含l-dna的药物组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及L-DNA的应用，其可结合在L-RNA上，特别是反义反应中，并可任选地在L-RNA的靶序列范围内裂解该L-RNA，其用于制备药物组合物以用来治疗由于含L-RNA的治疗分子的给药而产生的不希望的生理副反应。用L-DNA还可裂解内生靶RNA或DNA。
【专利说明】含L-DNA的药物组合物
发明领域
[0001]本发明涉及含L-DNA的药物组合物、L-DNA用于制备药物组合物的应用、以及制备这种药物组合物的方法。
【背景技术】
[0002]适体通常是双链D-核酸，其特定结合在任意靶分子上，类似抗体/抗原-反应(Ellington, A.D.等人Nature 346:818-822 (1990))。对给定的祀分子特异性的适体例如通过SELEX-方法从核酸文库中分离(Tuerk, C.等人，Science 249:505-510(1990))。
[0003]在治疗领域中，适体还有结合不希望的代谢产物并由此抑制该代谢产物的目的。这里例如仅提及癌基因的基因产物。在适体的治疗应中的缺点是，其具有不利的药物动力学，即例如通过内生核酸酶(endogene Nukleasen)而非常快地分解。不取决于此,适体反正是较小的分子，因此较快地经肾脏排出。
[0004]镜像异构体(Spiegelmer)实质上是适体,但不同在于,其由L-核苷酸形成。镜像异构体可以是单链或双链的。通过使用L-核苷酸防止由内生核酶引起的分解，并由此大大改善药物动力学，即延长在血清中的停留时间。如在文献Biosgard, R.等人，EurJournal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 32:470-477 (2005)中所述，非-功能性的镜像异构体在代谢方面经2小时的时间也是完全稳定的。在该文献中也述及镜像异构体的诊断使用，其中该镜像异构体例如与放射性的报道物质偶合。
[0005]对给定的靶分子呈特异性的镜像异构体的鉴别例如可如文献Klussmann，S.等人，Nat Biotechnol 14:1112-1115 (1996)中所述进行。关于镜像异构体及其治疗应用可能性也可参阅文献 Vater A.等人，Curr Opin Drug Discov Devel 6:253-261 (2003)。
[0006]镜像异构体的治疗应用中至今是基于镜像异构体不是免疫原(Wlotzka等人，Proc Natl Acad Sci USA 99:8898-8902))。但本说明书中所介绍的研究表明，L-核酸在生物体中完全并非必需是无副作用的。由此得出结论，在使用镜像异构体时，经对病人给药，完全存在不希望的生理副反应的不可忽略的风险，例如免疫反应和/或与内生RNA (包括调控的RNA)的不希望的酶促反应,或还有内生核酸的反义-抑制作用(Watson-Crick-反应(沃森-克里克-反应))。特别是由于在临床I期用单克隆抗体TGN1412所得的负面经验和由于基于上述的关联的镜像异构体的停留时间相对非常长的背景，所以希望在镜像异构体给药时已持有适于待用的镜像异构体的解毒剂，由此在出现不希望的生理副反应时可立刻施用该解毒剂，并因此可在短时间内降低血清中(生物活性)的镜像异构体-水平。
[0007]由另一些有关联资料，即核酶催化的立体选择性Diels-Alder反应已知是L-核酶,对此参阅文献 Seeling, B.等人，Angew.Chem.1nt., 39:4576-4579 (2000)和Seeling, B.等人，Angew.Chem.112:4764-4768 (2000)。
[0008]此外，用于抑制内生核酸例如mRNA或其它非编码核酸的各种方法是已知的。例如其包括但不仅是反义核酸、siRNA、miRNA、piRNA、适体等。通过抑制这样的内生核酸可控制、阻碍或重定向代谢过程，其例如与肿瘤关联的RNA分子有关，也与其它医学领域有关。作为肿瘤关联基因的实例例如可提及H19基因。作为非肿瘤关联基因的实例可提及编码受磷蛋白的基因，其在心衰方面起重要作用。
[0009]由文献WO 2010/088899 A2已知，使用L-核酶来裂解Spiegelzymen (作为解毒剂)和/或内生RNA分子。
[0010]L-DNA 例如由文献 G.Hayashi 等人，Nucleic Acid Symp Ser 49(1):261-262(2005)本身是已知的，其中将这类核酸描述为分子标记物。
【发明内容】
[0011]本发明的技术目的是提供用于剪切镜像异构体和内生核酸的改进方法。
