的复数形式。处于QNW的PBGS不容易在四级结构同工型之间平衡的事实使得对分开的二聚体的稳定寡聚体的观察和表征成为可能。因此，人PBGS的F12L突变允许我们研究六聚体的稳定形式并建立了正是其六聚体的性质(而不是特定的F12L突变)决定了F12L相对于野生型人PBGS的强烈差异的功能性质。F12L是人PBGS天然产生的罕见等位基因(3-5)。下面描述的是对人PBGS的研究(在E.coli中异源表达的野生型和F12L0并通过常规技术纯化)。
蛋白表达亲本人PBGS是充分表征的N59/C162A(6)。N59对应于编码PBGS蛋白的两个共显性等位基因中更可溶的那个。C162A是消除缓慢形成异常二硫键的可能性的良性突变。N59/C162A的人造基因以下称作Wt。用于Wt QuikChange突变为F12L变体的有义链引物是GGCTACCTCCACCCACTGCTTCGGGCC。数个构建体为在E.coli中共表达Wt和F12L而制备。基因的顺序和启动子的数目都是不同的，但这些变异不影响结果。描述了含有一个启动子控制下的Wt和F12L的构建体。含有Wt的质粒DNA(pET3aWt)用BamHI和NdeI消化以切割出Wt。pET17b载体DNA通过用BamHI和NdeI消化而线性化，并与Wt连接，从而Wt的ATG起始密码子位于由载体编码的核糖体结合位点下游6个碱基对处。得到的质粒被转化到E.coli XL1blue中。制备质粒DNA(pET17bWt)并用SpeI和Bpu1102I线性化。含有基因F12L的质粒DNA(pET3aF12L)用XbaI和Bpu1102I消化以产生含有F12L的核糖体结合位点和基因的片段。F12L基因和线性化的pET17Wt载体被连接使得F12L基因的核糖体结合位点位于Wt的终止密码子下游35个碱基对，终止子位于F12L基因终止密码子下游52碱基对。质粒pET17bWtF12L被转化进E.coli XL1blue，制备质粒DNA并转化进E.coli BLR(DE3)以表达蛋白，如前所述(6)。
蛋白纯化蛋白纯化方法(细胞破碎、硫酸铵分级沉淀、苯基-Sepharose疏水层析、离子交换层析和Sephacryl S-300凝胶过滤层析)的大部遵循前述(6)的方法，除了使用70ml Q-Sepharose柱代替用于阴离子交换步骤的DEAE琼脂糖柱。Q-Sepharose在室温下使用30mM磷酸钾，pH 7.0，10mM 2-巯基乙醇，10μM Zn(II)，并采用如图3A所示的KCl梯度进行。梯度以流速为3ml min-1由Rainin HPLC系统控制并收集10ml级分。
PBGS变体的动力学特征被用于显示wt和f12L具有不同的功能特征在0.1M bis-tris丙烷，10mM 2-巯基乙醇，10μM Zn中进行所有的动力学测定。对于pH变化图(rate profile)而言，在添加10mMALA-HCl后报告的pH反映分析pH。对Km和Vmax测定而言，ALA的浓度是10μM，30μM，100μM，300μM，1mM，3mM，和10mM，并且各重复两次。ALA-HCl浓度的变化不导致最终pH的变化，因为在添加恒定体积到分析混合物中之前，0.1M ALA-HCl储液被稀释到0.1M HCl中。所有的分析在37℃一段固定的时间，使用Ehrlich氏试剂测定形成的胆色素原。
分析超离心蛋白样品仅在上样至超离心之前对30mM磷酸钾，pH 7.5，0.1mMDTT，和10μM ZnCl2透析。上样浓度对野生型和F12L突变酶分别为10.6μM和12.8μM。在4℃使用配备有An60Ti转子的Beckman OptimaXL-A分析超离心机并使用6通道，12-mm路径，填充活性炭的Epon中心件以石英窗进行全部沉降平衡实验。在三个转子速度(8,000，11,000，和14,000rpm)收集数据并使用0.001cm扫描步长显示平均20个扫描。使用Sednterp程序(32)计算温度校正的偏微比体积(partialspecific volume)和溶液密度；溶液浓度为1.00191gm/mL，野生型和突变蛋白的偏微比体积分别为0.7394和0.7397mL/gm。使用来自康涅狄格大学(University of Connecticut)(Storrs，CT)的分析超离心设施的HID程序分析数据。从拟合(fits)排除了单个物种作为残数的数据模拟分析明显是非随机的。
F12晶体结构的测定F12L对50mM bis-tris丙烷，10mM βME，和10μμM ZnCl2透析。使用沉滴(sitting drop)方法形成晶体等体积F12L(4.0mg ml-1)与沉淀剂(0.4M磷酸二氢铵)混合。向蛋白亚基浓缩液添加等摩尔ALA，在3-5天内形成晶体。在连接有装配了OSMIC光学件和在50kV及100ma下工作的RU-200转动阳极发生器的MAR345成像板检测器上以100K收集衍射数据。在冷冻之前通过将晶体转移到在各溶液中含有12％，17％，23％和30％甘油的储液中3分钟而冷冻保护该晶体。收集的一些数据显示高度无序并且在活性区域之间缺少任何配体。由于上述因素，F12L的晶体被浸泡在2mM ALA(其被添加到头两个冷冻保护溶液中)以及0.2mM ZnCl2(除了ALA外其也被添加到后两个溶液中)。最终数据集合由对应于0.5°振动的525个框组成，每框暴露时间3.5分钟。晶体属于六边形系统，空间组P63，单元晶胞参数a＝b＝89.6，c＝153.2。在非对称单元中有两种分子。衍射数据用程序包HKL2000，Rmerge(I)＝5.0％对33,615个反射在45-2.2分辨率范围简化。
通过AmoRe程序包以人PBGS结构的分子A(pdb编码1E51)作为起始模型进行分子置换而确定结构。用CNS程序进行改进。最终模型包括F12L-分子A(残基11-82，97-124，140-169，172-212，222-330)和B(残基3-82，97-122，140-169，172-212，226-328)的一个二聚体，结合在分子A活性位点的催化反应中间产物的一个分子，241个水分子和看起来具有低轨道占据的两个锌原子。对于2.2分辨变化数据而言，晶体成像的R-因子是19.9％，R(free)是28.6％，而键长和键角的RMS偏离分别为0.18和2.0°。所有的残基属于Ramachandran图上允许的构型区域。
人PBGS变体F12L的性质人PBGS变体F12L与野生型蛋白显著不同。纯化的F12L的特征证实在野生型人PBGS活性最高的条件下，其催化活性很低。然而，F12L显示明显改变的pH变化图并显示在碱性pH值时相当高的活性(图1A)。在野生型蛋白的最适值pH 7和F12L的最适值pH 9测定F12L和野生型人PBGS的Km和Vmax值；结果显示于表1(下文)。F12L显示正常的Michaelis-Menten动力学和异常高的Km值，远高于底物5-氨基酮戊酸(ALA)的生理浓度。然而，在pH 9时F12L的Vmax显著高于野生型蛋白的Vmax。在最适pH和存在金属离子的最适构型的条件下，所有特征已知物种的野生型PBGS被报道其Km值在100μM(6，8-10)范围内，正如此处在pH 7下所见野生型人PBGS的值。野生型人PBGS在pH 9的动力学表现没有显示标准的Michaelis-Menten动力学，其基础在一开始并不明显。根据粗略检查，野生型蛋白看起来显示以Hill系数0.35量级表现出极端的负协同性。事实上，对该数据的最佳拟合是双双曲线等式，其后来被认为来自于四级结构同工型(morpheins，八聚体和六聚体)混合物的催化作用，其中两种形式具有不同的Km值。该现象在下文中更详细进行描述。
