杀肿瘤和抗微生物组合物和方法

杀肿瘤和抗微生物组合物和方法
【专利摘要】本发明提供包含从NK?92细胞培养基的上清液分离的杀肿瘤的和/或抗微生物的组分的药物组合物，和应用所述组合物杀死癌细胞的方法。
【专利说明】
杀肿瘤和抗微生物组合物和方法
技术领域
[0001] 本发明一般地涉及具有杀肿瘤和/或抗微生物特性的药物组合物，以及使用所述 组合物杀肿瘤和/或微生物的方法。
【背景技术】
[0002] 皮肤癌是人和多种驯养动物中的主要癌症类型。皮肤癌和黑色素瘤的发病率由于 多种因素不断攀升，包括皮肤在缺乏保护的情况下暴露于紫外线，比如在太阳光或日晒床 中的那些紫外线暴露。如果在初期得到诊断，这些癌症可以通过切除癌症及周围组织容易 地治疗。但是，如在任何手术过程中，仍然存在异常的癌细胞可能残留在切除位点而导致癌 症复发的可能性。在黑色素瘤的情况中尤其是如此，并且未能除去全部瘤细胞可能导致伴 随着更高发病率的癌转移。
[0003 ] 现在已经有很多积极的(aggr e s s i ve)方法可以用于最小化复发风险，包括常规的 治疗方案以及主治医生的很多检查方法。尽管有这些方案，黑色素瘤倾向于非常具有侵袭 性，且根据报道，黑色素瘤在五年内有2%到65%的复发可能性，这取决于治疗时癌症的阶 段。参见：例如，www · aimatmelanoma · org/en/aim-for-answers/moving-on-after-treatment/follow-up-by-stage.html.
[0004] 动物也很容易得皮肤癌，尤其是黑色素瘤、鳞状细胞癌和肥大细胞瘤。皮肤癌对于 长时间处于阳光中的动物尤为普遍。
[0005] 感染是全世界面临的一个普遍问题。很多感染是由细菌、真菌和其它微生物所引 起的。虽然现在对于这些感染的治疗方法严重依赖于抗生素和抗微生物药物，但是越来越 多的细菌感染被发现对至少某些抗生素产生了抗药性。根据美国疾病控制中心(CDC)的报 告，美国每年有超过2百万人被具有抗生素抗性的微生物感染，死亡人数超过23,000。参见： 例如，￥￥￥.1116(1；[0&1116￥81：0(1&7.00111/&1'1：；[0168/266182 41^。皮肤和软组织感染是急诊护理 情况中第三最常见的诊断，且估计所有住院患者的7 %到10 %具有皮肤或软组织感染。Ki和 Rotstein,Can. J. Infect.Dis.Med.Microbiol.2008March; 19(2): 173-184。其它常见的感 染包括全身性感染、呼吸道感染、耳部感染、胃肠感染以及尿道感染。感染在驯养动物中同 样常见，而且很难治疗。病毒感染也是常见的，并且可用于治疗病毒感染的方法很少。
[0006] 因此，现在仍然需要可用于裂解癌细胞，尤其与真皮和皮下癌症相关的那些癌细 胞的杀肿瘤组合物。也仍然需要可用于治疗感染的新的抗微生物组合物。

【发明内容】

[0007] 免疫系统的某些细胞对特定靶细胞具有细胞毒性活性。通常占据循环淋巴细胞的 约10-15%的天然杀伤(NK)细胞对于抗原来说非特异性地并在没有之前的免疫致敏的情况 下结合并杀死祀细胞，包括病毒感染的细胞和很多恶性细胞。Herberman等，Science 214: 24(1981)。靶细胞的杀灭可以通过裂解细胞发生。NK细胞被证明在癌症晚期患者的体外疗 法和体内治疗中都是有效的。然而，内源的NK细胞(即，从供体或患者收获的细胞)仍然很难 对免疫疗法有作用并应用到免疫疗法中。NK细胞很难在体外扩增而使得它们保持其体内的 肿瘤靶向、杀肿瘤和杀病毒能力，这也是其在过继性细胞免疫疗法中的临床应用的主要障 碍。Melder等，Cancer Research 48:3461-3469(1988) ;Stephen等，Leuk.Lymphoma 377-399(1992); Rosenberg等，New Engl · J ·Med · 316:889-897(1987)。另外，内源NK细胞的制备 物含有T细胞和/或其它免疫效应细胞，其在NK细胞用来治疗与供体不相关的患者时必须移 除。
[0008] NK-92细胞系是发现在白细胞介素-2(IL-2)存在的情况下增殖独特细胞系。Gong 等，Leukemia 8:652-658(1994)。与NK细胞不同，NK-92细胞是在患有非霍奇金淋巴瘤的受 试者的血液中发现的并然后在体外永生化的细胞溶解性癌细胞系。此细胞系对多种癌症具 有高细胞溶解活性。NK-92细胞系是同源NK细胞群体，因为这与裂解活性相关。一期临床实 验证实其安全性特征，并且在某些癌症晚期患者中观察抗肿瘤反应。
[0009] 内源NK细胞与NK-92细胞显著不同，主要由于它们的不同起源:NK-92细胞是源自 癌症的细胞系，而内源NK细胞从供体(或患者)获得，并经过处理以注入到患者体内。内源NK 细胞制备物是异质细胞群体，而NK-92细胞是同质的克隆细胞系，因为它们均表现出裂解活 性。NK-92细胞很容易在培养中增殖而同时保持细胞毒性，而内源NK细胞不能。
[0010] 细胞(包括NK细胞）向它们于其中生长的培养基中释放多种成分。这样的成分的实 例有蛋白质、外来体和微囊泡。外来体是由正常细胞和肿瘤细胞释放的纳米囊泡(最高100 纳米）。微囊泡与外来体相似，但是尺寸更大(大于100纳米）。外来体和微囊泡可以从细胞培 养上清液或从体液(比如血液)中检测和分离。
[0011] 从内源NK细胞的细胞培养上清液分离的外来体含有蛋白质，包括CD56、穿孔蛋白、 FasL和RabSBlugini等· J Immunol · (2012) 189，2833-2842。然而，外来体和源自内源NK细 胞的其它因子对于回收的外来体的量和其中包含的蛋白质是高度可变的。同上，2839页。非 局限于理论，据信这种变异性是因为内源NK细胞从个体供体获得，且还因为内源NK细胞包 含异质细胞群体。另外，条件的差异(如细胞培养条件、纯化方法、起始细胞群体和培养中细 胞类型的比率)都可导致可从内源NK细胞纯化的外来体的组成和量的变化。例如，NK细胞制 备物中的某些细胞群体可以考虑所使用的纯化方法和/或培养条件进行选择或针对所使用 的纯化方法和/或培养条件进行选择。
[0012] 与内源NK细胞相关的变异性的问题不适用于NK-92细胞系。因为其是细胞系，大量 细胞可以进行培养并且长期扩增。这些培养物是提供一致的，可重现的外来体和/或微囊泡 制备物的同源细胞群体。NK-92细胞分泌的外来体和/或微囊泡包含设想具有杀肿瘤特性的 蛋白质，比如具有细胞毒性和/或细胞裂解性。从含NK-92细胞的培养基可以分离其它成分， 包括具有抗微生物特性和免疫调节特性的成分等。
[0013] 另一方面，NK-92细胞是癌细胞系。一些癌细胞已被证明释放包含在某些情况下促 进肿瘤生长的因子(例如微RNA)的外来体。很多癌细胞释放的外来体和其它因子与其非恶 性对应物释放的那些明显不同。例如NK-92细胞释放具有抗微生物特性的因子，这个特征在 内源NK细胞中没有观察到。在一个实施方式中，从NK-92细胞获得的外来体和/或微囊泡在 使用前在适当的溶液（比如PBS或等渗盐水）中孵育以提取这些因子。这个孵育期被设想极 大地减少或消除促进肿瘤生长的那些因子。
[0014] 本发明的一个方面提供了药物组合物，其包含从NK-92细胞培养基的上清液获得 的一种或多种组分。所述组分可能是杀肿瘤和/或抗微生物的。所述组分也可具有免疫调节 特性。这些组分优选地是从上清液分离的外来体和/或微囊泡。在一个实施方式中，所述外 来体和/或微囊泡是细胞毒性的。在一个实施方式中，所述外来体和/或微囊泡具有裂解癌 细胞的能力。在一个实施方式中，所述外来体和/或微囊泡是抗微生物的。在一个实施方式 中，所述外来体和/或微囊泡是抗病毒的。在一个实施方式中，所述外来体和/或微囊泡是抗 细菌的。在一个实施方式中，所述外来体和/或微囊泡是免疫调节性的。