[0012]为实现该技术目的，本发明教导使用L-NDA用于制备药物组合物，其中，该L-NDA可结合在L-RNA上，特别是反义-反应(抑制性的Watson-Crick-反应)，并可任选地在L-RNA的靶序列区裂解该L-RNA，而且特别是用于制备一种药物组合物以用来治疗由于给予含L-RNA的治疗分子而产生的不希望的生理副反应，特别是免疫反应和/或L-RNA与内生RNA (包括调控RNA)的不希望的酶促反应或反义反应。此外，还论及L-NDA在制备用于治疗和预防随过表达至少一种内生基因而出现的疾病的药物组合物中的应用，其中该L-NDA可结合在编码该基因的内生靶-D-DNA或靶-D-RNA的靶序列上，例如在反义反应中，并任选地可裂解所述的靶序列。
[0013]本发明首先基于这种认识，即与至今推测的相反，镜像异构体并非必需是无副反应的，而相反毫无疑问可能够剪切在生物体中存在的核酸并如此产生意外的副作用。同样，不希望的反义反应，即通过在镜像异构体和内生核酸之间的Watson-Crick碱基结合抑制内生核酸也是可能的，这与结合的镜像异构体的酶促反应无关。
[0014]本发明基于另一认识，即L -DNA令人意外地可剪切内生的D-核酸、RNA和DNA或结合在其上。这不是自行可预计的。此外，L-DNA对酶促降解特别稳定，因此不必在分子中引入(大多是大体积的)保护基团，由此，一另面将得到有利的药物动力学特性，而另一方面有利于吸收入细胞中。
[0015]与L-RNA相比，L-DNA的令人意外的优点在于，在细胞中L-DNA的活性比L-RNA更高，对此参见实施例。
[0016]本发明基于在可供L-DNA，即L-DN酶使用的技术教导所构成的认识，其特异性地剪切所给药的镜像异构体或呈抑制性地结合于其上，并因此破坏其生理作用，特别是不希望的副反应。镜像异构体的实例是:Spiegelmer，N0XC89、N0XA42, N0XA50, NOXBlI,NOXAl2, N0XE36, N0XF37 (所有均源自NOXXON公司)，Eli Lilly & C0.公司的镜像异构体，ARCA biopharm 公司的 NU172，ARCHEMIX, ARC1905, ARC1779, ARC183, ARC184, E10030,NU172, REG2, REGl (所有均源自 Archemix Corp.) ,AS1411, AS1405 (两者源自 AntisomaResearch Ltd.), Dicerna Pharmaceuticals Inc.的 DsiRNA, BexCore Inc.的 RNAAptamer BEXCORE, Elan Corp.Pic.的ELAN,或Macugen。因此，在给予镜像异构体时观测不希望的副反应的过程中通过给予这样一种L-DNA可快速、有效和高选择性地去除由代谢引起的不希望的副反应，而且另一方面给药L-DNA的副作用风险特别低。后者不仅是由于得自L-脱氧核糖核苷酸的L-DNA的构成，而且还由于L-DNA的高选择性，即针对该镜像异构体的靶序列。结果，得到对治疗所用的镜像异构体高效且高选择性的解毒剂，并可有效、快速和无副作用地应对该镜像异构体的不希望的副反应。
[0017]原则上对每种RNA分子，包括适体，无论是D-核苷酸或L-核苷酸构成的，均可构建特异性L-DNA，其可剪切RNA分子的靶序列并如此使其裂解(作为核酶起作用)或抑制性结合在其上(反义反应)。这种L-DNA的一个重要特性是在靶序列上的序列特异性结合。但这也意味，由此对所有任意的靶序列均可建立L-DNA的子序列，该含例如裂解位点的L-DNA的子序列与该靶序列杂化。因此在本发明中，仅结构性给出确定的靶序列的确定的L-DNA-子序列是不合适的。因此，在实例中给出的靶序列和L-DNA-子序列仅是示例性，且对本领域专业人员而言，可对所有给定的镜像异构体的靶序列毫无困难地确定合适的即杂化的L-DNA-子序列和基于L-DNA-子序列的信息以常用的方法合成该L-DNA。
[0018]原则上，该治疗分子可以是镜像异构体，或该L-DNA可以与适体共价结合。但该治疗分子也可以含L-DNA (例如除适体外)或由其组成。镜像异构体/适体的组合例如可存在于对核酸酶稳定的适体中。这时本发明的治疗效益在于，通过剪切L-RNA或L-DNA使适体可接近核酸酶，由此，最后可从血清中以较短时间消除可能引起副作用的适体。
[0019]但也可以是，该L-DNA与适体、抗体或肽或蛋白共价结合。在此，例如可如此选择该适体或抗体，以致由于该适体或抗体与细胞表面的相互作用使由L-DNA与适体或抗体组成的整体结构引入细胞中。
[0020]合适的L-DNA可针对在底物序列(Substratsequenz)中保守的裂解位点并且本身具有保守核苷酸，如图1特别是Ia中所示的。对此具体的实例也示于图1c中。
[0021]该药物组合物以至少相应于该L-RNA的给药剂量的剂量包含所述L-DNA,优选该剂量相应于L-RNA的给药剂量的2-10倍，基于分子数或摩尔计。与L-RNA的剂量相比，建议使用超剂量，以确保所有待消除的L-RNA均完全反应。本发明规定的绝对剂量严格视L-RNA规定剂量的所给定的相对的量的比例而定，并因此可由本领域专业人员按L-RNA的规定剂量很容易地加以确定和调整。`