F12L变体和野生型蛋白之间显著差异的进一步证据来自阴离子交换层析(图1B)和非变性凝胶电泳(图1C)运动性的变化，两者都暗示寡聚体结构的差异。在阴离子交换柱上的分离通常反映出不同的表面电荷，其不可能是由于中性亮氨酸被中性苯丙氨酸的替换。两个具有相同荷/质比的种类的电泳分离显示或是大小不同或是形状不同。总的来说，这些差异显示F12L和野生型人PBGS以不同的寡聚化状态存在。
野生型和突变的蛋白使用分析超离心进行沉淀平衡分析，野生型蛋白和F12L的分子量被发现分别为244,000±8,900和197,900±6,500道尔顿。前者是预期八聚体和六聚体的中途，而后者是预期六聚体和四聚体的中途。在数据的模型分析中，野生型蛋白分别以7.6％，51％，和42％最佳拟合到二聚体、六聚体和八聚体三个状态的模型，而F12L以70％到30％的比率最佳拟合到四聚体和六聚体的两个状态的模型，而没有八聚体。因此，本发明人测定了人PBGS变体F12L的晶体结构。
人PBGS和F12L变体的晶体结构显示单体结构的显著差异，这决定新的四级结构同工型并揭示了MORPHEINS的第一个例子17个以前测定的来自真菌、后生动物和细菌的PBGS(11-20)的晶体结构显示共有的同型八聚体结构，其中四个二聚体通过围绕中央轴90°旋转而相关(图2A)。PBGS是TIM α/β桶状蛋白(21)醛缩酶超家族的成员。在各亚基中催化核心完全位于桶内，并且20+氨基酸N末端臂涉及广泛的亚基相互作用。催化核心的序列是系统发生学上保守的，但是N末端臂不保守。八聚体中所见的PBGS二聚体(图2A，顶部)包括高度保守的桶对桶接触并且一个亚基的N末端臂拥抱姐妹亚基的桶。因此，这被称为拥抱二聚体(hugging dimer)(2)。氨基酸12的侧链不参与拥抱相互作用。四聚体的集合，其通过加入绕中央轴(图2A，中间)旋转90°的第二个拥抱二聚体，而添加一个亚基的臂和相邻二聚体的α/β桶底部之间的彼此相互作用。氨基酸12的侧链参与该亚基相互作用。再添加两个各自绕中央轴旋转90°的二聚体产生八聚体(图2A，底部)。该八聚体，相对于二聚体和四聚体的视图朝向读者旋转90°，产生风车的表示。在确定F12L的晶体结构之前，假设所有的PBGS蛋白拥有相同的同型八聚体结构(2)。然而，对于来自绿色植物和一些细菌的PBGS，动力学证据暗示活性最大的八聚体可以解离成小的、活性较低的结构单元(9，22)。该动力学证据是如图X中豌豆PBGS所示对比活性的蛋白浓度依赖性。
引人注目的是，F12L人PBGS等位基因新测定的晶体结构(PDB编号1PV8)显示了包含N末端臂相对于α/β桶显著重排的四级结构(图2B)。在这种情况下，二聚体保留上述的桶对桶接触但是N末端臂是分开的而不是拥抱的(图2B，顶部)。四聚体的集合保留上述一个亚基的臂和相邻二聚体的α/β桶底部的彼此相互作用。然而，由于臂是突出来的，该连接规定了绕中央轴120°旋转。因此，在寡聚体结构中有三个分开的二聚体，各自绕中央轴旋转120°形成六聚体(图2B，底部，以风车表示观察)。从观察到的野生型人PBGS八聚体向观察到的F12L的六聚体的空前的结构转换是个极好的例子，说明了小的突变如何对蛋白的结构和功能具有深刻的影响，以及表明这两种四级结构形式在能量上是多么接近。通过观察这些结合还可以清楚在八聚体和六聚体之间的任何平衡必须通过拥抱二聚体和分离二聚体之间的相互转换进行。这种相互转换过程显示于图5A。
F12L的新结构(2.2分辨率)包含显著的无序区域，其使得相对于前述野生型人PBGS结构(PDB编号1E51，2.83分辨率)的活性位点的结构比较无法进行。氨基酸12不直接与任一结构中的活性位点残基相互作用。此外，对在两个结构中都观察到的那些氨基酸而言，大多数是可重叠的。因此，为进一步探测F12L不同寻常的动力学性质的基础(如，图1，表1)，本发明人共表达了F12L和野生型人PBGS。
野生型人PBGS和F12L的共表达揭示四级结构是动力学差异的基础制备共表达系统系统以从相同的RNA信使产生1∶1的野生型人PBGS和F12L变体。共表达的蛋白WT+F12L的纯化被发现在阴离子交换层析中产生两个不同的PBGS蛋白峰(图3A)。首先洗脱的峰(池I)与F12L在非变性凝胶上泳动相当，而第二个峰(池II)与野生型人PBGS泳动相当(图3B)。池I显示在pH 9活性增强以及池II显示在pH 7活性增强(图3C)。两个池在胰蛋白酶消化后分别进行质谱分析并且各自被发现含有显著量的N-末端2010.2道尔顿含Phe的肽和1976.2道尔顿含Leu的肽，证实了两个池含有杂聚体种类。杂聚体池中各链的百分比通过N末端测序来定量，显示池I含有48.5％Phe和51.5％Leu而池II含有71.1％Phe和28.3％Leu。这些比率没有明显显示是什么主宰了杂聚体种类的四级结构。池I和II通过在Sephacryl S300凝胶过滤而进一步纯化，这减少了杂聚体的交叉污染。S300纯化的池I和II的pH变化图分别与F12L和野生型人PBGS显著类似(图3C)。根据层析、质谱和定量N末端测序数据，我们总结池I包括杂六聚体而池II包括杂八聚体。pH变化图被发现更多由四级结构控制而不是处于第12位的氨基酸组成来控制。
在pH 7和pH 9测定S300纯化的池的动力学参数Km和Vmax(表2)。动力学数据不遵循简单的Michaelis-Menten关系(双曲线拟合)，但是可以归结于由具有不同的Km和Vmax值的两种不同形式的酶的催化(双双曲线拟合)(23)。图3D显示作为底物浓度函数的活性；动力学数据均匀拟合模型，其中酶的六聚体和八聚体形式分别显示高和低Km值。这个双双曲线拟合(深色线)远优于单双曲线拟合(浅色线)。所有的动力学值都被精确测定，例外的是在pH 9检测到池I存在痕量八聚体(参见表2)。pH 9时野生型人PBGS的数据也以比八聚体-六聚体模型更好的拟合被提供，该溶液也包括在表2。在分析条件下控制人PBGS杂聚体(heteromer)平衡的因素还有待阐明。
表2野生型人PBGS，F12L，和杂聚体Wt/F12L池的动力学参数
池I和池II是如图3A所示，从Q-Sepharose柱洗脱后进一步在Sephacryl S-300柱上纯化的PBGS活性的两个池。Km1和Km2(都是mM)被分别解释为八聚体和六聚体的Km。报道的Vmax值(单位μmolesh-1mg-1)反映在分析条件下四级结构种类有待测定的摩尔分数。拟合的Km值对四级结构种类的分配是独立的。
野生型人PBGS，F12L变体，和WT+F12L异聚体呈现的数据正式建立了野生型蛋白和F12L变体之间的动力学差异主要由于四级结构的差异。对其他选择人PBGS突变体(R240A，T23P，和T23P/F12L)的进一步工作证实六聚体的动力学类似于F12L的动力学而八聚体的动力学类似于野生型蛋白的动力学。