[0015] 在一个优选实施方式中，所述药物组合物不含活细胞。在一些实施方式中，所述药 物组合物是可注射组合物。在一些实施方式中，设想注射提供全身性免疫调节活性。
[0016] 在培养中观察到NK-92细胞的亚群，并且其可以分离。亚群在细胞表面标志物的表 达、蛋白表达等方面可能不同。在本发明的一个方面，在从NK-92细胞培养基的上清液获得 一种或多种成分之前，一个或多个NK-92细胞的亚群被分离。限定的一个或多个亚群的分离 允许一致限定的外来体和/或微囊泡，特别是表现出较低杀肿瘤特性或没有杀肿瘤特性的 外来体和/或微囊泡。
[0017] 在一些实施方式中，本文提供的药物组合物在外科手术后施用到身体的一部分， 从而杀死残留的癌细胞和/或降低癌症复发的可能性。在一些实施方式中，所述药物组合物 配置用于局部使用。在一些实施方式中，所述药物组合物配置为真皮下应用。在一些实施方 式中，所述药物组合物包含相变的泊洛沙姆。
[0018] 在一些实施方式中，所述药物组合物是包含相变聚合物的可注射形式，使得所述 组合物作为液体注射且在体内（比如在体温下)相变成凝胶，从而提供药物贮库。
[0019] 本发明的另一个方面提供了一种药物组合物，其包含从NK-92细胞培养基的上清 液获得的抗微生物(包括抗细菌、抗真菌和/或抗病毒)组分。在一些实施方式中，所述抗微 生物组分包括杀肿瘤组分。在一些实施方式中，所述抗微生物组分是从上清液分离的外来 体和/或微囊泡。在一个优选实施方式中，所述抗微生物组分包含从上清液分离的微囊泡。
[0020] 本发明的另一个方面提供了裂解癌细胞的方法，其包括向需要的人或动物患者施 用从NK-92细胞的生长培养基的上清液分离的抗肿瘤或细胞毒性成分给。在一个实施方式 中，所述成分被注射到肿瘤(比如实体瘤）中。在一个实施方式中，所述成分被注射到肿瘤周 围或附近的区域中。在一个实施方式中，所述成分被局部施用到肿瘤(比如皮肤癌）。在一个 实施方式中，所述成分被全身性施用。
[0021] 在一些实施方式中，癌症是癌瘤、淋巴瘤、肉瘤、黑色素瘤、星形细胞瘤、间皮瘤细 胞、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、肺癌、泌尿系统癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、白血 病、肺癌、结肠癌、中枢神经系统癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌或前列腺癌。在一个优选实施方式 中，癌症是皮肤癌。
[0022] 本发明的这些和其它方面在下面详细陈述。
【附图说明】
[0023] 图1显示了NK-92细胞对新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)生长的影响 [0024]图2显示与图1中相同的数据，表示为用新型隐球菌生长的百分比。
[0025]图3A是分析在多种培养条件下从NK-92细胞分离的外来体和/或微囊泡(EV/MV)中 含有的蛋白成分(第4-7道）的蛋白质印迹的照片。NK-92细胞(第3道)是阳性对照，MCF-7细 胞(第1道)和外来体(EV，第2道)是微管蛋白和/或Rab5B的阳性对照，以及细胞溶解蛋白的 阴性对照。
[0026]图3B是分析NK-92细胞中核膜(核孔蛋白）、线粒体(抗增殖蛋白）、外来体(Rab5B) 以及外来体/微囊泡制备物的标志物存在的蛋白质印迹照片。
[0027]图4显示在碘化丙啶实验中NK-92外来体/微囊泡制备物对Jurkat细胞的细胞裂解 活性。
【具体实施方式】
[0028] 定义
[0029] 在公开和描述本发明的物品和方法之前，应理解下述方面不限于特定的组合物、 制备方法或用途本身，而是当然可变化的。还应理解这里用到的术语只是为了描述特定方 面的目的，而不意图是限制性的。
[0030] 在本说明书和以下的权利要求中，提及了应定义为具有以下含义的很多术语：
[0031] 必须注意，在本说明书和所附权利要求中使用的单数形式的"一"、"一个"和"该" 包含了复数的指示物，除非上下文明确规定另外的情况。因此举例来说，"一细胞因子"包括 两种或更多种细胞因子的混合物，等等。
[0032] "任选的"或"任选地"意味着随后描述的事件或情况可能会或不会发生，且该描述 包括其中事件或情况发生的情况以及没有发生的情况。
[0033] 术语"包含"意指组合物和方法包括了所表述的元素，但是不排除其它元素。当用 于限定组合物和方法的时候，"基本上由....组成"应意味着排除对组合物具有任何重要意 义的其它元素。例如，基质上由本文中定义的元素组成的组合物不排除那些对所述发明的 基本和新型特征产生实质影响的其它元素。"由.....组成"应意味着排除超过痕量的其它 成分以及所述的实质性方法步骤。由这些过渡语的每一个定义的实施方式都在本发明的范 围内。
[0034] 本文用到的"患者"是任何脊椎生物，包括而不限于哺乳动物患者，像人类、农畜、 驯养宠物等等。在优选实施方式中，患者是人。
[0035]本文在数值前用到时，术语"约"指的是该值可以在合理的范围内变化，比如± 5%，±1% 和 ±0.2%。
[0036]本文用到的术语"内源NK细胞"指的是从供体(或患者)获得的NK细胞，与NK-92细 胞系不同。NK细胞是在没有特定抗原性刺激的情况下杀死靶细胞且没有MHC类别的限制的 免疫系统细胞。内源NK细胞一般是其中NK细胞经过富集的异质细胞群体。内源NK细胞可以 意图用于患者的自体治疗或同种异体治疗。
[0037] 术语"NK-92细胞"包括野生型NK-92细胞和修饰的NK-92细胞。NK-92细胞被发现对 肿瘤和感染细胞类型的细胞毒性比NK细胞更高。
[0038]术语"野生型NK-92细胞"指的是最初获自患非霍奇金淋巴瘤的患者并然后在体外 永生化NK细胞系，NK-92JK-92细胞可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，保藏号为 CRL-2407,并且描述于例如美国专利7,618,817中，其整体通过引用结合到本文中。
[0039]术语"修饰的NK-92细胞"指的是进一步处理而赋予其所来源的野生型NK-92细胞 不具备的特性的NK-92细胞。这样的处理包括例如物理处理、化学处理和/或生物处理等。所 述处理对修饰的NK-92细胞赋予使得其对于所需目的更有利的特性。修饰的NK-92细胞的实 例描述于例如美国专利7,618,817、8,034,332和8,313,943中，其都作为整体通过引用结合 到本文中。
[0040] 术语"胞外囊泡"涵盖外来体和微囊泡两者，以及由细胞（比如NK-92细胞)分泌到 培养基中的任何其它囊泡。一般来说，外来体是直径小于约100纳米（nm)的纳米体 (nanosome)，微囊泡的直径为大约100纳米或更大。
[0041] 如用于描述本发明的，"癌症"、"肿瘤"和"恶性肿瘤"都同样指的是组织或器官的 增生。如果该组织是淋巴或免疫系统的一部分，则恶性细胞可以包括循环细胞的非实体肿 瘤。其他组织或器官的恶性可产生实体肿瘤。一般来说，本发明的方法可以用于治疗淋巴细 胞、循环的免疫细胞以及实体肿瘤。
[0042] 术语"杀肿瘤成分"指的是治疗癌性肿瘤和/或癌细胞的成分。肿瘤的治疗包括减 少或消除肿瘤、杀死癌细胞和/或抑制癌细胞的生长、增殖和/或转移。优选地，肿瘤细胞被 杀死，比如通过细胞裂解。