[0022]在本发明的一个优选实施方案中，该药物组合物还含核酸，特别是5-100-mer，优选5-25-mer，其可在L-RNA的靶序列区熔解双链的L-RNA。这里涉及与该靶序列相邻的子序列杂化的序列。由此实现，使该L-RNA的通常由于位阻原因而不可接近的待裂解的区域由于该L-RNA的三级结构而变得可为L-DNA所用。此外还实现，非常特异性地裂解所希望的剪切位点，而非与其它相邻序列的相应的二重体(Duplett)或三重体(Triplett)。
[0023]此外，本发明涉及含L-DNA的药物组合物，其用于治疗由于含L-RNA的治疗分子的给药而引起的不希望的生理副反应，特别是免疫反应。
[0024]但是，根据本发明，本发明的L-DNA也可用于裂解(内生的或如在注射过程中源自病毒或细菌来源的外源的)核酸，主要是RNA，也有DNA，或用于通过在外源核酸上的反义反应抑制该它们。关于DNA的剪切可补充参阅文献Lu, Y.,等人，Current Opinion inBiotechnology 17: 580-588 (2006),或 Jiang, D.,等人，FEBS 277(11): 2543-2549(2010)。由此特别可治疗随某些RNA或DNA，或通过其编码的表达产物的过表达而产生的疾病。因此，该L-DNA作为这种表达产物的抑制剂起作用，即通过裂解编码它们的RNA或DNA或通过在其上的反义结合来抑制或减少该表达。这时在本发明中，只要可抑制任意的靶，则该特定的靶序列(即该待裂解或待结合的RNA或DNA)就这点来说是无关紧要的。仅需要以上述方式在所选的裂解位点范围内使L-DNA或其序列适合于该靶序列的序列。由此，原则上可考虑任意适应症，只要该待治疗的疾病在起因上与该有关的靶序列相关。下面仅提及一些实例，但绝不以此限制本发明的可应用性。
[0025]关于该药物组合物，所有上述的和下面的说明均类似适用。
[0026]最后，本发明还涉及用于制备这样的药物组合物的方法，由此制定和合成L-脱氧核糖核苷酸的序列，该序列可结合在L-核糖核苷酸的给定序列上或结合在D-核糖核苷酸或D-脱氧核糖核苷酸的给定序列上，特别可用于反义反应，和任选地可用于裂解所述的序列，其中将该如此得到的L-DNA配制成药物有效剂量用于给药。在此，该L-DNA通常与制剂的助剂和/或载体物质相混合。在配制范围内也可混合有利于(L-DNA的)细胞吞噬作用的技术上通用的物质，这些物质或共价偶合在L-DNA上，或分开混入组合物中。
[0027]原则上可使一种或多种生理上相容的助剂和/或载体物质与L-DNA相混合，且将该混合物配制成制剂以用于局部或全身给药，特别是口服、肠胃外给药，用于输注或到浸入到目标器官中，用于注射(如静脉注射、肌内注射、囊内注射或腰椎管内注射)，用于施加进齿窝(Zahntaschen)(牙根和牙肉间的空腔)中和/或用于吸入。添加剂和/或助剂的选择与所选的给药形式有关。本发明的药物混合物的制剂的配制可用专业上常用的方法实现。
[0028]作为离子化合物的反荷离子例如可采用Mg++，Pb++，Mn++，Ca++，CaCl+, Na+，K+，Li+或环己基铵，或Cl_，Br-,乙酸根，三氟乙酸根，丙酸根，乳酸根，草酸根，丙二酸根，马来酸根，柠檬酸根，苯甲酸根，水杨酸根，丁二胺，戊二胺，亚精胺，精胺等。合适的固态或液态制剂的制剂形式例如是颗粒，粉末，糖衣丸，片剂，(微_)胶囊，栓剂，糖浆，浆汁，悬浮剂，乳剂，滴剂或注射(1.V、1.p、 1.m、s.C)或雾化(气溶胶)用溶液，用于干粉吸入、经皮方式施加的制剂形式，以及含延缓活性物质-释出的制剂，在其制备中可应用通常的助剂如载体物质，崩解剂，粘合剂，包衣剂，溶胀剂，润滑剂(Gleitmittel)或润滑剂(Schiermittel),味觉剂，甜味剂和增溶剂。也可以将活性物质包封在优选可生物降解的纳米微囊中或引入可生物降解或稳定的多孔纳米颗粒的孔中，例如用于制备供吸入的制剂。也可使用由D-核酸和L-核酸制成的纳米颗粒,例如用于Spiegelzymen和镜像异构体或适体的细胞寻革巴(Seeman, N.C.，Nano Lett.10(6):1971-1978 (2010) ；Sigh, W.，Nature 478(7368):225-228 (2011) ；Sigh, ff., Synapse 65(12):1289-97 (2011) ；Zhao, ff., 等人，Nanotechnology 22(49):490201 (2011) ；Hilt, J.Z., Adv Drug Deliv.Rev.56(11):1533-1536 (2004) ；Lin, C.,等人，Biochemstry 48(8):1663-1674 (2007))。