基于八聚体对六聚体的人PBGS结构的认识，可以构思在对这两种形式PBGS的最适pH下的显著差异的假说。PBGS催化的反应的化学性质需要形成至少两个Schiff碱中间产物(2，12，16，17，20)。这些Schiff碱的甲醇胺(carbinolamine)前体的形成要求参与的氨基是不带电荷的，或者局部pH高于氨基的pKa。六聚体和八聚体PBGS间的一个显著结构差异是在包括活性位点盖子(lid)的氨基酸中发现的有序程度。六聚体PBGS F12L晶体结构缺少构成活性位点盖子的大多数残基的致密性，从而提示六聚体结构使关闭的盖子构型去稳定。在缺少关闭的盖子的情况下从本体溶剂分离活性位点，PBGS催化的反应不能进行，直到外部pH高于参与形成Schiff碱的氨基的pKa。因此，六聚体结构被认为只有当外部pH足够碱性以便于形成Schiff碱时才显示活性。高Km也可以归结于活性位点盖子的去稳定，因为PBGS八聚体的晶体结构显示在盖子的残基和决定Km值的底物分子之间的稳定性相互作用。目前的结果提供理解调控PBGS功能的新的途径。如下文所述，从鉴定PBGS六聚体获得的知识对重新考虑非人种类PBGS活性的变构调节有着相当重要的意义。
PBGS的变构调节可以归结于八聚体到六聚体的平衡PBGS八聚体和六聚体的比较揭示了PBGS变构调节的基础。尽管事实上PBGS活性位点的明显组分包含在单体中，大多数PBGS蛋白含有变构的镁的结合位点，该位点位于拥抱二聚体的臂对桶界面处(14，24)。变构的镁的位置在铜绿假单胞菌(14)和E.coli PBGS(16)的晶体结构中都可见，图4A后者显示。图4A显示具有黑球所示的变构的镁的拥抱二聚体(浅色带，深色链)，其中之一以大的黑白(white-on-black)箭头显示。酵母和人PBGS的结构显示，精氨酸的胍基位于变构的镁处，如前所述(2)。这是人PBGS的Arg240。如果假设所有的PBGS可以在合适的条件下以六聚体存在，那么变构的镁的位置与六聚体-八聚体转换有关，因为该金属结合位点存在于八聚体(由拥抱二聚体构成)而不存在于六聚体(由分离二聚体构成)。图4B显示PBGS八聚体中的三个亚基对亚基之间的界面。黑白箭头显示桶对桶的界面，其是八聚体和六聚体PBGS集合所共有的。带黑点(dot on black)的箭头显示臂对桶底的相互作用，其也是八聚体和六聚体PBGS集合所共有的。黑白箭头，其类似于变构的镁结合位点，显示存在于八聚体(拥抱二聚体)而不存在于六聚体(分离二聚体)的臂对桶相互作用。与变构的镁介导六聚体-八聚体平衡的观点一致的是镁对E.coli PBGS动力学参数的影响。在这种情况下，添加变构的镁导致Km值从～2mM降低到～200Mm(8)，这明显提示六聚体和八聚体形式的人PBGS的Km值之间的差异(表1)。还值得注意的是我们之前的观察，即均一的纯E.coli PBGS在非变性凝胶电泳中显示多个条带，这些条带的泳动性与八聚体、六聚体和二聚体的分子大小一致，而添加镁有利于形成最大的(八聚体)形式(8)。还值得注意的是最近发现人PBGS变体R240A纯化～80％为六聚体和20％为八聚体，而后一寡聚体是不稳定的并随着时间重排为六聚体。
对蛋白浓度依赖的比活性的观察是存在MORPHEINS的平衡的最直接的诊断工具PBGS在六聚体和八聚体之间的相互转换被建议作为负责一些物种PBGS的蛋白浓度依赖的比活性的机制。迄今为止，我们已表征了含有变构的镁的四种不同的PBGS。所述酶来自物种大肠杆菌(γ-proteobacter)，日本慢生根瘤菌(α-proteobacter)，铜绿假单胞菌(γ-proteobacter)，和豌豆(Pisum sativum)(绿色植物)。后三种不同于人PBGS之处在于它们不使用活性位点催化的锌(24)以及它们还共有不寻常的蛋白浓度依赖的比活性性质(9，22，25)。后一性质表明最大活性的寡聚体可以解离为较低活性或无活的较小形式。出版的数学模型已经考虑最大活性的八聚体解离成较低活性或无活的四聚体和/或二聚体(9，22)。
人PBGS变体F12L的六聚体结构使我们建议植物和某些细菌PBGS的蛋白浓度依赖性是由于较低活性六聚体形式和较高活性八聚体形式之间的平衡，如图5A所示。这样的平衡的存在得到豌豆PBGS沉降平衡研究的支持(数据未发表)。由于镁对拥抱二聚体和替代的分离二聚体之间的差异是必不可少的，该离子被建议有利于拥抱二聚体的形成，并且从而有利于形成八聚体。图5B示例从豌豆PBGS除去镁离子不利于最大形式而有利于较小的形式，其中两种形式的泳动性与八聚体和六聚体的一致。在该模型中，六聚体是PBGS蛋白潜在的储存形式，因为其在生理pH下活性较低，并且特征在于Km值，该值远高于ALA的生理浓度。与之对比，八聚体在生理pH是活性的并且其Km值在活性四吡咯生物合成过程中处于合适的ALA浓度范围内。
总之，这些研究支持的观点是PBGS在叶绿素生物合成的复杂调控中起作用(26-28)。我们注意到有记录表明在植物变绿的过程中发生叶绿体中镁浓度急剧增加(29)。可以想象无活性的六聚体储存形式允许PBGS的快速活化作为伴随变绿过程中生物化学改变的级联反应的部分。有趣的是注意到对植物和藻类PBGS四级结构的数个凝胶过滤研究总结寡聚体是六聚体(30和其中引用的文献)。支持存在通过阴离子交换层析可分离的可相互转换的PBGS四级形式的文献可以在早先对来自普通小球藻(Chlorella regularis)PBGS的报道(31)中找到。
六聚体人PBGS显示变构调节蛋白功能新的结构范例并且是作为MORPHEINS存在的蛋白的第一个例子对人PBGS变体F12L的表征揭示点突变导致PBGS结构和功能的巨大改变。该突变可以作为导致进化中蛋白行为显著改变的单个氨基酸改变的先例。F12L突变使PBGS八聚体去稳定并导致形成六聚体。八聚体和六聚体之间的结构转换必须通过含有不同的二聚体结构的没有先例的平衡来进行。出现在大多数PBGS的变构的镁在八聚体中有结合位点，而在六聚体中没有。非变性凝胶数据表明除去变构的镁有利于形成六聚体，而不是八聚体。八聚体-六聚体转换定义了金属离子依赖性变构调节蛋白功能的新机制。
本发明描述了通过稳定PBGS的无活性morphein和/或其他可以通过morphein的相互转换而调控的蛋白而抑制蛋白功能。为译解选择性地结合到并稳定PBGS的六聚体形式的分子，发明人采取如下方法。只有在QSE的那些PBGS目前被考虑作为靶，因为这些PBGS已经显示作为八聚体具有活性，但它们显示蛋白浓度依赖的比活性现象。靶分子是一种选择性结合到如图10中的球所示的六聚体的“腋窝”的分子。发明人采用“计算机(in silico)”方法检索分子库寻找结合到靶生物PBGS六聚体形式的分子。