[0043] 术语"抗微生物成分"指的是治疗或预防微生物感染的成分。微生物包括细菌、真 菌、霉菌、病毒等。相应地，抗微生物成分也指抗病毒成分、抗细菌成分、抗真菌成分等等。
[0044] 如用于描述本发明，术语"细胞毒性的"和"细胞裂解的"在用于描述NK细胞等效应 细胞的活性时，具有相同的意思。一般来说，细胞毒性活性与通过多种生物学、生物化学和 生物物理学机制杀死靶细胞相关。细胞裂解更特别地指其中效应物裂解靶细胞的细胞质 膜，因而破坏其物理完整性的活性。这导致靶细胞的杀灭。不希望受限于理论，据信NK细胞 的细胞毒性效应是由于细胞裂解造成的。
[0045] 本文用到的术语"生长培养基"或"培养基"具有同样的意思。一般地，该术语指的 是NK-92细胞可以在其中生长或放置于其中，且NK-92细胞向其中释放外来体、微囊泡和/或 其它活性成分的任何培养基或水性溶液。培养基可以包括生长培养基（比如可商业获得的 培养基)像X-VI VO 10或RPMI。或者，培养基也可以包含PBS或其它的水性溶液。
[0046] 本文用到的"治疗"、"处理"和"医治"定义为用药剂作用于疾病、失调或状况，从而 减少或改善这种疾病、失调或状况的有害或其它不利影响或症状。本文用到的"治疗"涵盖 对患者的治疗，并包括：（a)减少一个被确定为易感该状况但是还没有诊断为具有此状况的 患者出现该状况的风险；（b)阻止状况的发生和/或（c)减轻该状况，比如致使状况的消退 和/或缓解状况的一种或多种症状。"治疗"状况或患者或者状况或患者的"治疗"指的是采 取措施去获得有益的或期望的结果，包括临床结果如症状的减轻。就本发明的目的而言，有 益的或期望的结果包括，但不限于:减小肿瘤的体积或降低肿瘤的转移潜能；杀死肿瘤细 胞;或降低被感染原(微生物)感染的严重程度，比如通过减轻一种或多种症状，缩短感染时 长等。
[0047]从NK-92细胞培养基上清液分离的成分
[0048] NK-92细胞可以在培养基中扩增、修饰以及/或维持。任何可接受的培养条件都可 以采用。在一个实施方式中，NK-92细胞被培养在补充了胚牛血清（比如，12.5%;Sigma Chemical Co·, St.Louis，Mo.)和/或马血清（比如，12.5%;Sigma Chemical Co.， St · Louis，Mo ·)的富集的α最低基本培养基(MEM; Sigma Chemical Co ·，St · Louis，Mo ·)中。 在另一个实施方式中，NK-92细胞被培养在补充人血清、人血浆或人血清白蛋白（比如，5 % ) 的XVivo 10培养基中。在一个优选实施方式中，血清、血浆或血清白蛋白在NK-92细胞的培 养之前已经耗竭了外来体。
[0049] 培养基任选地补充其它的营养物质、细胞因子和/或生长因子，比如白细胞介素-2 (IL-2)、L-天门冬酰胺、L-谷氨酰胺和/或L-丝氨酸。NK-92细胞在培养基中时可释放如蛋白 质（比如，细胞因子）、微囊泡和/或外来体的成分到培养基中。当细胞从培养基中分离后，比 如，通过离心分离，从细胞释放的成分保留在上清液中。
[0050] 另一种采用的合适培养基包括X-VIV0 10培养基，5%人血清ΑΒ，36μΜ L-天门冬酰 胺，450yML-谷氨酰胺，324μΜ L-丝氨酸和500IU的IL-2。
[0051 ]在一些实施方式中，培养基是无血清培养基、PBS或其它水性溶液，比如Ringer溶 液、葡萄糖溶液、Kank溶液或其它水性生理平衡盐溶液。不局限于理论，生长培养基的某些 组分(比如血清)可含有外来体、微囊泡和/或其它与NK-92细胞无关的成分。因此，在从培养 基分离外来体、微囊泡或其它成分之前将NK-92细胞在无血清培养基或其它水性溶液中维 持一段时间可能是有益的。或者，NK-92细胞可以在耗竭外来体的或无外来体的血清或血清 替代品中培养。
[0052]在一些实施方式中，向培养基中加入一种或多种刺激剂。不局限于理论，据信这类 刺激剂对NK-92细胞的刺激可导致更加一致、稳定和/或可重现的成分释放，包括外来体和/ 或微囊泡。刺激剂包括例如细胞因子或药物刺激剂。在一个实施方式中，刺激剂是IL-15。在 一个实施方式中，刺激剂是干扰素 γ。
[0053]在一些实施方式中，一种或多种杀肿瘤和/或抗微生物组分包含从上清液分离的 外来体。在一些实施方式中，一种或多种杀肿瘤和/或抗微生物组分包含从上清液分离的微 囊泡。在一些实施方式中，一种或多种杀肿瘤和/或抗微生物组分包含从上清液分离的外来 体和微囊泡。
[0054]外来体是细胞分泌的纳米囊泡，直径高达约100纳米。在一些实施方式中，外来体 的直径为约30-100纳米。微囊泡是非细胞的，且直径大于约100纳米和优选小于约1.5微米。 [0055]外来体和/或微囊泡可以通过多种方法从培养基分离出来。一种方法是超速离心。 其他方法包括可商购的外来体分离试剂盒（比如总外来体分离试剂盒(Total Exosomes Isolation kit) [Life Technologies]，Exo-spin?外来体纯化试剂盒（Exo-spin? Exosome Purification Kit)[Cell Guidance Systems]，或PureEx.O?::外来体分离试剂 盒（PnfeEx〇?Ex〇some isolation Kit)[ioiBi0]);可商购的仪器，比如Dynabeads_? 人CD 63-特异性纯化系统或Dynabeads?链霉亲和素纯化系统（可以从Life Technologies公司获取）；过滤;或差速离心方法（比如S.Rani等，Methods Mol Biol. ,784: 181-95(2011)中描述的方法）。外来体和/或微囊泡的存在、大小和纯度等可以通过如蛋白 质印迹、透射电子显微镜技术、流式细胞术、原子力显微术、纳米粒子跟踪分析、显微拉曼光 谱术、电阻脉冲探测和透射电子显微术的方法鉴定。
[0056] 在一些实施方式中，NK-92细胞包含野生型NK-92细胞。
[0057] 在一些实施方式中，NK-92细胞包含修饰的NK-92细胞。NK-92细胞可以通过本领域 中已知的方法进行修饰，比如美国专利7，618，817中描述的那些方法，其作为整体通过引用 结合到本文中。比如，NK-92细胞可以进行修饰以在细胞表面上表达Fc受体。所述Fc受体可 以是活化的Fc γ 受体、CD16(Fc γ RIII-A)、FC γ RI(CD64)、FC γ RII(CD32)、FC γ RIII、FcRn、 Fca和Fee等。Fc受体对于其配体或配体片段具有任何结合亲和力，包括低-和高-亲和力形 式。NK-92细胞可进一步修饰以表达一种或多种相关的辅助信号传导多肽，比如FceRI-γ或 TCR-ζ、细胞因子或它们的片段。
[0058] 在一些实施方式中，NK-92细胞包含经修饰以表达Fc受体的NK-92细胞。在一些实 施方式中，NK-92细胞包含经修饰以表达Fc γ RIII-A、FC γ RI、FC γ RII、FC γ RIII、FcRn、Fca 或Fc ε或者它们组合的ΝΚ-92细胞。在一些实施方式中，ΝΚ-92细胞包含经修饰以表达一种或 多种嵌合抗原受体的NK-92细胞。在一些实施方式中，NK-92细胞包含可得自美国典型培养 物保藏中心的修饰NK-92细胞，保藏号PTA-8836、PTA-6967、PTA-8837或PTA-6672或者它们 的组合。在一些实施方式中，疆-92细胞包含疆-92-〇)16、疆-92-〇)16-丫或疆-92-〇)16气或 者它们的组合。