作为助剂可提及例如碳酸钠，碳酸镁，碳酸氢镁，二氧化钛，乳糖，甘露醇和其它糖或环糊精，滑石，乳蛋白，明胶，淀粉，纤维素和其衍生物，动物和植物油如鱼肝油、葵花子油、花生油或芝麻油，聚乙二醇和溶剂如消毒的水和一元醇或多元醇例如甘油。本发明的药物组合物可如此制备，即至少一种本发明使用的物质组合以规定剂量与含给定剂量的药用上合适的和生理上相容的载体和任选的其它合适的活性物质、添加剂或助剂一起混合，并配制成所希望的给药形式。作为稀释剂可使用聚二醇类，水，二甲基亚砜(例如对于治疗皮肤病或风湿的制剂)和缓冲溶液。合适的缓冲物质例如是N, N’ _ 二苄基乙二胺，二乙醇胺，乙二胺，N-甲基匍糖胺，N-苄基苯乙胺，二乙胺，磷酸盐，碳酸氢钠，或碳酸钠。也可在无稀释剂下制备。生理上相容的盐是与无机和有机酸例如乳酸、盐酸、硫酸、醋酸、柠檬酸、对-甲苯磺酸的盐，或与无机或有机碱例如NaOH、KOH、Mg(OH)2、二乙醇胺、乙二胺的盐，或与氨基酸如精氨酸、赖氨酸、谷氨酸等的盐，或与无机盐如CaCl2、NaCl、或其游离离子如Ca2+、Na+、Pb++、Cr、S042_或相应的盐和游离离子Mg++或Mn++或其组合的盐。其可按标准方法制备。优选将pH-值调节为5-9的范围，特别是6-8。
[0029]该上面己论及的本发明的方案是有独创意义的，该方案包括应用L-DNA制备药物组合物，以用于治疗或预防随至少一种内生基因的过表达而出现的疾病，其中该L-DNA可结合在编码该基因的内生靶-D-RNA或靶D-DNA的靶序列上，特别是用于反义反应，并任选可裂解所述的靶序列。如果将该L-DNA安排结合在相关的病毒或细菌的靶序列上，则可治疗或预防病毒或细菌感染。此外，上述方案也类似适用。与此相关，本发明的上述方面的另一方案也是有意义的，即应用L-DNA制备药物组合物，用于治疗或预防由微生物感染哺乳动物所引起的疾病，其中该L-DNA可裂解(或结合，特别是反义反应，在)编码该微生物基因的靶-D-RNA或靶D-DNA的靶序列。作为可考虑的微生物其中可提及病毒、细菌和真菌。原则上该L-DNA可用于结合在含至少部分已知的基因序列的任意微生物的核酸上或用于裂解含至少部分已知的基因序列的任意微生物的核酸，其中为裂解目的，选择该基因序列的区域，该区域例如减弱或抑制该微生物的活性和/或其复制能力和/或减弱或抑制在细胞表面上的结合。
[0030]在此方案中有利的是，通过与D-RNA的反义反应或裂解D-RNA可将该L-DNA用于抑制作用，该D-RNA特别是mRNA或调节RNA，例如而非仅有siRNA、microRNA、shRNA、ncRNA、tRNA.rRNA等，但也可用于裂解D-DNA或结合在其上。由此，可抑制基因或通过其编码的蛋白或编码的或非编码到RNA。这对相较于没有生病的生物体的表达伴随某些基因的过表达而出现的所有疾病均有治疗效果。
[0031]一方面，该方案的优点在于，靶序列的裂解或在其上的结合以非常高的特异性实现，并由此与调节体系也无通常的干扰。此外，确实避免了副作用，例如由使用抑制性的D-核酸如siRNA所引起的。这与siRNA(风险因子等)不同，L-RNA核酶(Ribozyme)和L-DNA酶(DNAzyme)不需辅助分子，由此大大降低了不希望的副反应。
`个L-DNA或L-DNA酶，其中选择序列的前提是，也可剪切双链DNA 或 RNA。
[0033]在L-DNA用于制备药物组合物的根据本发明应用的范围内也可有其它多种方案。
[0034]首先不仅可使用L-DNA结合在另外的核酸上，而且原则上也可用于类似于由核酸组成的适体的已知使用领域。这意味着，借助于本发明的L-DNA，原则上可结合并由此抑制生物体中的所有靶分子。本领域专业人员已知的所有适体技术可相应转用到L-DNA适体上。
[0035]以下面的方法可得到结合给定靶的L-DNA。使选定的靶分子结合在筛选分析的固定(或固体相，例如也可为磁珠)相上。该筛选分析除包括固定相外还包括流动相(大多为一种水溶液，在其中核酸和载体分子是稳定的和可结合的)，该流动相与固定相接触或使其相接触。该流动相含L-DNA文库，即典型地长度为10-500核苷酸的多核苷酸，其序列变化，通常是随机的。这类L-DNA文库可借助于常用的和由产生D-DNA文库的已知合成方法制备。这种L-DNA分子随接触而结合在靶分子上，该L-DNA分子由于其序列可在靶分子上达到稳定的范德瓦尔键合。在此情况下，该键合强度的解离常数通常具有小于100 nmol，较好是小于100 pmol,甚至常为小于I pmol的值。接着从固定相中分离该流动相(含未结合的或仅弱结合的核酸)，例如借助于一次或多次洗涤步骤。然后使含有结合在靶分子上的L-DNA分子的固定相与D-DNA文库相接触。与结合在靶分子上的L-DNA杂化的D-DNA结合在L-DNA上，由此形成靶分子/L-DNA/D-DNA的复合体。未结合的D-DNA再用流动相去除。然后以专业上常用的方法再从如此所得的复合体中洗脱D-DNA，即转移进流动相。现在可将如此得到的D-DNA分子任选扩增(例如借助于PCR)和无论如何进行测序。然后，从如此得到的D-DNA的序列可得到和合成互补的L-DNA。或者，还可从靶分子洗脱该L-DNA，并用在本说明书的另外章节所给的测序方法进行测序。在这段中所述的方法原则上也可在无固定相情况下实施，这种情况下，该靶分子结合在标记分子上来替代结合在固定相上。然后以常用的方法通过结合标记分子和分离未带有该标记分子的分子来从靶/结合的L-DNA的复合体中分离未结合的L-DNA。这种替代方法在功能上完全类似于上面的描述。