为靶六聚体PBGS建立同源性模型发明人所依据的建立靶六聚体PBGS模型的唯一存在的晶体结构是人PBGS临床变体F12L，PDB编号1PV8(Breinig等(2003)Nat.Struct.Biol 10，757-763)。不幸的是，F12L的晶体结构显示显著的无序性，限制了其用作建立同源性模型的唯一基础。然而，对人PBGS八聚体和六聚体结构(PDB编号1E51和1PV8)的比较显示包括TIM样α，β桶结构域的～300氨基酸几乎一致。对于人PBGS，八聚体和六聚体的差异在于24个氨基末端氨基酸的结构和在六聚体中更无序的不同区域(参见Breinig等)。因此，可以使用更高质量的PBGS八聚体晶体结构来建立靶PBGS的α，β桶结构域的同源性模型。选择的结构是PDB编号1GZG(Frere，F.，Schubert，W.D.，Stauffer，F.，Frankenberg，N.，Neier，R.，Jahn，D.，和Heinz，D.W.(2002)J Mol Biol 320，237-247)参考文献(20)，其是铜绿假单胞菌PBGS高度有序的高分辨率晶体结构，本身是“捕获”PBGS六聚体的抑制剂的靶。使用不同容量的Swiss-PDB阅读器(www.expasy.ch/spdbv/mainpage.html)和其他程序建立铜绿假单胞菌PBGS的六聚体形式。为建立铜绿假单胞菌PBGS六聚体，从1GZG二聚体的结构文件中除去N-末端臂。得到的α，β桶结构域(残基32-335)被连续地重叠在1PV8六聚体的三个二聚体上以产生铜绿假单胞菌PBGSα，β桶的六聚体集合。在人和铜绿假单胞菌的PBGS的N末端臂没有显著的序列同一性，但是在N末端臂结构中有保守的α螺旋。因此，人PBGS和铜绿假单胞菌PBGS的八聚体形式的结构比对被用来确定该α螺旋区段的合适的序列比对。这个信息被用于确定铜绿假单胞菌PBGS的第22-29位氨基酸在六聚体中的空间位置。程序Loopy(Xiang，Z.，Soto，C.S.，和Honig，B.(2002)Proc Natl Acad Sci U SA 99，7432-7437)被用于建立第29-32位氨基酸的模型，从而将N末端α螺旋与各亚基的α，β桶结构域连接。最后，剩余的N-末端氨基酸，其显示于1PV8文件中，通过使用人六聚体PBGS的对应氨基酸的φ，，和ω角信息建立到铜绿假单胞菌PBGS结构上。由于人PBGS六聚体(1PV8)的一些N末端的无序性，铜绿假单胞菌PBGS的六聚体模型缺少亚基A、C和E的第1-9位残基和B、D和F的第1-11位残基。六聚体铜绿假单胞菌PBGS是用我们之前已经使用的公开的现成方法(Kundrat，L.，Martins，J.，Stith，L.，Dunbrack，R.L.，Jr.，and Jaffe，E.K.(2003)J Biol Chem 278，31325-31330)建立六聚体豌豆PBGS模型的基础结构。
在寻找优先结合到六聚体PBGS的分子时，有如下的发现。对六聚体PBGS的分析显示假定的“抑制剂”结合位点(也称为腋窝)含有三个亚基A、B、和E的元件。亚基A和B包括已经定义的“分离的二聚体”，此处我们通常描述底部亚基(亚基A，图15)使得读者直接看到位于α，β-桶中央的活性位点。亚基B与亚基A共享桶对桶界面。亚基E与亚基B彼此相互作用，其中一个亚基的N末端臂套入另一个亚基α，β-桶的底部。图15显示已对接(docked)的抑制剂-下文描述的迷迭香酸。在这个对接结果中，迷迭香酸与图中显示的三个亚基都有直接的相互作用。
使用多种“小分子”分子库，其已经被我们的合作者GeorgeMarkham收集起来，而对接方法使用商业对接程序Glide试图发现捕获六聚体形式的PBGS的分子。假设自然的力量已经使用morphein捕获方法，初始库筛选集中于代谢物和天然产物。至今，在～1,000,000个分子的分子库中，～30,000已经被筛选为能结合到豌豆PBGS的六聚体模型的“腋窝”的分子。至今，最好的结果来自天然产物迷迭香酸。
来自迷迭香酸的实验数据迷迭香酸(苯丙酸，□-[[(2E)-3-(3，4-二羟基苯基)-1-氧-2-丙烯基]氧]-3，4-二羟基-，(□R)-(9CI))的抑制数据与缓慢紧密结合抑制模型一致，其中迷迭香酸优先结合到小于八聚体的豌豆PBGS四级结构形式。图16A，空心图标，显示豌豆PBGS蛋白浓度依赖的比活性，其在3.5μg/mlPBGS时显示半最大活性。这表明在分析条件下降3.5μg/ml处，四级结构同工型(morpheins)的平衡含有大约50％八聚体和大约50％较小的活性较低的同工型(如，六聚体)。如果抑制剂通过优先结合到这些较小的形式而起作用，可以预期在morphein平衡含有这些较小形式的条件下有更完全的抑制。换句话说，将预期抑制剂使蛋白浓度依赖性移动到更高的蛋白浓度，这在图16A中显示为迷迭香酸(参见下文)。图16B和16C显示用于测定如何最佳证实蛋白浓度依赖性的移动的实验。图16B显示豌豆PBGS的剂量反应曲线，其表明当在添加底物前使迷迭香酸作用于蛋白30分钟时，该抑制剂的IC50是～63μM。未显示抑制对预孵育时间的依赖性，其中通过任一浓度的迷迭香酸的抑制随着预孵育时间的增加而提高，显示迷迭香酸作为缓慢结合抑制剂而起作用。图16C显示一旦抑制已经发生，则蛋白在30分钟分析时间内不会恢复。图16A，16B，和16C获得的数据被用于选择为显示迷迭香酸对豌豆PBGS蛋白浓度依赖性所必须的合适条件，如下所示。图16A的实心圈显示在用30μM迷迭香酸处理30分钟后豌豆PBGS比活性的蛋白浓度依赖性，在13.5μg/ml PBGS得到半最大活性。因此，在用迷迭香酸处理后，四级结构形式的平衡从3.5μM移动到13.5μM；在这些条件下，需要13.5μg/ml PBGS以获得具有50％八聚体的平衡。这与如图10中的球所示的迷迭香酸稳定较小的较低活性形式的PBGS的解释一致。图17以非变性凝胶电泳数据支持该结论。第2道显示豌豆PBGS将分离成至少两个四级结构形式。在凝胶上的泳动性与作为八聚体和六聚体平衡的豌豆PBGS一致(还参见图5B)。第1和3泳道显示在用迷迭香酸处理后平衡移动至较小的形式。第1泳道显示250μM迷迭香酸对142μg/ml豌豆PBGS处理30分钟的效果，第3泳道显示添加10mM底物对该四级结构平衡的效果。
根据我们的建模结果，该联苯化合物与豌豆PBGS六聚体的“腋窝”的相互作用主要通过蛋白亚基A，B和E与迷迭香酸的极性基团之间的氢键来完成。该蛋白含有迷迭香酸4.0埃范围内另外的氢键合电势。因此，可以通过对迷迭香酸分子添加另外的氢键合电势而制备具有改进的结合性能的迷迭香酸衍生物。例如，可以在任一苯基的5位添加羟基以提高对蛋白的氢键合。与蛋白的另外的疏水作用可以通过取代该分子丙酸部分2位的苯基或苄基而获得。
尽管本发明参考其具体实施例已经详细地进行了描述，很明显的是本领域技术人员可以不偏离本发明的实质和范围而对其进行各种改变和修饰。
参考文献1.Battersby，A.R.四吡咯生命的色素。Nat.Prod.Rep.17，507-526(2000)。
2.Jaffe，E.K.金属酶的胆色素原合成酶家族。Acta Crystallogr.DBiol.Crystallogr.56，115-128(2000)。
3.Akagi，R.，Yasui，Y.，Harper，P.& Sassa，S.在具有12％红细胞酶活性的健康儿童中δ氨基酮戊酸脱水酶的新突变。Br.J.Haematol.106，931-937(1999)。
4.Schulze，A.，Frommhold，D.，Hoffman，G.F.& Mayatepek，E.对干血迹斑点中的δ氨基酮戊酸脱水酶的分光光度测量微量分析用于确认I型遗传性酪氨酸血症。Clin.Chem.47，1424-1429(2001)。
5.Maruno，M.等在ALAD卟啉症中δ氨基酮戊酸脱水酶(ALAD)缺乏的高度异源性质。Blood 97，2972-2978(2001)。
6.Jaffe，E.K.，Martins，J.，Li，J.，Kervinen，J.& Dunbrack，R.L.，Jr.导致抑制人胆色素原合成酶的分子机制.J.Biol.Chem.276，1531-1537(2001).