[0059] 在一些实施方式中，NK-92细胞包含经修饰以表达细胞因子的NK-92细胞。在一些 实施方式中，NK-92细胞包含经修饰以表达促进细胞生长的细胞因子和/或细胞因子受体的 NK-92细胞。在一些实施方式中，NK-92细胞包含经修饰以表达IL-2和/或IL-2受体的NK-92 细胞。在一些实施方式中，NK-92细胞包含经修饰以表达IL-15、IL-18或IL-21或者它们的受 体的NK-92细胞。在一些实施方式中，NK-92细胞包含可得自美国典型培养物保藏中心的修 饰的NK-92细胞，保藏号CRL-2408或CRL-2409或者它们的组合。在一些实施方式中，NK-92细 胞包含NK-92MI、NK-92CI或它们的组合。
[0060]不局限于理论，据信来自修饰的NK-92细胞的外来体和/或微囊泡与来自野生型 NK-92细胞的那些不同。比如，基于细胞的修饰，来自修饰的NK-92细胞的外来体和/或微囊 泡可含有不同的受体和/或其它蛋白质（例如，细胞裂解酶）。来自修饰的NK-92细胞的外来 体和/或微囊泡也可包含不同量或相对量的一些受体和/或其它蛋白质。
[0061 ] 药物组合物
[0062] 在一个方面，提供了一种可用于杀死温血动物中的癌细胞的药物组合物，此组合 物包含药学上可接受的载体和一种或多种从NK-92细胞生长培养基的上清液分离的成分。
[0063] 在一些实施方式中，所述药物组合物在室温下是液体，且在应用到患者后是凝胶。 在一些实施方式中，所述药学上可接受的载体包含泊洛沙姆。
[0064]在另一个方面，提供了一种包含从NK-92细胞生长培养基的上清液中分离的外来 体和/或微囊泡以及无菌水性载体的药物组合物。
[0065] 在另一个方面，提供了包含第一药物组合物和第二药物组合物的试剂盒，该第一 药物组合物包含药学上可接受的载体和从NK-92细胞生长培养基的上清液中分离的外来体 和/或微囊泡;且第二药物组合物包含凝胶，其中第一药物组合物和第二药物组合物是局部 制剂。在一些实施方式中，第二药物组合物包含泊洛沙姆。在一些实施方式中，第二药物组 合物包含从NK-92细胞生长培养基的上清液中分离的外来体和/或微囊泡。在优选实施方式 中，第一和/或第二药物组合物包含微囊泡。
[0066] 在一些实施方式中，第一药物组合物包含液体和第二药物组合物包含凝胶、泊洛 沙姆或一种在室温下为液体和在体温下为凝胶的组合物。首先将液体应用到治疗区域，然 后将凝胶应用到液体上。不局限于理论，据信液体制剂对治疗区域提供快速的治疗，而凝胶 将液体维持所应用的位点。在一些实施方式中，凝胶包含从NK-92细胞生长培养基的上清液 中分离的外来体和/或微囊泡和无菌水性载体。不局限于理论，据信凝胶对治疗区域提供外 来体和/或微囊泡的较缓慢释放，从而为患病区域提供持续的释放和治疗。
[0067] 在一些实施方式中，所述药物组合物进一步包含一种或多种细胞因子。
[0068] 所述杀肿瘤和/或抗微生物成分可与细胞因子（比如IFN-γ、TGF-f3、IL-4、IL-10、 IL-13、IL-2等)联合使用，从而维持包含杀肿瘤和/或抗微生物成分的组合物的功能效率。 术语"联合"意味着细胞因子可在应用包含此成分的组合物之前短时间内施用，或它可与包 含此成分的组合物同时给予，或在包含杀肿瘤成分的组合物施用之后短时间内给予。此细 胞因子也可在相对于包含杀肿瘤成分的组合物的施用时间的两个这样的时间施用或在所 有三个这样的时间施用。在一些实施方式中，细胞因子和成分在单一组合物中施用。
[0069] 在一些实施方式中，一种或多种细胞因子至少包括白细胞介素-2。
[0070] 所述药物组合物可为适用于口服、局部、透皮、直肠、吸入剂或肠胃外（静脉内、肌 肉内或腹膜内）施用等的多种制剂。所述药物组合物也可以在适合注射到肿瘤内或者肿瘤 部位处或周围的制剂中。在一个实施方式中，所述药物组合物在移除所有或大部分肿瘤的 手术后被注射或应用到肿瘤部位。
[0071] 本文用到的"药学上可接受的载体"或"药学上可接受的赋形剂"包括任何或所有 溶剂、扩散剂或介质、涂层、抗微生物制剂、等渗/低渗/高渗试剂、吸收改性剂等，其适合医 药用途且与杀肿瘤和/或抗微生物成分相容。另外，其它或补充的活性成分也可以并入到最 终的组合物中。
[0072] 本文所述药物组合物根据需要局部治疗还是全身治疗以及待治疗的区域以多种 方式施用。在一个方面，可通过注射施用，其中所述组合物被配制成液体或凝胶。在其它方 面，所述组合物可被配制为对患者内部应用。在其它方面，所述组合物可局部应用，包括眼 部、阴道、直肠、鼻内、口服或直接应用于皮肤。比如，包含外来体和/或微囊泡的外用组合物 可以应用到任何可触及的肿瘤或感染，比如皮肤肿瘤或其它肿瘤(例如，卡波西肉瘤）；病毒 感染(例如，疣、生殖器疣和疱疹）；或细菌感染。
[0073] 在一些实施方式中，所述药物组合物是可注射制剂。
[0074] 所述药物组合物可以肠胃外施用，比如静脉内、肌肉内、皮下或腹膜内。所述组合 物可全身或局部注射到癌症部位或其附近。可以施用单一的静脉内或腹膜内剂量。或者，缓 慢的长时间输注或多次的短时间每日输注可以应用，一般持续1-8天。也可以使用每隔几天 一次的交替天和给药。
[0075] 无菌可注射组合物通过将杀肿瘤和/或抗微生物成分以合适量并入到适合的载体 中来制备。适合的载体包括水性载体，如水和水性缓冲液(如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、柠檬酸 盐缓冲液等）；水溶性有机溶剂(如聚乙二醇300、聚乙二醇400、乙醇、丙二醇、甘油、N-甲基-2_吡咯烷酮、二甲基乙酰胺和二甲亚砜）；有机液体/半固体(蜂蜡、生育酚、油酸、中链单甘 油酯或二甘油酯）；非离子型表面活性剂(聚乙氧基化蓖麻油（如Cremophor EL、Cremophor RH 40、Cremophor RH 60)、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、生育 酚聚乙二醇1000琥珀酸酯、聚乙二醇（15)-羟基硬脂酸酯、山梨醇酐单油酸酯、油酰基聚乙 二醇-6甘油酯、亚油酰基聚乙二醇-6甘油酯、辛酰己酰基聚乙二醇-8甘油酯、Gdliicire? 44/14、S〇ftigen?767和PEG 300、400或1750的单脂肪酸酯或二脂肪酸酯等）；脂质（如蓖 麻油、玉米油、棉花籽油、橄榄油、花生油、薄荷油、红花油、芝麻油、大豆油、氢化植物油、氢 化大豆油及椰子油和棕榈籽油的中链三甘油酯）；环糊精(如α-环糊精、β-环糊精、γ -环糊 精、羟丙基-β-环糊精和磺丁基醚-β-环糊精)和磷脂(如卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰丝氨酸、二 硬脂酰磷脂酰甘油、1-二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、1-二肉豆蔻酰磷脂酰甘油等)或它们的混合 物。在一些实施方式中，水性载体包含透明质酸、盐水、Ringer溶液、葡萄糖溶液、Hank溶液 以及其它水性生理平衡盐溶液。在一些实施方式中，非水性载体包括非挥发油、植物油(像 橄榄油和芝麻油）、甘油三酯、丙二醇、聚乙二醇或可注射的有机酯如油酸乙酯。在一些实施 方式中，所述药学上可接受的载体进一步包含粘度增强剂，像羧甲基纤维素或其盐、山梨醇 或葡聚糖;增强等渗性和化学稳定性的物质，像磷酸盐缓冲剂、碳酸氢盐缓冲剂和Tris缓冲 剂;防腐剂，像硫柳汞、甲酚类、福尔马林和苯甲醛。