[0036]结果得到一种L-DNA分子形式或这种形式的混合物，这种分子形式可以以高亲和性结合在靶分子上。其可在具有任意适应症的本发明的药物组合物的范围中使用。该适应症取决于，哪个靶分子作为与一种疾病相关的因果关系来识别，并应阻止该靶分子以治疗或预防这种疾病。
[0037]在相应的方式中可分离或测定在靶上结合的L-RNA。对此在L-DNA文库的位点使用L-RNA文库。
[0038]在另一选用的方法中，可分离或测定和制备结合在(任意)靶例如靶分子、病毒、细菌、真菌或其它细胞(或其断片)上的L-DNA或L-RNA。为此，提供L-核酸文库，其中在该核酸上任选结合偶合分子或标记分子，例如在该5’ -端的生物素。将靶分子结合在固体相如磁珠上。使该固体相与核酸文库相接触。这时对靶分子有高的结合亲合性的L-核酸结合在靶分子上。使该固体经受一次或多次洗涤方法步骤，由此去除未结合的L-核酸。然后再洗脱该L-核酸，并以专业上常用的方法分离出靶分子。最后对如此所得的L-核酸进行测序，如在本说明书另一处所述。
[0039]在本发明应用的范围内，也可用L-DNA来测试L-DNA的潜在的副作用。在这种测试方法中，使选作有可能性的活性物质的L-DNA (或大量相同的L-DNA分子)与细胞抽取物相接触，例如待治疗的生物体的，并用通常的方法测量，以确定是否仅该细胞抽取物中的靶分子结合在L-DNA上，或还有其它分子结合在L-DNA上。在第一种情况下，该有可能性的活性物质会是非常可能无副作用，这表明，除靶分子外无其它细胞成分被给合或抑制。在后一种情况下，会认为是有副作用。
[0040]L-核酸的测序可以各种方法进行，不依赖于与本发明的其它方面。在用于对L-RNA或L-DNA测序的第一种方法中，将该L-核酸结合在固体相上。这例如可如此进行，以使该核酸含有偶合分子或标记分子如生物素(如上述)。然后，该固体相带有与偶合分子互补的和结合它的分子如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。再使该如此结合在固体相上的L-核酸与D-DNA文库相接触。由此这样的来自文库的D-DNA分子与含互补序列或由互补序列组成的L-核酸杂化。然后使该固体相经受一次或多次洗涤方法步骤，由此去除未结合的D-DNA。之后该结合的D-DNA被L-核酸溶解。接着可进行扩增，例如用PCR。于是该D-DNA经测序。然后由如此得到的D-DNA序列可确定该L-核酸的互补序列。
[0041]另外，也可以如下的测序方法对L-核酸，特别是L-RNA进行测序。在此，该核酸在一端如在5’-端带有偶合分子或标记分子(如上述)，例如生物素。然后该核酸分解成“序列梯”，即以水解方法得到该核酸的不同长度的断片，在理想情况下，为I个碱基至最多整个核酸的碱基数。在L-RNA情况下，可在碱性即pH通常>8，大多为8.5-10下实现。为此可使用含KOH或碳酸氢钠的市售的水解缓冲剂。使如此所得的仍带有偶合分子的断片再结合在固定相上。由此该固定相带有与偶合分子互补的和结合它的分子如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。然后使该固体相经受一次或多次洗涤方法步骤，由此去除不带偶合分子的核酸断片。结果保留经标记的核酸断片的“序列梯”。接着从固定相中洗脱该“序列梯”，并进行质谱研究，由此根据所发现的质量和其分布可推算出该核酸的原始序列。在L-DNA的情况下，进行相应处理，只是在此时通过在酸中即PH < 6，优选< 5下水解产生“序列梯”。
[0042]L-DNA或Spiegelzyme也可用于测定可供使用的mRNA序列。因为siRNA、miroRNA和SpiegeIzyme可使用的这种mRNA序列的测定是非常困难的，因为用计算机技术的预言二级结构是非常不可靠的。这一方面在于，关于RNA分子的三维折叠的规则已知太少，以致该计算机程序不够充分。另一方面认为，细胞中的mRNA是折叠的而不是在溶液中的游离态。因此非常需要使siRNA、miroRNA和Spiegelzyme的使用最佳化。例如这可用体外蛋白生物合成来推算，其中，在原核或真核体外体系(如购自RiNA GmbH，德国)翻译确定(给定)的mRNA,并且该蛋白质的产率依不同Spiegelzyme (有可能性的活性物质)的关联性来测试。现有技术的分子剪切如核酶、siRNA等由于稳定性原因或由于这种剪切需要辅助分子而不适用。