7.Jaffe，E.K.等人胆色素原合成酶的人造基因允许比较参与铝中毒易感性的等位基因变化。J.Biol.Chem.275，2619-2626(2000)。
8.Jaffe，E.K.等大肠杆菌胆色素原合成酶的刺激性镁的作用的特征。Biochemistry 34，244-251(1995)。
9.Petrovich，R.M.，Litwin，S.& Jaffe，E.K.日本慢生大豆根瘤菌胆色素原合成酶使用两个Mg(II)和单价阳离子。J.Biol.Chem.271，8692-8699(1996)。
10.Frankenberg，N.，Jahn，D.& Jaffe，E.K.铜绿假单胞菌含有不需要催化的金属离子的新型V胆色素原合成酶。Biochemistry 38，13976-13982(1999)。
11.Erskine，P.T.等5-氨基酮戊酸脱水酶，一种杂合醛缩酶的X射线结构。Nat.Struct.Biol.4，1025-1031(1997)。
12.Erskine，P.T.等复合有抑制剂酮戊酸的大肠杆菌5-氨基酮戊酸脱水酶在分辨率2.0A的X射线结构。Biochemistry 38，4266-4276(1999)。
13.Erskine，P.T.等具有酮戊酸的酵母5-氨基酮戊酸脱水酶的Schiff碱复合物。Protein Sci.8，1250-1256(1999)。
14.Frankenberg，N.等Mg2+-依赖的胆色素原合成酶的高分辨率晶体结构。J.Mol.Biol.289，591-602(1999)。
15.Erskine，P.T.等酵母5-氨基酮戊酸脱水酶的MAD分析它们在测定结构和定义金属结合位点中的应用。Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.56，421-430(2000)。
16.Kervinen，J.等通过4，7-dioxosebacic acid，一种允许种类选择性显著的抑制剂自杀性灭活胆色素原合成酶的力学基础。Biochemistry 40，8227-8236(2001)。
17.Erskine，P.T.等复合有两种二价酸抑制剂的酵母5-氨基酮戊酸脱水酶的X射线结构。FEBS Lett.503，196-200(2001)。
18.Erskine，P.T.等复合有底物和三种抑制剂的酵母5-氨基酮戊酸脱水酶的X射线结构。J.Mol.Biol.312，133-141(2001)。
19.Jaffe，E.K.等通过4-oxosebacic acid种类特异性抑制胆色素原合成酶by.J.Biol.Chem.277，19792-19799(2002)。
20.Frere，F.等复合有5-氟酮戊酸的铜绿假单胞菌胆色素原合成酶的结构显示双Schiff碱机制。J.Mol.Biol.320，327-247(2002)。
21.Murzin，A.G.，Brenner，S.E.，Hubbard，T.& Chothia，C.SCOP蛋白数据库的结构分类用于调查序列和结构。J.Mol.Biol.247，536-540(1995)。
22.Kervinen，J.等来自豌豆的胆色素原合成酶从人造基因的表达，动力学特征，和亚基相互作用的新含义。Biochemistry 39，9018-9029(2000)。
23.Segel，I.H.酶动力学(Euzyme kinetics)。64-71(John Wiley&Sons，Inc.，1975).
24.Jaffe，E.K.胆色素原合成酶金属离子结合位点不寻常的系统发生学变异。Chem.Biol.10，25-34(2003)。
25.Frankenberg，N.，Heinz，D.W.& Jahn，D.来自铜绿假单胞菌的Mg2+-反应性胆色素原合成酶的生产，纯化和特征。Biochemistry38，13968-13975(1999)。
26.Schneider，H.A.叶绿素生物合成的酶学能力酶的激活和从头合成。Z.Naturforsch 31，55-63(1976)。
27.Papenbrock，J.，Mock，H.P.，Tanaka，R.，Kruse，E.& Grimm，B.镁螯合酶活性在四吡咯生物合成途径早期步骤中的作用。PlantPhysiol.122，1161-1169(2000)。
28.Papenbrock，J.& Grimm，B.四吡咯生物合成的调控网络--对涉及质体的代谢和发育控制的细胞内信号传递的研究。Planta 213，667-681(2001)。
29.Walker，D.A.Curr.Top.Cell Regul.11，203-241(1976)。
30.Stolz，M.& Dornemann，D.来自单细胞绿色海藻Scenedesmus obliquus突变体C-2A′的5-氨基酮戊酸脱水酶的纯化、金属辅因子、N末端序列和亚基组成。Eur.J.Biochem.236，600-608(1996)。
31.Tamai，H.，Shioi，Y.& Sasa，T.Plant Cell Physiol.20，435-444(1979)。
32.Laue，T.，Shaw，B.D.，Ridgeway，T.M.& Pelletier，S.L.《生物化学合聚合物科学(Biochemistry and Polymer Science)》，分析超离心(Harding，S.E.，Rowe，A.& Horton，J.C.编)90-125(皇家化学学会，剑桥，UK，1992)。
33.Jaffe等，“胆色素原合成酶催化的反应中早期步骤的解析对形成Schiff′s碱的要求”J.Biol.Chem.261，9348-9353.1986。
34.Edwards等(1990).Proc Natl Acad Sci USA 87(9)p3459-3463。
35.Lloyd等(1991).Mol.Gen.Genet.225(2)209-216。
36.Stockhaus等(1989).EMBO Journal 8(9)2445-2451。
37.Leyva等(1995)Plant Physiology 108(1)39-46。
38.Campbell等(1994)Canadian Journal of Forest Research 24(8)1689-1693。
39.Fejes等(1990).Plant Mol Biol 15(6)p921-932。
40.Luebberstedt等(1994)Plant Physiology 104(3)997-1006。
41.Luan等(1992).Plant Cell 4(8)971-981。
42.Matsuoka 等(1993).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(20)9586-9590。
43.Cerdan等(1997)Plant Molecular Biology 33(2)p245-255。
44.Truernit等(1995)Planta 196(3)564-570。
45.Oelmueller等(1992).Res.Photosynth.Proc.Int.Congr.Photosynth.，9th第3卷p219-24.编辑Murata，Norio。出版社Kluwer，Dordrecht，Neth。
46.Kretsch等(1995)Plant Journal 7(5)p715-729。
47.Bevan等(1986)Nucleic Acids Res.14(11)4625-4638。
48.Jefferson等(1990)Plant Mol.Biol.14995-1006。
49.Muller et al(1990)Mol.Gen.Genet.224136-146。
50.Salanoubat和Belliard(1987)Gene 6047-56.
51.Salanoubat和Belliard(1989)Gene 84181-185。
52.Hannapel(1990)Plant Physiol.94919-925。
53Rohde等(1990)J.Genett.& Breed，44311-315。
54.Rocha-Sosa等(1989)EMBO J.8(1)23-29。
55.Mignery et al(1988)Genet 6227-44。
56.Tierney等(1987)Planta 172356-363。
57.Pedersen等(1982)Cell 291015-1026。
58.Zheng等(1993)Plant J.43357-3366。
59.Russell和Fromm(1997)Transgenic Research 6(2)157-168。
60.Samac等(1990)Plant Physiol.93907-914。
61.Suzuki等(1994)Plant Mol.Biol.25(3)507-516。
6.2.1Daniell等(1998)Nature Biotechnology 16345-348。
63.Daniell等，“通过叶绿体基因组的基因工程含有除草剂抗性”Nature Biotechnology，16345-348(1998).