[0076] 可注射组合物可以是溶液或悬浮液，但应当能够容易地通过注射装置比如空心 针。可以通过适当地选择溶剂或赋形剂达到并维持适合的粘度。在一些实施方式中，药学上 可接受的载体包含粘度增强剂。在一些实施方式中，所述组合物的粘度在25°C下为约5厘泊 (cP)_ 约 lx 106cP、或约 5cP-约 lx 105cP、或约 5cP-约 lx 104cP、或约 5cP-约 lx 103cP、或约 6cP_约100cP〇
[0077] 在一些实施方式中，所述药物组合物为可注射的延释制剂。延释制剂中的杀肿瘤 和/或抗微生物成分可以在延长的时间段内从组合物释放到身体中，如至少几分钟、至少一 个小时、至少几个小时，至少一天、至少几天或数周等，以提供长期和/或持续的治疗效果。
[0078] 在一些实施方式中，所述药物组合物包含定位剂，其允许在递送到肿瘤部位或接 近肿瘤部位时局部保持组合物，任选地延长和/或持续地释放组合物中的杀肿瘤和/或抗微 生物成分。这类试剂包括触变剂、相变剂如水凝胶、可生物消蚀的生物相容的聚合物和胶原 凝胶等。这些组合物在环境条件下为可注射的或液体形式，并且在应用后形成粘稠的或凝 胶样的可生物消蚀或生物相容的团块，其限制杀肿瘤和/或抗微生物成分从递送位点转运 离开并允许杀肿瘤和/或抗微生物成分从组合物扩散。
[0079] 组合物中可用的水凝胶可以是化学和/或物理交联的水凝胶。原位化学交联可以 例如通过光引发的、氧化还原引发的或Michael型加成聚合反应获得，其优选涉及共价键的 形成。物理交联的水凝胶在外部刺激下自组装，且不依赖于共价键的形成。温度、pH值、离子 浓度和疏水相互作用是可用于这种水凝胶自组装和用于固定这种水凝胶的某些外部刺激。
[0080] 适用于组合物中的示例性聚合物包括聚丙交酯、聚乙交酯、聚（己内酯）、聚酸酐、 聚胺、聚酰胺酯、聚正酯、聚二噁烷酮、聚缩醛、聚缩酮、聚碳酸酯、聚磷酸酯、聚原碳酸酯、聚 磷腈、琥珀酸酯、聚(羟基丁二酸）、聚(氨基酸）、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚羟基纤维素、 聚磷酸酯、多糖、几丁质、壳聚糖、透明质酸和共聚物，像泊洛沙姆、三元共聚物及它们的混 合物。
[0081] 在一些实施方式中，定位剂是泊洛沙姆。泊洛沙姆非离子型的三嵌段共聚物，由中 心的聚氧丙烯(如聚环氧丙烷)疏水链和侧翼的两条亲水的聚氧乙烯（如聚环氧乙烷)链组 成。在专一个方面，泊洛沙姆具有式：
[0082] HO (C2H4O) b (CsHeO) a (C2H4O) bOH
[0083] 其中 a为 10-100、20-80、25-70、25-70或50-70;13为5-250、10-225、20-200、50-200、 100-200或150-200。在另一个方面，泊洛沙姆的分子量为2，000-15，000、3，000-14，000或4， 000-12，000。本发明中可用的泊洛沙姆以商品名PI ufOn ie_K)销售，由BASF制造。本发明中可 用的泊洛沙姆的非限制性实例包括，但不限于？]1江〇1^、68、？103、？105、？123 4127和 L121。在适合的浓度下，比如10%-30%w/w的泊洛沙姆，泊洛沙姆溶液在室温下为液体和在 身体中形成凝胶。
[0084]合适的胶原包括例如从各种不同动物提取的不溶性胶原的碱处理，或通过用酶进 行处理，比如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶或链霉蛋白酶。胶原可以从鸟 或哺乳动物的皮肤、骨、软骨、肌腱或器官等获得。胶原在加工(curing)后可以是柔性的，且 只需要短时间来进行交联，换言之，只需要短时间来凝胶化。胶原溶液也可以通过将胶原溶 解在无毒溶剂中制备，无毒溶剂的实例包括水、生理盐水和缓冲液，如硼酸盐缓冲液，或含 盐(如氯化钠、溴化钠、溴化钾)或者蛋白质、糖或脂质等的水性溶液。
[0085]胶原也可以甚至在湿汽存在下形成凝胶，比如在血液中或在肿瘤中，且可以对于 活体组织展现出高度的粘性。本发明中用到的胶原溶液可以制成各种浓度，中和并制备用 于注射。在各种不同的实施方式中，组合物中的胶原浓度可以为0.2mg/mL、0.5mg/mL、 0·75mg/mL、lmg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、1Omg/mL、 20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL和50mg/mL，或这些数值的两个之间的任何范围。在注射入器官 中时，冷冻的胶原凝胶可以在达到体温或约37°C时热胶化(thermogel)。
[0086]在一些实施方式中，药物组合物提供组合物的延长的、持续的和/或连续的杀肿瘤 和/或抗微生物成分释放。
[0087] 组合物的杀菌可以通过已知方法完成，比如过滤。
[0088] 最终形式在制造和储存的条件下应当是稳定的。另外，最终药物形式应当保护而 免于污染，且因此应当能够抑制微生物(比如细菌或真菌)的生长。
[0089] 预防或抑制微生物的生长可以通过添加一种或多种抗微生物剂（比如氯丁醇、抗 坏血酸、对羟基苯甲酸酯、硫柳汞等)来实现。也可以优选地包括改变渗透压的试剂，比如糖 和盐。
[0090] 药物组合物也可以制备成无菌粉末。含有杀肿瘤和/或抗微生物成分的无菌粉末 可以通过包括液体组合物（比如包含水性载体的组合物）的真空干燥或冷冻干燥的方法制 备，。无菌粉末可以用适量的水性载体如PBS来重构，以提供用于施用于患者的可注射组合 物。
[0091] 在一些实施方式中，组合物被配制成直接应用于皮肤来治疗皮肤癌的局部组合 物。在一些实施方式中，组合物被配制成直接应用于其它可触及的癌症比如宫颈癌或口腔 癌的局部组合物。在一些实施方式中，局部组合物应用于病毒感染的细胞，比如疣。在一些 实施方式中，疣是生殖器(性传染的）疣。在一些实施方式中，疣是寻常疣、扁平疣、丝状/指 状疣、镶工疣、甲围(periungal)疣或跖疣。
[0092] 用于局部施用的制剂可以包括乳剂、霜剂、水性溶液、油剂、膏剂、糊剂、凝胶、洗 液、乳液、泡沫、悬浮液和粉末。在一些实施方式中，药物组合物为霜剂或洗液。在一个方面， 局部组合物可以包括一种或多种表面活性剂和/或乳化剂。在一个实施方式中，乳化剂不改 变外来体和/或微囊泡的结构。在一个实施方式中，乳化剂改变外来体和/或微囊泡的结构。 比如，乳化剂可以破坏外来体和/或微囊泡结构，从而释放外来体和/或微囊泡中的活性因 子。
[0093] 可能存在的表面活性剂(或表面活性物质)是阴离子型、非离子型、阳离子型和/或 两性型表面活性剂。阴离子型表面活性剂的典型例子包括，但不限于皂类、烷基苯磺酸盐、 链烷磺酸盐、烯属磺酸盐、烷基醚磺酸盐、甘油醚磺酸盐、甲基酯磺酸盐、磺基脂肪酸、烷 基硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、甘油醚硫酸盐、脂肪酸醚硫酸盐、羟基混合醚硫酸盐、单甘油酯 (醚)硫酸盐、脂肪酸酰胺(醚)硫酸盐、单和二烷基磺基琥珀酸盐、单和二烷基磺基琥珀酰胺 酸盐、磺基三甘油酯、酰胺皂类、醚羧酸及其盐、脂肪酸羟乙基磺酸盐、脂肪酸肌氨酸盐、月旨 肪酸牛磺酸酯(tauride)、Ν_酰基氨基酸（比如酰基乳酸酯）、酰基酒石酸盐、麸谷氨酸、酰基 天冬氨酸、烷基寡葡糖苷硫酸盐、蛋白质脂肪酸缩合物（尤其是小麦基植物产品）和烷基 (醚)磷酸盐。非离子型表面活性剂的例子包括，但不限于脂肪醇聚二醇醚、烷基酚聚二醇 醚、脂肪酸聚二醇酯、脂肪酸酰胺聚二醇醚、脂肪胺聚二醇醚、烷氧基化三甘油酯、混合醚或 混合甲缩醛类、任选部分氧化的烷(烯)基寡糖苷或葡萄糖醛酸衍生物、脂肪酸Ν-烷基葡糖 酰胺、蛋白水解物(特别是小麦基植物产品）、多元醇脂肪酸酯、糖酯、山梨醇酐酯、聚山梨醇 酯和胺氧化物。两性型或两性离子型表面活性剂的例子包括，但不限于烷基甜菜碱、烷基酰 氨甜菜碱、氨基丙酸盐、氨基甘氨酸盐、咪唑啉甜菜碱和磺基甜菜碱。