[0043] 无关这里所述的相关内容且作为独立发明来描述的是，L-DNA也可用于非-药物目的。一种应用领域是用L-DNA标记物品或人，用于安全目的和/或真实性目的和/或识别人。为此，将L-DNA施加到该物品上或人身上，并用合适的方法检测该L-DNA的存在和/或其序列。
[0044]作为物品原则上可考虑所有要检验其真实性的物品，标记这些物品用于防偷窃目的，或需要将该物品归属于物主。归属该第一类的是所谓的安全文件和/或有价证件例如护照、身份证、驾照、行车证、签证，其它的身份证件和/或通行证件如出入证、会员证，钞票，门票，税票，邮票，信用卡或标签(例如用于产品保证)。归属该第二类的是体现物质价值和确保防盗窃的物品是例如手饰，钟表，其它贵重物品，技术仪器、汽车等。使用L-DNA也可区分物品，即用对该物品和仅对这种物品具有特征序列的L-DNA标记物品。如果将该序列分配给人或物主，则通过测定施加在该物品上的L-DNA也可将该物品分配给该人或该物主。优选的使用领域还有标记药物产品或其包装或标记博物馆中的展品。
[0045]例如在攻击情况下，对人进行标记可能是值得追求的。被功击的人可借助于含L-DNA的喷雾剂喷射攻击者，由此通过验证在攻击者或其衣服上的L-DNA可确认此人。例如也可采用自动喷射设备来标记进出未准许空间的人。这时只要处于警报装置的报警状态下的警报装置的传感器在该喷射设备作用范围内探测到人，则就触发与警报装置相耦合的喷射设备。这时对人喷以在喷射设备中所包含的含有L-DNA的溶液,然后如前所述可进行对该人的确认。
[0046]虽然D-核酸用于此目的是已知的，但其缺点在于，该D-核酸可由未经授权的人例如用核酸酶加以分解。这特别对确保防盗窃情况或人经标记的情况有所干扰，因为通过使用核酸酶破坏或去除了该标记。此外，使用L-核酸的大优点在于，该L-核酸不能(与D-核酸相反)引入人类的基用组中，以致不会产生可能诱发疾病，特别是形成肿瘤的危险。[0047]这里所述的发明还涉及用于标记物品或人的方法，其中给物品或人或其服装提供L-DNA，并且其中该L-DNA固定在该物品、人或其服装上或固定在该物品、人或其衣服中。此外，本发明还涉及一种在其上和其中含有固定的L-DNA的物品。此外，本发明还涉及一种用于识别物品和人的方法，其中对该物品或人或其衣服分析L-DNA的存在，任选还进行测序。
[0048]术语标记在此意指通过在物品或人上施加以先前在该物品或人上所不具有的标志而标记物品或人。在所有情况下，该标志是具有给定结构的并通过标记外的其它方式不能施加在该物品或人上的那种标志。
[0049]借助于使用D-核酸已知技术可实现所有与标记相关的固定。在最简单的情况下，将含有L-DNA的溶液特别是水溶液施加在物品或人或其服装上并干燥。但如果该L-DNA含于制剂中，该制剂还含有溶解的或分散的粘合剂，则是优选的。原则上所有尚未固化的液态或膏状漆粘合剂制剂、粘附制剂等均适合用作基础制剂，只要其PH小于9，优选小于8。作为溶剂，除水外还可使用所有在漆工艺或粘附剂工艺中常用的溶剂。这也适合于可使用的粘合剂和专业上常用的添加剂。将该制剂施加在待标记的物品或待标记的人上。该所施加的溶液或制剂包含每毫升优选I或IO1-1O16,例如IO3-1O12,特别是IO3-1O9个L-DNA的分子。至少10%，优选至少50%的L-DNA分子宜具有相同的核苷酸序列。
[0050]在本发明的一个优选方案中，该在5’ -端或3’ -端上的L-DNA带有共价结合的光致发光报道分子基团，其中，该报道分子基团的选择前提此外是，经UV-辐射激发而发光，特别是发荧光。作为报道分子基团可使用所有的在生物化学中专业上常用的光致发光分子基团。如果用UV-光照射根据本发明标记的物品或标记的人，则按由此所激发的发光可由目视或仪器检测到该标记。该L-DNA可在相反端共价结合标记基团如生物素。然后以主动探测含L-DNA的标记的方式可按上述方法可释出该标记和测序。需要时以该序列可归属到基于该所测量的序列所登录的人或经营单位。
[0051]在本发明的扩展方案中，该L-DNA含有至少一个不可变的序列区段和/或一个可变的序列区段。该不可变的序列 区段对所有的或对至少一个含该L-DNA的标记的基团均是相同的，即所有标记包含具有该序列区段的序列的子序列。该可变的序列区段可以是个性化的。如果通过例如用UV照射的证实还应与含所述序列区段的L-DNA的存在相关，则这是合适的。由此将会产生不同于由不取决于根据本发明的L-DNA的存在的任意发光物质所产生的发光效果。