64.Potrykus等(1985)，Mol.Gen.Genett.199183-188.
65.Potrykus，I.等，“直接基因转移到禾本科单子叶植物(Graminaceous Monocot)细胞”，Mol.Gen.Gene t.，199，pp.183-188，(1985)。
66.Hinchee等，Bio/Technoloqy 6915-922(1988)。
67.Hinchee，M.A.等，“使用农杆菌介导的DNA转移产生转基因大豆植物”，Bio/Technology，6，pp.915-922，(1988年8月)。
68.Stalker等(1988)J.Biol.Chem.2636310-6314。
69.Stalker，D.M.等，“表达细菌解毒基因的转基因植物的除草剂抗性“，Science，242，pp.419-422，(1988年10月21日)。
70.EP 0154204 Sep.，1985。
71.Thillet等(1988)J.Biol.Chem.26312500-12508.
72.Thillet，J.等，“小鼠二氢叶酸还原酶的位点导向的突变”，TheJournal of Biological Chemistry，263(25)，pp.12500-12508，(1988年9月)。
73.Herrera-Estrella等(1983)Nature 303209。
74.Bevan(1984)Nucleic Acids Res.12(22)8711-8721。
75.Klee等(1985)Bio-Technology 3(7)637-642。
76.Daniell等(1998)Nature Biotechnology 16345-348。
77.Daniell等，“通过叶绿体基因组的基因工程而含有除草剂抗性”，Nature Biotechnology，16345-348(1998)。
78.Pedersen等(1982)Cell 291015-1026。
79.Fraley等(1983)Proc Natl Acad Sci USA 804803-4807。
80.Rogers，S.G.等，“第15章用于植物转化的改进载体表达盒式载体和新的选择性标记物”，《酶学方法(Methods in Enzymology)》，V.153重组DNA，D部分，Academic Press，Inc.Ray Wu等(编)，pp.253-277(1987)。
81.Rogers等(1987)用于植物转化的改进载体表达盒式载体和新的选择性标记物”，《酶学方法》，R.Wu和L.Grossman编辑.p253-277。San DiegoAcademic Press。
82.Schmidhauser和Helinski.(1985)J.Bacteriol.164-155。
83.Horsch和Klee.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.834428-4432。
84.Ammirato等(1984)植物细胞培养手册-作物类。MacmillanPubl.Co。
85.Fromm，M.，(1990)作物改良分子策略UCLA会议，Apr.16-22，1990.Keystone，Colo。
86.Vasil等(1990)Bio/Technology 8429-434。
87.Vasil等(1992)Bio/Technology 10667-674。
88.Hayashimoto等(1990)Plant Physiol.93857-863。
89.Datta等(1990)Bio-technology 8736-740。
90.Breinig等(2003)Nat.Struct.Biol10，757-763)。
91.(Xiang，Z.，Soto，C.S.，和Honig，B.(2002)Proc Natl Acad SciU S A 99，7432-7437)92.(Kundrat，L.，Martins，J.，Stith，L.，Dunbrack，R.L.，Jr.，和Jaffe，E.K.(2003)J Biol Chem 278，31325-31330)93.PCT公开WO 84/02913。
94.PCT公开WO 93/19189。
95.PCT公开WO 92/04449。
序列表<110>福克斯蔡斯癌症中心(Fox Chase Cancer Center)<120>六聚体胆色素原合成酶作为开发抗生素和除草剂的靶(Hexameric Porphobilinogen Synthase as a Target for the Developmentof Antibiotics and Herbicides)<130>SCT060059-47<140>Not Yet Assigned<141>2004-07-07<150>60/485,253<151>2003-07-07<150>60/577,312<151>2004-06-04<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3142<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1cttacgcggt ctgtgggaga ccggagcggg agacagcggt gacaggagca gcggccggga 60gcccttaggg aggcagacag agcctgcagc caatgcccca ggagccctcg gttccaacca120actgatgccc ctgtgcccac tggcccacgc catgcagccc cagtccgttc tgcacagcgg180ctacttccac ccactacttc gggcctggca gacagccacc accaccctca atgcctccaa240cctcatctac cccatctttg tcacggatgt tcctgatgac atacagccta tcaccagcct300cccaggagtg gccaggtatg gtgtgaagcg gctggaagag atgctgaggc ccttggtgga360agagggccta cgctgtgtct tgatctttgg cgtccccagc agagttccca aggacgagcg420gggttccgca gctgactccg aggagtcccc agctattgag gcaatccatc tgttgaggaa480gaccttcccc aacctcctgg tggcctgtga tgtctgcctg tgtccctaca cctcccatgg540tcactgcggg ctcctgagtg aaaacggagc attccgggct gaggagagcc gccagcggct600ggctgaggtg gcattggcgt atgccaaggc aggatgtcag gtggtagccc cgtcggacat660gatggatgga cgcgtggaag ccatcaaaga ggccctgatg gcacatggac ttggcaacag720ggtatcggtg atgagctaca gtgccaaatt tgcttcctgt ttctatggcc ctttccggga780tgcagctaag tcaagcccag cttttgggga ccgccgctgc taccagctgc cccctggagc840acgaggcctg gctctccgag ctgtggaccg ggatgtacgg gaaggagctg acatgctcat900ggtgaagccg ggaatgccct acctggacat cgtgcgggag gtaaaggaca agcaccctga960cctccctctc gccgtgtacc acgtctctgg agagtttgcc atgctgtggc atggagccca 1020ggccggggca tttgatctca aggctgccgt actggaggcc atgactgcct tccgcagagc 1080aggtgctgac atcatcatca cctactacac accgcagctg ctgcagtggc tgaaggagga 1140atgatggaga cagtgccagg cccaagaact agaactttaa aacgttcccg gggcctcaga 1200caagtgaaaa ccaaagtaaa tgctgctttt agaactgtgc cctcatgccc tcttcctgct 1260cacatgctag cggggcccag cagccctggg tggttttgcc agcatgctaa ctcttgtaac 1320
tcgcagctgc atcctatgag ctctcccaag cttccccgcc cctcccctgg gtcagccgtg 1380aggcccacct ttgccaccct cagctctttc ctctggtgtg gcttcagctt gaaagcaacc 1440tggagtcggg ggcacagcct ttggggcctg gctgggagag ggtcttggag cattagggga 1500agaagagagc agtgggatct tggggcctga gaagccttgg aacgcttctg gcagcagagc 1560tgggtgtggg aatgaggcct agatcgatat ccctgggtta gagttgaaat ttgccgcaat 1620tccactggaa ggcatttccc acgaggccag aggttgccag gctgcctgag gtctcctatt 1680ctactctgaa ccataaaccc agagaagaat tactcattaa ccagcataaa tactgcctga 1740ggatcaaaac tcagaggcaa agagggagtt cctgactgct agaggtgcca ccaccacaaa 1800cactttttat tcaggagata ctttttgaga atctctgctc tgttcctagg ttcagtgctg 1860ggtcctggga atacagcagg acagacctca gcttatctct tcatagaaat tatacaaaga 1920gaattgggga gacagctaag aagaaaacaa agaaataaag cagttacaaa ttgtgataag 1980tgctttgaag gaaagaaggg gtctgagaca acaacaggga aggggcctct cttgaaacag 2040tagttgggaa ggaggcagac atgcaccagt gatgtggtga caggtgctct gaaggaggtc 2100accaggacct gacctctttg