[0094] 在一些实施方式中，表面活性剂可以是脂肪醇聚二醇醚硫酸盐、单甘油酯硫酸盐、 单-和/或二烷基磺基琥珀酸盐、脂肪酸羟乙基磺酸盐、脂肪酸肌氨酸盐、脂肪酸牛磺酸酯、 脂肪酸谷氨酸盐、α-烯烃磺酸盐、醚羧酸、烷基寡糖苷、脂肪酸葡糖酰胺、烷基酰氨甜菜碱、 两性缩醛和/或蛋白质脂肪酸缩合物。
[0095] 两性离子型表面活性剂的例子包括甜菜碱类，比如Ν-烷基-Ν，Ν_二甲基甘氨酸铵 如椰油烷基二甲基甘氨酸铵、Ν-酰氨基丙基-Ν，Ν_二甲基甘氨酸铵如椰油酰氨基丙基-Ν，Ν-二甲基甘氨酸铵和2-烷基-3-羧甲基-3-羟乙基咪唑啉(每种情况中烷基或酰基有8-18个碳 原子），以及椰油酰氨基乙基羟乙基-羧甲基甘氨酸酯。
[0096] 在一些实施方式中，乳化剂可以是选自以下的非离子化的表面活性剂:将2-30摩 尔的环氧乙烷和/或0-5摩尔的环氧丙烷添加到含8-22个碳原子的线性脂肪醇上，添加到含 有12-22个碳原子的脂肪酸上，添加到烷基中含有8-15个碳原子的烷基酚上，或添加到烷基 中含有8-22个碳原子的烷基胺上的加成产物;在烷(烯)基中含有8-22个碳原子的烷基和/ 或烯基寡糖苷及其乙氧基化类似物;将1-15摩尔的环氧乙烷添加到蓖麻油和/或氢化蓖麻 油上的加成产物;将15-60摩尔的环氧乙烷添加到蓖麻油和/或氢化蓖麻油上的加成产物； 甘油和/或山梨糖醇酐与不饱和的线性或饱和的分支脂肪酸(含有12-22个碳原子)和/或羟 基烃酸(含有3-18个碳原子)的部分酯，及其与1-30摩尔环氧乙烷的加合物;聚甘油(平均自 身缩合度为2-8)、三羟甲基丙烷、季戊四醇、糖醇（如山梨醇）、烷基葡糖苷(如甲基葡糖苷、 丁基葡糖苷、月桂基葡糖苷)和多糖苷(如纤维素）与饱和或不饱和的线性或分支的脂肪酸 (含有12-22个碳原子)和/或羟基烃酸(含有3-18个碳原子)的部分酯，及其与1-30摩尔环氧 乙烷的加合物;季戊四醇、脂肪酸、柠檬酸和脂肪醇的混合酯和/或含6-22个碳原子的脂肪 酸、甲基葡萄糖和多元醇(优选甘油或聚甘油）、单_、二-和三-烷基磷酸酯及单_、二-和/或 三PEG烷基磷酸酯及其盐的混合酯；羊毛蜡醇;聚硅氧烷-聚烷基-聚醚共聚物及相应的衍生 物;和嵌段共聚物，如聚乙烯乙二醇-30二多羟基硬脂酸酯。
[0097]在一些实施方式中，乳化剂为聚亚烷基二醇，比如聚乙二醇或聚丙二醇。在一些实 施方式中，乳化剂为分子量为l〇〇Da~5，000Da、200Da~2，500Da、300Da~1，000Da、400Da~ 750Da、550Da ~650Da 或约 600Da 的聚乙二醇。
[0098] 在一些实施方式中，乳化剂为本文中描述的泊洛沙姆。
[0099] 在一些实施方式中，乳化剂由一种或多种脂肪醇组成。在一些实施方式中，脂肪醇 为线性的或分支的C6~C 35脂肪醇。脂肪醇的实例包括，但不限于辛基醇（1-辛醇）、2_乙基己 醇、壬酸醇（1-壬醇）、癸酸醇（1-癸醇、葵醇）、十一烷基醇（1-十一醇、十一醇、十一烷醇）、月 桂醇（十二烷醇、1-十二烷醇）、十三基醇（1-十三烷醇、十三醇、异十三醇）、肉豆蔻基醇（1-十四醇）、十五烷基醇（1-十五醇、十五醇）、鲸蜡醇（1-十六醇）、棕榈油醇(顺式-9-十六烯-1-醇）、十七烷基醇（1-n-十七醇、十七醇）、硬脂醇（1-十八醇）、异硬脂醇（16-甲基十七-1-醇）、反油基醇(9E-十八烯-1-醇）、油醇(顺式-9-十八烯-1-醇）、亚油醇(9Z，12Z-十八碳二 烯-1-醇）、反油酰亚油醇(9E，12E-十八烷二烯-1-醇、亚麻醇(9Z，12Z，15Z-十八碳三烯-1-醇）、反油酰亚麻醇(9E，12E，15E-十八碳三烯-1-醇）、蓖麻油醇（12-羟基-9-十八烯-1-醇）、 十九醇（1-十九醇）、花生醇（1-二十醇）、二十一基醇（1-二十一醇）、山嵛醇（1-二十二醇）、 瓢儿菜醇(顺式-13-二十二烯-1-醇）、木蜡醇（1-二十四醇）、鲸蜡醇（1-二十六醇）、蒙旦醇、 普利醇（1-二十八醇）、蜂花醇、蜜蜡醇（1-三十醇）、geddyl醇（1-三十四醇)或鲸蜡硬脂醇。 [0100]在一些实施方式中，用于产生局部组合物的载体是聚乙烯与一种或多种脂肪醇的 混合物。比如，载体包含约50 %~约99%重量、约75 %~约99%重量、约90%~约99%重量 或约95%重量的聚乙二醇和约1 %~约50%重量、约1 %~约25%重量、约1 %~约10%重量 或约5%重量的脂肪醇。在一些实施方式中，所述载体为聚乙二醇和鲸蜡醇的混合物。
[0101] 局部组合物也可以包含其它适合此组合物的额外组分。在一些实施方式中，局部 组合物可以包含一种或多种下列组分:脂肪、蜡、珠光蜡、稠化剂、增稠剂、富脂剂、稳定剂、 聚合物、硅氧烷化合物、卵磷脂、磷脂、生物源活性成分、除臭剂、抗微生物剂、防汗剂、膨松 剂、驱虫剂、增溶物、助溶剂、防腐剂、芳香油和染料。这些成分每一种的实例在美国专利 N〇.8,067,044中公开，该专利通过引用结合到本文中。
[0102] 包含本文所述的杀肿瘤和/或抗微生物成分的局部组合物可以通过将此成分与载 体混合足够的时间使颗粒均匀地分散在整个载体中来制备。在载体含有两种或更多种成分 的情况中，该成分可以在加入杀肿瘤和/或抗微生物成分之前相互混合。杀肿瘤和/或抗微 生物成分在局部组合物中存在的量可根据用途的不同而变化。在一些实施方式中，杀肿瘤 和/或抗微生物成分为局部组合物的0.5%~20%、1 %~10%、2%~5%或约3%重量。
[0103] 应理解，杀肿瘤和/或抗微生物成分在组合物中的量在特定的情况中根据使用的 特定杀肿瘤和/或抗微生物成分、配制的特定组合物、应用的模式及治疗的特定位点和患者 来变化。对于给定主体的剂量可以利用常规的考虑因素来确定，比如通过将组合物和已知 疗法(例如根据适合的常规药理学方案)的差异活性的常规对比。确定药剂剂量领域的专业 医生和与配方设计师将根据标准建议（Physician's Desk Reference, Barnhart Publishing(1999))毫无问题地确定剂量。
[0104] 考虑单位剂量或多剂量形式，其在特定的临床环境中各具优势。单位剂量含有计 算为在治疗癌症的情况中产生期望的效果的预定量的杀肿瘤和/或抗微生物成分。多剂量 形式可以在需要多个单剂量或部分剂量以达到期望的终点的情况下非常有用的。这些给药 形式中任一种可以具有根据特定杀肿瘤和/或抗微生物成分的独特特征、要达到的特定治 疗效果、待治疗的疾病和患者的特定条件等指定的或直接取决于这些因素的使用说明。
[0105] 单位剂量含有足以治疗患者的疾病的治疗有效量，且可以包含约O.OOlmg到100mg 的杀肿瘤、细胞毒性和/或抗微生物成分。杀肿瘤、细胞毒性和/或抗微生物成分的量可以为 组合物的0.001%到90%￥/^，比如0.001%、0.01%、0.1%、1%、10%、50%或90%，或任何 两个数值之间的任何范围。治疗的疾病可以是可通过本发明的外来体治疗的任何疾病，比 如癌症、细菌感染、病毒感染或真菌感染。
[0106] 药物组合物可以进一步为口服制剂，比如可食用片剂、口含片剂、胶囊、囊片、酏 剂、悬液、糖浆、锭剂、圆片、糖锭剂等。
[0107] 组合物可以是持续缓放释制剂。所述组合物可以包封在硬质或软质胶囊中，可以 压制成片剂或可以加入饮料、食物中或以其它方式加入饮食中。最终组合物的和制剂的百 分比当然可以是变化的，且可以方便地在最终形式(如片剂)重量的1%到90%。这样的治疗 有效组合物的量使得获得合适的剂量。