[0052]此外，在此扩展方案中，如果本发明所用的L-DNA具有分子信标结构则是有利的。这里涉及具有发针结构或茎-环-结构的单链核酸，其中一方面形成茎的端带有发光分子，并且对置地带有猝灭剂如Dabcyl。该两端的至少之一是(通常5_20碱基对长)的不可变的序列(序列区段)。在L-DNA的非-杂化状态中，该荧光通过F^rster-共振能转移到猝灭剂上而受抑制，在用UV辐照时未见发光效果。该L-DNA的证实如此实现，即该标记的区域首先用与该L-DNA的不可变序列区段互补的核酸特别是L-DNA的溶液喷雾。其用该不可变的序列区段杂化，并由此将发光分子和猝灭剂相互分开。如果这时用UV光照射该标记，则可观测或用仪器检测到荧光。可能的可变序列区段的洗脱可如上述进行。
[0053]在上述优选实施形式的一种方案中，该标记到L-DNA不作为单链存在，而是单链的端部(涉及端，总是指3’或5’)带有发光分子。该端形成给定数碱基的不可变序列区段。在一端上带有猝灭剂的互补的L-DNA在其上杂化，而前提是该猝灭剂足够近地配置在发光分子上，以抑制发光。该互补的L-DNA的长度比该不可变的序列区段的长度短至少2个碱基，优选短至少5个碱基。如果含与不可变的序列区段互补且其长度比带有猝灭剂的那个L-DNA的长度长至少2个碱基，优选长至少5个碱基的L-DNA的溶液，则其排挤含猝灭剂的L-DNA,并与该不可变的序列区段杂化。此刻如果用UV照射，则该发光分子发光，并可看到或用仪器检测到该标记。接着可再经如上洗脱和测序，以确定可能的可变序列。
[0054]由此本发明还包括含有数据库的记录系统(Registersystem),其中在数据库中包括各种L-DNA标记物的可变的序列区段，并归属到人员、公司或行政当局。借助于该记录系统，可很容易将由标记所推测出的可变的序列区段归属到所属的行政当局、博物馆、公司或人员。
[0055]原则上要提及的是，L-DNA的上述应用也可毫无困难地类似用L-RNA实施。
[0056]下面按附图和实施例详述本发明。
附图简介
[0057]图1:本发明的L-DNA (a)和锤头状核酶(b)的一般结构，各含所列出的靶序列特异性和保守结构元素以及具体的L-DNA (C)和具体的锤头状核酶(d)在结合在该绿荧光蛋白GFP(b)的相同的祀序列上后的比较,该二级结构的图示，(也见Zaborowska, Z.，等人，The Journal of Biological Chemistry 277(43):40617-40622 (2002), Kim, K.,等人，Bull.Korean Chem.Sc0.27 (5):657 及以后几页(2006)，和 Hertel, K.J.,等人，Nucleic Acids Research 20(12):3252 及以后几页(1992))。
[0058]图2:通过L-和D-DNA酶和锤头状核酶裂解L-和D-GFP靶序列的分析。
[0059]图3:通过L-DNA酶(L-Dz)裂解D-GFP靶序列和通过D-DNA酶(D-Dz)裂解L-GFP的MgCl2-浓度依赖性的比较。
[0060]图4:通过具有确定裂解位点的L-DNA酶(L-Dz)裂解D-GFP靶序列的MgCl2-浓度依赖性。
[0061]图5:在不同酶-浓度和24 h温育条件下，在GFP-转移细胞中各种DNA酶和RNA酶的活性比较。
[0062]图6:通过荧光强度数据定量图5的结果。
[0063]图7:在不同酶-浓度和24 h温育条件下，L-DNA酶和L-核酶的活性的直接比较。
[0064]图8:通过荧光强度数据定量图7的结果。
[0065]图9:图5的主题，但在48 h温育后。
[0066]图10:通过荧光强度数据定量图9的结果。
实施例
[0067]实施例1:裂解试验
在各种条件下测量L-核酶和D-核酶的活性。该基本条件如下。在2 μπι DNA酶或RNA酶存在下，在50 mM的Tris-HCL缓冲液、pH 7.5、20°C下，用10 μ I反应混合物温育0.2μ M靶RNA或DNA培育2小时(因此DNA酶或RNA酶/靶的比为10:1)。在反应前，将靶RNA或DNA和DNA酶或RNA酶在72°C下变性2分钟，并在热封阻中慢慢(1°C /min)冷却至250C ο研究浓度为0.1-10 mM的Mg2+-离子的影响。用20%聚丙烯酰胺凝胶电泳在7 M尿素存在下于0.09 Tris-硼酸盐缓冲液,pH 8.3中分离裂解产物。突光分析在PhosphoimagerFuji Film FLA 5100上进行。用程序Fuji分析程序取得数据。用Excel制成图。
[0068]实施例2:靶序列和核酶的制备
所有靶序列均用化学合成方法制备。合成产物的纯度大于90%。
[0069]作为DNA酶或RNA酶，按照靶序围绕剪切位三聚体来选择DNA酶或RNA酶的可变区，并合成制备该RNA酶序列或DNA酶序列。合成产物的纯度大于85%。
[0070]所有合成产物均在5’-端用突光素标记。
[0071]实施例3:测量细胞中的活度
按规程用I μ g EGFP质粒转染海拉细胞。用25、50或100 nM的所用的DNA酶或RNA酶的溶液进行温培。24 h或48 h后用Leica显微镜分析该细胞，或借助于Mult1-ModeMicroplate Reader Synergy-2 按规程测量突光强度(RFU)。