aaggatcaga aaatacttcc ctgaaggact gacatttgag 2160cctagacctg aagggtgagc catcaagcta agacaattgg ggaagagcat tccagggaga 2220gggaggagtt gtgcaaaggc cctggggctc cttctagctg gaggaatgca aggctagctt 2280gtctggagca ctgagaggat ggcctgaact gagtggagag agacagacca ggaccaaacc 2340atgcagaggt caagggccac attcaccttt tcagagtgac tcaatcaaat ttgtagtttg 2400taaaagtatt ttaacagctc tgcggcaaag tgcaaatgaa aagtcttgat ggcatggact 2460ggagcgggga cagtggggat ggagaaaggg gaatggattg tggatgtgtt tagaaggtag 2520attcgatgtg aaggatgaat ctggcttgac cttctgggtg gctgatgggc catttactga 2580gatggggcag cctggaagag gaacagaagc agggtcgggg tggagggaga atactaaact 2640tagcttgaga cattttgcaa taaggaagct atatctagag tgcttatgtg actcacctaa 2700ggccactcaa caagtttgtg gcagaactgg attagaactg cacagaaaac agccaagctg 2760ggatttgaac ccatgtagtc caactccaag gcctctgccc ctaaccactg tgccatacca 2820cctcccaata atcaacagca aaattatagg tctaacaatg ttttatagac acccctccat 2880ttatgtgatg ggtttgcatc ctgataaacc catcataagt tgaaaatatg atcataagtt 2940gaaaatatga tcataagtca aaaatgtatt taatatacct aacctaccaa acatcatagc 3000ttagcctagc ctgccttaaa catgctcaga acacttacat tagcctacag tgggcaaaac 3060tatccaacac aaaatctata ttgtaataaa gttgtaaaga attttgaata aaaattcaat 3120atttgaaaaa aaaaaaaaaa aa3142<210>2<211>1154<212>DNA<213>Homo sapiens<400>2gcagccaaag ccccaggagc cctaggttcc aaccaactga tgcccctgtg cccactggcc 60cacgccatgc agccccagtc cgttctgcac agcggctact tccacccact acttcgggcc120tggcagacag ccaccaccac cctcaatgcc tccaacctca tctaccccat ctttgtcacg180gatgttcctg atgacataca gcctatcacc agcctcccag gagtggccag gtatggtgtg240aagcggctgg aagagatgct gaggcccttg gtggaagagg gcctacgctg tgtcttgatc300tttggcgtcc ccagcagagt tcccaaggac gagcggggtt ccgcagctga ctccgaggag360tccccagcta ttgaggcaat ccatctgttg aggaagacct tccccaacct cctggtggcc420tgtgatgtct gcctgtgtcc ctacacctcc catggtcact gcgggctcct gagtgaaaac480ggagcattcc gggctgagga gagccgccag cggctggctg aggtggcatt ggcgtatgcc540aaggcaggat gtcaggtggt agccccgtcg gacatgatgg atggacgcgt ggaagccatc600aaagaggccc tgatggcaca tggacttggc aacagggtat cggtgatgag ctacagtgcc660aaatttgctt cctgtttcta tggccctttc cgggatgcag ctaagtcaag cccagctttt720
ggggaccgcc gctgctacca gctgccccct ggagcacgag gcctggctct ccgagctgtg780gaccgggatg tacgggaagg agctgacatg ctcatggtga agccgggaat gccctacctg840gacatcgtgc gggaggtaaa ggacaagcac cctgacctcc ctctcgccgt gtaccacgtc900tctggagagt ttgccatgct gtggcatgga gcccaggccg gggcatttga tctcaaggct960gccgtactgg aggccatgac tgccttccgc agagcaggtg ctgacatcat catcacctac 1020tacacaccgc agctgctgca gtggctgaag gaggaatgat ggaggacagt gccaggccca 1080agaactagaa ctttcaaacg ttcccggggc ctcagacaag tgacaaccaa agtaaatgct 1140gcttttagaa ctgt 1154<210>3<211>330<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Met Gln Pro Gln Ser Val Leu His Ser Gly Tyr Phe His Pro Leu Leu1 5 10 15Arg Ala Trp Gln Thr Ala Thr Thr Thr Leu Asn Ala Ser Asn Leu Ile20 25 30Tyr Pro Ile Phe Val Thr Asp Val Pro Asp Asp Ile Gln Pro Ile Thr35 40 45Ser Leu Pro Gly Val Ala Arg Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Glu Met50 55 60Leu Arg Pro Leu Val Glu Glu Gly Leu Arg Cys Val Leu Ile Phe Gly65 70 75 80Val Pro Ser Arg Val Pro Lys Asp Glu Arg Gly Ser Ala Ala Asp Ser85 90 95Glu Glu Ser Pro Ala Ile Glu Ala Ile His Leu Leu Arg Lys Thr Phe100 105 110Pro Asn Leu Leu Val Ala Cys Asp Val Cys Leu Cys Pro Tyr Thr Ser115 120 125His Gly His Cys Gly Leu Leu Ser Glu Asn Gly Ala Phe Arg Ala Glu130 135 140Glu Ser Arg Gln Arg Leu Ala Glu Val Ala Leu Ala Tyr Ala Lys Ala145 150 155 160Gly Cys Gln Val Val Ala Pro Ser Asp Met Met Asp Gly Arg Val Glu165 170 175Ala Ile Lys Glu Ala Leu Met Ala His Gly Leu Gly Asn Arg Val Ser180 185 190Val Met Ser Tyr Ser Ala Lys Phe Ala Ser Cys Phe Tyr Gly Pro Phe195 200 205Arg Asp Ala Ala Lys Ser Ser Pro Ala Phe Gly Asp Arg Arg Cys Tyr210 215 220Gln Leu Pro Pro Gly Ala Arg Gly Leu Ala Leu Arg Ala Val Asp Arg225 230 235 240Asp Val Arg Glu Gly Ala Asp Met Leu Met Val Lys Pro Gly Met Pro245 250 255Tyr Leu Asp Ile Val Arg Glu Val Lys Asp Lys His Pro Asp Leu Pro260 265 270
Leu Ala Val Tyr His Val Ser Gly Glu Phe Ala Met Leu Trp His Gly275 280 285Ala Gln Ala Gly Ala Phe Asp Leu Lys Ala Ala Val Leu Glu Ala Met290 295 300Thr Ala Phe Arg Arg Ala Gly Ala Asp Ile Ile Ile Thr Tyr Tyr Thr305 310 315 320Pro Gln Leu Leu Gln Trp Leu Lys Glu Glu325 330
权利要求
1.包含一种试剂的组合物，该试剂通过结合到多聚体蛋白的结合位点并由此影响单元的平衡而影响所述多聚体蛋白，其中所述多聚体蛋白包括具有多个所述单元的集合，其中各所述单元包括第一互补表面和第二互补表面，以及其中一个单元的第一互补表面与另一个单元的第二互补表面相联系，假设该集合是不同四级结构同工型中的至少一种，条件是在所述多聚体蛋白中(1)各所述单元的结构决定所述不同四级结构同工型的结构，(2)所述单元处于平衡和(3)所述不同四级结构同工型的结构影响多聚体蛋白的功能。
2.权利要求1的组合物，其中影响所述多聚体蛋白包括影响四级结构同工型的形成。
3.权利要求1的组合物，其中影响所述多聚体蛋白包括影响所述多聚体蛋白的功能。
4.权利要求3的组合物，其中所述多聚体蛋白的功能是活性并且影响是抑制或活化中的至少一种。
5.权利要求4的组合物，其中该试剂结合到具有较低活性的四级结构同工型或具有较高活性的四级结构同工型中的至少一种。
6.权利要求1的组合物，其中各所述单元选自单体、二聚体，三聚体、四聚体、六聚体和八聚体。
7.权利要求1的组合物，其中所述多聚体蛋白选自胆素原合成酶和Ia型核糖核苷酸还原酶.