[0108] 口服组合物的合适制剂也可以包含:粘合剂，比如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、明 胶;甜味剂，比如乳糖或蔗糖;崩解剂，比如玉米淀粉、海藻酸等；润滑剂，比如硬脂酸镁;或 调味剂，比如薄荷、冬青的油等。各种其它材料也可以作为涂层存在或以其它方式改变口服 剂量单位的物理形式。口服剂量单位可以用虫胶、糖或两者涂覆。糖浆或酏剂可以包含杀肿 瘤和/或抗微生物成分、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲 酸丙酯、染料和调味剂。使用的任何材料应当是药学上可接受的并且基本上是无毒的。
[0109] 制备药物组合物的其它说明可以在《雷明顿的医药科学》第19版（19th Edition of Remington's Pharmaceutical Sciences)，出版公司Mack Publishing Co . ,Easton, Pa. 18040中找到。其中的相关部分通过引用结合到本文中。
[0110] 本发明的治疗方法
[0111] 本文所述的组合物可用于治疗多种疾病如癌症。所述组合物可治疗的疾病的实例 包括免疫系统、淋巴系统和造血系统的恶性肿瘤、形成的肿瘤和实体肿瘤。所述组合物可治 疗的癌症的非限制性实例包括肥大细胞白血病、急性骨髓性白血病(AML )、红白血病、骨髓 障碍(比如骨髓性白血病、多发性骨髓瘤和红白血病）、生殖细胞肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、胃 肠间质瘤、神经母细胞瘤、宫颈瘤、卵巢的癌症、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌、甲 状腺癌、膀胱癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌(如黑色素瘤）、腺瘤(如结肠绒毛腺瘤） 和肉瘤(如骨肉瘤)等。
[0112] 在一些实施方式中，本文所述的药物组合物用于治疗皮肤癌，比如黑色素瘤、鳞状 细胞癌、基底细胞癌或肥大细胞瘤。
[0113] 在一些实施方式中，本文所述的药物组合物用于治疗其它表皮细胞癌，比如宫颈 癌或口腔癌。在一些实施方式中，本文所述的药物组合物用于治疗病毒感染细胞，比如疣。 [0114]在一些实施方式中，本文所述的药物组合物用于调节免疫系统。比如，外来体和/ 或微囊泡可以诱导细胞毒性的T细胞反应（比如，抗肿瘤），和/或诱导细胞凋亡（比如，激活 的免疫细胞的凋亡）。外来体和/或微囊泡也可以在免疫监测中发挥作用。
[0115]在一些实施方式中，本文所述的药物组合物可用于治疗感染。在一个实施方式中， 本文所述的药物组合物可用于治疗病原性病毒的感染。病原性病毒包括，但不限于人乳头 瘤病毒、人免疫缺陷病毒、EB病毒、巨细胞病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、流感病毒、呼吸道 合胞体病毒、痘病毒、水痘带状疱疹病毒和疱疹病毒。在一个实施方式中，本文所述的药物 组合物可用于治疗细菌感染。感染性细菌包括，但不限于链球菌、葡萄球菌、新型隐球菌、衣 原体、埃希氏菌、假单胞菌、梭状芽孢杆菌和念珠菌，包括任何上述细菌的抗生素抗性菌株。 在一个实施方式中，本文所述药物组合物可用于治疗由其它微生物引起的感染，包括真菌 和酵母。
[0116] 对于哺乳动物(包括人和驯养动物），有效量可以根据待覆盖的身体表面积（比如 感染面积)来施用，比如在局部组合物中。合适剂量范围为每平方米体表面积约O.OOlmg到 约100mg当量的杀肿瘤和/或抗微生物成分，比如约0.005mg/m 2到约50mg/m2。剂量可以每天 给药，如每天一次、两次、三次或更多次，或每两天或数天给药，或每星期给药等。如果施用 延释制剂，则给药频率可以降低。
[0117] 在一个实施方式中，有效量可以根据肿瘤体积确定。合适剂量范围为约1:100到约 1:10,000的外来体/微囊泡制剂与肿瘤体积的比例。在一个实施方式中，合适剂量范围为约 1:100到约1:1，000的外来体/微囊泡制剂与肿瘤体积的比例。在一个实施方式中，合适剂量 范围为约1:1000到约1:1，〇〇〇〇的外来体/微囊泡制剂与肿瘤体积的比例。
[0118] 在一个实施方式中，有效量可以根据患者的体重确定。合适剂量范围为每千克体 重约lyg到约l〇〇mg外来体/微囊泡制剂。在一个实施方式中，合适剂量范围为每千克体重约 lyg到约l〇mg外来体/微囊泡制剂。在一个实施方式中，合适剂量范围为每千克体重约lyg到 约100yg外来体/微囊泡制剂。在一个实施方式中，合适剂量范围为每千克体重约1 Oyg到 10mg外来体/微囊泡制剂的。在一个实施方式中，合适剂量范围为每千克体重约100yg到约 10mg外来体/微囊泡制剂。
[0119] 施用剂量和频率可取决于制剂类型、治疗的疾病、杀肿瘤和/或抗微生物成分的量 及患者的年龄、性别、种族和其它条件等。
[0120] 联合疗法
[0121] 在另一方面，本文所述的组合物可以与其它的癌症疗法联合使用，比如外科手术、 放疗、化疗（比如顺铂、卡铂、奥沙利铂、沙铂和吡铂，尤其是顺铂和卡铂；紫杉烷类，比如紫 杉醇和多烯紫杉醇;蒽环类，比如道诺霉素、阿霉素、表阿霉素、去甲氧基柔红霉素或戊柔比 星等）、基于细胞的疗法（比如NK-92细胞疗法）、抗体疗法等。在一些实施方式中，所述组合 物可以与本文所述的一种或多种细胞因子联合使用。
[0122] 以下实施例是用来阐述本发明，并不是限制本发明。所有在本说明书中引用的出 版物或参考文献在此通过引用结合到本文中。
[0123] 实施例
[0124] 实施例1 :NK-92细胞的抗微生物作用
[0125] NK-92细胞与新型隐球菌在圆底培养板中的Myelocult培养基中孵育24小时。效应 细胞:靶细胞(NK-92细胞:新型隐球菌）的比例为100:1 (1X106:1X104个细胞/孔）。新型隐球 菌（1χ104个细胞/孔)在没有NK-92细胞的情况下在Myelocult培养基中孵育24小时作为对 照。孵育24小时后，培养物经过系列稀释并平铺在沙氏琼脂板上。培养板在室温下孵育48小 时。测量每个稀释的菌落数量。
[0126] 各稀释下每板的菌落数量在图1中标明。白色条:NK-92细胞+新型隐球菌，黑色条： 单独的新型隐球菌。图2中显示NK-92细胞对新型隐球菌的生长抑制为约60 %。
[0127] 在NK-92细胞与另一种真菌（曲霉属的种)孵育时观察到相似的结果。NK-92细胞以 剂量和时间依赖性的方式对真菌产生菌丝损伤。
[0128] 实施例2:来自NK-92细胞上清液的外来体和/或微囊泡的分离
[0129] 通过超速离心法分离细胞外囊泡（外来体和/或微囊泡）。培养的NK-92细胞以 300xg离心10分钟，并丢弃细胞沉淀。上清液以2000xg离心20分钟，并丢弃沉淀(细胞碎片）。 由此产生的上清液进行l〇〇〇〇〇xg超速离心80分钟。由此产生的沉淀用磷酸盐缓冲盐水洗 涤，并进行l〇〇〇〇〇xg超速离心80分钟。洗涤的含有外来体和微囊泡的沉淀(EV/MV制剂)保留 用于进一步研究。
[0130] 实施例3:细胞外囊泡的表征
[0131] 在多种条件下培养NK-92细胞，如实施例2中描述的从培养基中分离细胞外囊泡。 培养条件见表1。细胞在收获外来体之前于exofreeFBS中条件化至少24到46小时。ExoFree FBS耗竭外来体以避免污染NK-92细胞外囊泡制剂。
[0132] 表1.NK-92生长条件
[0134] ^onza Group Ltd.