[0072]实施例4:各种DNA酶与靶序列的相互作用的比较
在图2(10 mM MgCl2)中可看出，L-DNA酶不仅能剪切L-靶序列，也可剪切D-靶序列。图3示出对此的MgCl2浓度依赖性。从该图也看出，L-DNA酶剪切D-祀，但D-DNA酶不剪切L-靶。图4再次示出相应于图3的测量，其中还看出在图1a的靶情况下的剪切位点。
[0073]实施例5:各种DNA酶和RNA酶在细胞中的活度
图5中用EGFP质粒转染海拉细胞，即包含D-靶。特别看出，L-DNA酶比L-RNA酶更强地抑制荧光，或也比D-RNA酶或D-DNA酶更强地抑制荧光。这种结果在图6中得到明显证实。由此，与L-RNA酶相比，在细胞中特别证实了 L-DNA酶的占优势的作用。在图7和8中，24小时的温育时间也再次证实了该结果。最后从图9和10中可看出，在48小时的温育时间情况下，与其它酶相比，L-DNA酶也显示出显著更好的抑制作用。
[0074]实施例6:可能的药物应用
除去在用镜像异构体治疗时用作解毒剂外，本发明也可用于通常其它有关方面。原则上，与不希望的基因产物的表达相关联的疾病的所有适应症均属此列。
[0075]实例是心衰或肥大。由文献L.Suckau 等人，Circulation 119:1241-1252(2009)已知，对此抑制受磷蛋白的治疗是适用的。在此文献中对此使用RNAi。根据已知的序列信息，可不困难地将相应的L-DNA酶构建成人受磷蛋白，并且与这方面已知的治疗方法相比，其优点是L-DNA酶活性物质对酶促分解稳定性更好，同时在抑制编码受磷蛋白的靶RNA方面有优良的活性。
[0076]在人类有机体中的另一靶例如是非编码H19 RNA。该基因例如在癌细胞中差异性表达。特别由文献US2010/0086526 A已知，借助于siRNA抑制H19 RNA。以类似的方式可选择本发明的L-DNA酶分子，其剪切H19核酸的已知且合适的位点，以致降低或抑制转录子。其产生上面所阐明的优点。
【权利要求】
1.L-DNA用于制备药物组合物的应用。
2.根据权利要求1的应用，其中该L-NDA可结合在L-RNA或D-RNA上，特别是在反义反应中，并可任选地在该L-RNA或D-RNA的靶序列区裂解该L-RNA或D-RNA。
3.L-DNA在制备用来治疗由于给予含L-RNA或D-RNA的治疗分子而产生的不希望的生理副反应的药物组合物中的应用，该L-NDA可结合在L-RNA或D-RNA上，特别是在反义反应中，并可任选地在该L-RNA或D-RNA的靶序列区裂解该L-RNA或D-RNA，所述L-NDA用于。
4.L-DNA在制备用于治疗和预防随着至少一种内生基因的过表达而出现的疾病的药物组合物中的应用，其中该L-NDA可结合在编码该基因的内生的靶-D-DNA或靶-D-RNA上，特别是在反义反应中，并任选地可裂解编码该基因的内生的靶-D-DNA或靶-D-RNA的靶序列。
5.根据权利要求3的应用，其中所述治疗分子由L-RNA组成，特别是双链L-RNA，例如镜像异构体。
6.根据权利要求3的应用，其中所述治疗分子含与所述L-RNA共价结合的适体或与所述L-RNA共价结合的抗体。
7.根据权利要求3和5-6之一的应用，其中该药物组合物包含的L-DNA剂量至少相应于该L-RNA的给药剂量，优选包含的剂量相应于该L-DNA的给药剂量的2-100倍，优选2-20倍。
8.根据权利要求3-7之一的应用，其中该药物组合物另外包含核酸，特别是5-100-mer，其可在该靶序列区熔合双链的D-RNA或L-RNA.
9. 权利要求9缺失。
10.含L-DNA的药物组合物，其用于治疗由于给予含L-RNA或D-RNA的治疗分子而出现的不希望的生理副反应.
11.含L-DNA的药物组合物，其用于治疗和预防随着至少一种内生基因的过表达而出现的疾病，其中该L-NDA可结合在编码该基因的内生的靶-D-RNA或靶-D-DNA上，特别是用于反义反应，并任选地可裂解编码该基因的内生的靶-D-RNA或靶-D-DNA的靶序列.
12.用于制备根据权利要求10或11的药物组合物的方法，其中制定和合成L-脱氧核糖核苷酸组成的序列，该序列可结合在L-核糖核苷酸的给定序列上或结合在D-核糖核苷酸或D-脱氧核糖核苷酸的给定序列上，并任选地可裂解所述的给定序列，且其中将该如此得到的L-DNA配制成药物有效剂量以用于给药.
13.根据权利要求12的方法，其中该L-DNA与制剂的助剂和/或载体物质相混合。
【文档编号】C12N15/113GK103492571SQ201280011039
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年1月2日 优先权日:2010年12月31日
【发明者】福尔克尔·A·埃德曼 申请人:福尔克尔·A·埃德曼