8.权利要求7的组合物，其中所述多聚体蛋白是包含八个胆色素原合成酶单体的胆色素原合成酶。
9.权利要求8的组合物，其中该试剂是结合到具有较低活性的四级结构同工型的抑制剂，并且其中四级结构同工型包含少于八个胆色素原合成酶单体。
10.权利要求7的组合物，其中所述多聚体蛋白是Ia型核糖核苷酸还原酶，以及该试剂通过选择性结合到对具有较低活性的四级结构同工型独特的结合位点而抑制Ia型核糖核苷酸还原酶。
11.一种组合物，包含通过结合到具有第二数量单体的较低活性形式的多聚体胆色素原合成酶而抑制具有第一数量单体的多聚体胆色素原合成酶的活性形式形成的抑制剂，其中单体的第一数量多于单体的第二数量。
12.权利要求11的组合物，其中多聚体胆色素原合成酶来自细菌、古细菌、或真核生物，假设八聚体胆色素原合成酶包含变构的镁结合位点。
13.权利要求12的组合物，其中多聚体胆色素原合成酶包含催化的锌结合位点。
14.权利要求11的组合物，其中多聚体胆色素原合成酶不包含变构的镁结合位点和催化的锌结合位点。
15.权利要求11的组合物，其中所述较低活性形式是六聚体。
16.权利要求11的组合物，其中所述较低活性形式是二聚体。
17.权利要求11的组合物，其中抑制剂取代金属离子并从而结合在金属离子结合位点。
18.权利要求17的组合物，其中金属离子是锌和/或镁。
19.权利要求11的组合物，其中抑制剂结合在活性位点。
20.权利要求11的组合物，其中抑制剂不是金属阳离子。
21.权利要求11的组合物，其中抑制剂通过结合到含有少于八个单体的多聚体胆色素原合成酶的较低活性形式的不能实施拥抱的结构域而抑制多聚体胆色素原合成酶的活性形式的形成，所述活性形式是八聚体胆色素原合成酶。
22.权利要求11的组合物，其中抑制剂通过结合在除活性位点和/或金属离子结合位点外的位点而抑制多聚体胆色素原合成酶活性形式的形成。
23.权利要求11的组合物，其中抑制剂通过去除金属离子之外的机制而抑制多聚体胆色素原合成酶活性形式的形成。
24.权利要求11的组合物，还包括递送介质，所述递送介质选自药物可接受的介质，口服可接受的介质，抗细菌介质，和有效除草的介质。
25.权利要求24的组合物，其中该组合物有效抑制或防止多聚体胆色素原合成酶活性形式的形成并从而抑制或防止细菌、古细菌和/或真核生物的增长或生长，假设多聚体胆色素原合成酶的活性形式含有变构的镁结合位点。
26.权利要求25组合物，有效治疗或预防由接触细菌、古细菌和/或真核生物导致的疾病。
27.权利要求25组合物，其中该组合物是药物、牙膏、肥皂、消毒剂、抗生物膜组合物，和除草剂中的至少一种。
28.权利要求24的组合物，其中该组合物有效抑制或防止多聚体胆色素原合成酶活性形式的形成并从而抑制或防止细菌、古细菌和/或真核生物的增长或生长，假设多聚体胆色素原合成酶的活性形式不含有变构的镁结合位点和催化锌。
29.权利要求28的组合物，有效治疗或预防由接触细菌、古细菌和/或真核生物导致的疾病。
30.权利要求28组合物，其中该组合物是药物、牙膏、肥皂、和消毒剂中的至少一种。
31.一种对基本以拥抱二聚体的多聚体存在的多聚体胆色素原合成酶是转基因的除草剂抗性植物。
32.权利要求31的除草剂抗性植物，其中多聚体胆色素原合成酶来自人。
33.权利要求31的除草剂抗性植物，其中多聚体胆色素原合成酶不含有变构的镁结合位点。
34.一种组合物，含有结合到不需要锌实现催化功能的多聚体胆色素原合成酶的抑制剂。
35.一种影响多聚体蛋白的方法，该方法包括提供包括具有多个单元集合的多聚体蛋白，其中各所述单元包括第一互补表面和第二互补表面以及其中一个单元的第一互补表面与另一个单元的第二互补表面相关，假设该集合是不同四级结构同工型中的至少一种，条件是(1)所述单元的结构决定所述不同的四级结构同工型的结构，(2)所述单元处于平衡中以及(3)所述不同四级结构同工型的结构影响该多聚体蛋白的功能；提供包含试剂的权利要求1的组合物，其中该试剂通过结合到该集合上的结合位点而影响平衡；并且将该集合与试剂接触，其中该试剂通过结合到结合位点并由此影响所述多聚体蛋白而影响平衡。
36.权利要求35的方法，其中影响所述多聚体蛋白包括影响四级结构同工型的形成。
37.权利要求35的方法，其中影响所述多聚体蛋白包括影响所述多聚体蛋白的功能。
38.权利要求35的方法，其中所述单元选自单体、二聚体，三聚体、四聚体、六聚体和八聚体。
39.权利要求35的方法，其中该试剂影响所述多聚体蛋白的功能。
40.权利要求39的方法，其中所述多聚体蛋白的功能是活性并且影响是抑制或活化中的至少一种。
41.权利要求40的方法，其中该试剂结合到具有较低活性的四级结构同工型或具有较高活性的四级结构同工型中的至少一种。
42.权利要求41的方法，其中试剂结合到具有较高活性的四级结构同工型。
43.权利要求35的方法，其中所述多聚体蛋白选自胆色素原合成酶和Ia型核糖核苷酸还原酶。
44.权利要求43的方法，其中所述多聚体蛋白是包含八个胆色素原合成酶单体的胆色素原合成酶。
45.权利要求43的方法，其中所述多聚体蛋白是Ia型核糖核苷酸还原酶并且该试剂通过选择性结合到对具有较低活性四级结构同工型独特的结合位点而抑制Ia型核糖核苷酸还原酶。
46.调整细胞、组织、或生物体内生理活性的方法，该方法包括提供细胞、组织和生物体，其中细胞、组织或生物体包括含有具有多个单元集合的多聚体蛋白，其中各单元包括第一互补表面和第二互补表面以及一个单元的第一互补表面与另一个单元的第二互补表面相关，假设该集合是不同四级结构同工型中的至少一种，条件是(1)所述单元的结构决定所述不同的四级结构同工型的结构，(2)所述单元处于平衡中以及(3)所述不同四级结构同工型的结构影响该多聚体蛋白的功能；以及向细胞、组织或生物体提供包含该试剂的权利要求1的组合物，其中该试剂通过结合到单元上的结合位点并由此影响四级结构同工型的形成和调整生理活性而影响平衡。
47.抑制多聚体胆色素原合成酶形成活性形式的方法，该方法包括将权利要求11的组合物施用于多聚体胆色素原合成酶；将组合物与较低活性形式联系；抑制较低活性形式集合形成活性形式并从而抑制多聚体胆色素原合成酶形成活性形式。
48.操纵植物生长或发育的方法，包括将权利要求27的组合物施用到植物，其中该植物是除草剂抗性的，并且对基本以拥抱二聚体的多聚体形式存在的多聚体胆色素原合成酶是转基因的。
49.权利要求48的方法，其中多聚体胆色素原合成酶不含有变构的镁结合位点。
50.制备抗细菌表面的方法，该方法包括提供权利要求27的组合物；提供表面形成基质；将组合物与表面形成基质结合，并从而制备抗细菌表面。
51.权利要求50的方法，其中抗细菌表面防止或抑制生物膜的形成。
52.权利要求11的组合物，其中抑制剂是迷迭香酸或其衍生物。
全文摘要
本发明公开了抑制多聚体蛋白胆色素原合成酶和Ⅰa类核糖核苷酸还原酶的组合物，公开了对于多聚体蛋白胆色素原合成酶而言是转基因的除草剂抗性植物及其使用方法。
文档编号A61K31/00GK1835739SQ200480023403
公开日2006年9月20日 申请日期2004年7月7日 优先权日2003年7月7日
发明者艾琳·K·贾菲 申请人:福克斯蔡斯癌症中心