[0135] EV/MV制剂通过标准蛋白质印迹技术分析几种蛋白质的存在，如图3A和图3B中所 示。MCF-7细胞系用作外来体产生的阳性对照和细胞裂解蛋白的阴性对照。NK-92细胞沉淀 (NK-92细胞)作为阳性对照。MCF-7细胞在含10%ExoFree胎牛血清(FBS)和2mM L-谷氨酰胺 的DMEM培养基中培养。
[0136] 来自NK-92细胞和MCF-7细胞两者的细胞外囊泡对于Rab5B(外来体标志物)是阳性 的。NK-92EV/MV制剂(不是MCF-7EV/MV制剂)对于几种凋亡诱导和/或细胞裂解蛋白质也是 阳性的，这些蛋白已知参与NK细胞活性，包括穿孔蛋白、Fas配体(FasL)、颗粒酶B和粒溶素。 但是这些蛋白质中每一种的量似乎依赖于NK-92细胞生长条件，包括培养基主体（如αΜΕΜ (NK)、RPMI、X_VIV0)和血清浓度。
[0137] 来自NK-92细胞的EV/MV制剂分析其它细胞器的污染。从NK-92细胞分离的EV/MV显 示核物质（凋亡小体)的一些污染，但是不含其它的污染细胞器，如图3b中所示。
[0138] 实施例4: EV/MV制剂的细胞毒性
[0139] EV/MV制剂对Jurkat细胞的细胞毒性使用表1中显示的培养条件进行测试。Jurkat 细胞(2xl04)在170yL的培养基(含ExoFree FBS)和5、15或30yL的EV/MV制剂（用PBS达到200 yL的总孵育体积）中孵育2小时或20小时。细胞毒性通过碘化丙啶(PI)实验测定，且数据表 示为PI阳性(指示死细胞)的细胞的百分比。
[0140] 如图4中所示，来自NK-92细胞(而不是MCF-7细胞）的EV/MV制剂在体外对Jurkat细 胞有细胞毒性活性。培养基组成改变EV/MV的裂解潜能，且生长培养基中血清的存在刺激 NK-92细胞产生裂解性EV/MV。
【主权项】
1. 一种组合物，包含从NK-92细胞分离的外来体和/或微囊泡。2. 如权利要求1中所述的组合物，其中所述组合物包含无菌水溶液。3. 如权利要求2中所述的组合物，其中所述无菌水溶液包含一种或多种药学上可接受 的赋形剂。4. 如权利要求2中所述的组合物，其中所述无菌水溶液包括无菌PBS或无菌盐水溶液。5. 如权利要求2中所述的组合物，其中所述无菌水性组合物包含NK-92细胞的培养基上 清液。6. 如权利要求1中所述的组合物，其中所述外来体和/或微囊泡从限定的NK-92细胞亚 群分呙。7. 如权利要求1中所述的组合物，其中所述NK-92细胞在分离外来体和/或微囊泡之前 用至少一种刺激剂处理。8. 如权利要求7中所述的组合物，其中所述至少一种刺激物是IL-15和/或干扰素 γ。9. 一种药物组合物，包含药学上可接受的载体以及一种或多种从ΝΚ-92细胞分离的组 分，其中所述一种或多种组分是杀肿瘤的和/或抗微生物的。10. 如权利要求9中所述的药物组合物，其中所述组合物包含无菌水溶液。11. 如权利要求10中所述的药物组合物，其中所述无菌水溶液包含ΝΚ-92细胞的培养基 上清液。12. 如权利要求9中所述的药物组合物，其中所述一种或多种组分包含外来体和/或微 囊泡。13. -种药物组合物，包含权利要求1中所述的组合物和无菌水性载体。14. 如权利要求9-13任一项中所述的药物组合物，其中所述ΝΚ-92细胞包括野生型ΝΚ-92 细胞。15. 如权利要求9-13任一项中所述的药物组合物，其中所述ΝΚ-92细胞包括修饰的ΝΚ-92 细胞。16. 如权利要求9-13任一项中所述的药物组合物，其中所述ΝΚ-92细胞包括经修饰以表 达Fc受体、细胞因子、细胞因子受体和/或嵌合抗原受体的ΝΚ-92细胞。17. 如权利要求9-16任一项中所述的药物组合物，其中所述药物组合物是可注射制剂。18. 如权利要求17所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于真皮下或皮下 注射。19. 如权利要求17所述的药物组合物，其中所述药物组合物为注射延释制剂。20. 如权利要求9-19任一项中所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包含 增稠剂。21. 如权利要求9-16任一项中所述的药物组合物，其中所述药物组合物是局部制剂。22. 如权利要求21中所述的药物组合物，其中所述局部制剂在室温下为液体且应用于 身体时为凝胶。23. 如权利要求22中所述的药物组合物，其中所述局部制剂包含泊洛沙姆。24. 如权利要求21中所述的药物组合物，其中所述药物组合物是霜剂或洗剂。25. 如权利要求9-24任一项中所述的药物组合物，其中所述药物组合物进一步包含一 种或多种细胞因子。26. 如权利要求25中所述的药物组合物，其中所述一种或多种细胞因子至少包括IL-2。27. 如权利要求9-26任一项中所述的药物组合物，其中所述NK-92细胞在分离所述一种 或多种组分之前用至少一种刺激剂处理。28. 如权利要求27中所述的药物组合物，其中所述至少一种刺激剂是IL-15和/或干扰 素 γ 〇29. -种治疗患者的肿瘤的方法，包括给所述患者施用有效量的权利要求9-28任一项 中所述的药物组合物而治疗所述肿瘤。30. -种治疗患者的感染的方法，所述方法包括给所述患者施用有效量的权利要求9-28任一项中所述的药物组合物而治疗所述感染。31. 如权利要求30中所述的方法，其中所述感染是细菌感染、病毒感染、真菌感染或酵 母菌感染。32. -种用于诱导患者的免疫反应的方法，所述方法包括给所述患者施用有效量的权 利要求9-28任一项中所述的药物组合物而诱导免疫反应。33. -种用于诱导患者的免疫调节反应的方法，所述方法包括给所述患者注射有效量 的权利要求9-20任一项中所述的药物组合物而诱导免疫调节反应。34. -种试剂盒，其包含第一药物组合物和第二药物组合物，其中所述第一药物组合物 包含药学上可接受的载体和从ΝΚ-92细胞分离的外来体和/或微囊泡，且所述第二药物组合 物包含凝胶，其中所述第一药物组合物和第二药物组合物是局部制剂。35. 如权利要求34中所述的试剂盒，其中所述第二药物组合物包含泊洛沙姆。36. 如权利要求34中所述的试剂盒，其中所述第二药物组合物包含从ΝΚ-92细胞的生长 培养基上清液中分离的外来体和/或微囊泡。
【文档编号】A61P35/00GK105848662SQ201480068072
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2014年10月28日
【发明人】H·G·克林格曼, B·J·西蒙
【申请人】南克维斯特公司