一种药物组合物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于新药技术领域，具体涉及一种药物组合物及其应用。
【背景技术】
[0002] 大肠癌是常见的恶性肿瘤之一，在欧美等发达国家为恶性肿瘤发病率第二位，在 世界范围内为第三位。随着我国居民生活水平的不断提高和饮食习惯的日益西方化，大肠 癌的发病率也逐年增高，已跃居第3-5位，特别在大城市增幅更快。目前，应对大肠癌的治 疗仅采用对肿瘤有治疗效果的药物进行治疗，缺乏针对大肠癌的靶向治疗药物，使得大肠 癌治疗效果不佳，这种局面亟待改进。
[0003] miR-150抑制大肠癌细胞增殖
[0004]利用miRNA芯片直接从大肠癌进展过程中不同阶段（正常、腺瘤、腺癌）临床样 本中进行筛选分析，获得起关键作用的分子miR-150,随后利用临床大规模样本分析，发现 大肠癌患者中miR-150低表达水平与患者的生存期较短相关，同时此类病人对手术后化疗 的敏感性较差；而miR-150高表达水平则与患者的生存期较长相关，且此类病人对手术后 化疗的敏感性较好。在体外根据已知的miRNA序列构建miR-150类似物（mimics)、抑制物 (inhibitor)的oligo序列以及类似物和抑制物的对照序列（mimicscontrol、inhibitor control)(四条序列参见表1)，这四条序列可以通过商业公司购买。通过细胞学实验证实 外源导入的miR-150明显抑制大肠癌细胞的增殖，并且诱导癌细胞的程序化死亡。因此，使 用化学合成和修饰的microRNA治疗大肠癌开创了一种全新的治疗方法，是一种不同于传 统小分子或单克隆抗体药物的新型药物，作用机理明确，靶点清晰，又由于此类分子是体内 的自有分子，在安全性方面有独特优势。
[0005]表1
[0006]
[0007] 合成的miRNA对靶向基因表达的调控
[0008]MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码 RNA，通过对信使RNA的调节而调控目标蛋白质的表达。通常运用化学合成的方法合成模拟 生物体内源的miRNAmimics与miRNAinhibitor;化学合成的miRNAmimics能模拟细胞 中内源性成熟miRNA的高水平表达，以增强内源性miRNA的调控作用；而化学合成获得的 miRNAinhibitors能特异地革E1向和降解特定的miRNA分子，可以削弱内源miRNA的基因沉 默效应，从而调节靶蛋白质的表达量。
[0009] 用于体内siRNA传递的组氨酸-赖氨酸分枝状多肽（HKP)
[0010] 组氨酸-赖氨酸分枝状多肽（HKP，Histidine-LysineCo-polymer)是一种带正电 的分枝型聚合物（图1)，其已经成功用于质粒DNA和siRNA的体内传导。我们已开展在各 种组织类型中将HKP用于核酸体内导入，包括皮肤瘢痕、肝脏、肺脏、肿瘤、眼睛和大脑。但 是，siRNA和miRNA的分子性状不同，因此，能否采用HKP将miRNA进行体内导入，仍需研究。
【发明内容】
[0011] 本发明所要解决的技术问题是提供一种能够用于制备治疗大肠癌的靶向药物的 药物组合物。
[0012] 为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
[0013] -种药物组合物，其包括含化学修饰或不含化学修饰的微核酸分子microRNA、以 及适用于体内导入的载体，所述的载体为组氨酸-赖氨酸分枝状多肽（HKP)或其修饰物。
[0014] 具体地，所述的微核酸分子microRNA包括miR-150,所述的miR-150的序列为 5 '-UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG-3'，通过临床大规模样本分析，miR-150的表达水平与大肠 癌预后有紧密联系。
[0015] 具体地，所述的miR-150为根据体外已知miRNA序列构建的miR-150类似物。
[0016] 具体地，所述的微核酸分子microRNA为单链，易于降解，进行化学修饰以提高稳 定性。
[0017] 具体地，所述的化学修饰形成在所述的微核酸分子microRNA的单个核苷酸或多 个核苷酸或核苷酸和戊糖骨架上。
[0018] 具体地，所述的化学修饰的修饰基团为氟基或甲氧基。
[0019] 更具体地，所述的化学修饰在所述的微核酸分子microRNA单链的2'0H位进行全 碱基修饰。
[0020] 具体地，所述的微核酸分子microRNA包括miR-143,所述的miR-143的序列为 5 '-UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC-3'。
[0021] 更具体地，所述的miR-143为根据体外已知miRNA序列构建的miR-143类似物。
[0022] 具体地，所述的微核酸分子microRNA包括miR-195,所述的miR-195的序列为 5 <-UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC-3,〇
[0023] 更具体地，所述的miR-195为根据体外已知miRNA序列构建的miR-195类似物。
[0024] 具体地，所述的微核酸分子microRNA包括miR-150和miR-143,所述的miR-150 和所述的miR-143混合成双靶点微核酸抑制剂用于增强其抗肿瘤作用。
[0025] 具体地，所述的微核酸分子microRNA包括miR-150和miR-195,所述的miR-150 和所述的miR-195混合成双靶点微核酸抑制剂用于增强其抗肿瘤作用。
[0026] 具体地，所述的微核酸分子microRNA包括miR-143和miR-195,所述的miR-143 和所述的miR-195混合成双靶点微核酸抑制剂用于增强其抗肿瘤作用。
[0027] 具体地，所述的微核酸分子microRNA包括miR-150、miR-143和miR-195,所述的 miR-150、所述的miR-143和所述的miR-195混合成三靶点微核酸抑制剂用于增强其抗肿瘤 作用。
[0028] 具体地，所述的组氨酸-赖氨酸分枝状多肽（HKP)为带正电的分枝型组氨酸-赖 氨酸聚合物，在各种组织类型中用于核酸传导。
[0029] 具体地，所述的组氨酸-赖氨酸分枝状多肽的修饰物为增加一个组氨酸的分枝型 组氨酸-赖氨酸聚合物（HKP+H)，在各种组织类型中用于核酸传导，并诱导产生极低的免疫 及炎症反应。
[0030] 具体地，所述的组氨酸-赖氨酸分枝状多肽采用H3K4b，其由三个赖氨酸核心和四 个分枝构成，该四个分枝均包括大量重复的组氨酸、赖氨酸，其具体结构参见图1。
[0031] 具体地，所述的组氨酸-赖氨酸分枝状多肽的修饰物采用H3K(+H) 4b，其具体结构 为在H3K4b的分支上增加一个组氨酸，即H3K(+H)4b的结构为将图1中的侧链R采用R=KHHHKHHHKHHHHKHHHK进行替换。
[0032] 具体地，所述的载体与所述的微核酸分子microRNA的N:P质量比例介于8:1到 1 :8之间。
[0033] 优选地，所述的载体与所述的微核酸分子microRNA的N:P质量比例大于等于 4:1〇
[0034] 具体地，所述的载体采用三组分载体系统RGD-PEG-HKP，所述的三组分载体系统 RGD-PEG-HKP由所述的RGD和所述的HKP化学偶合在所述的PEG的两端。RGD是7到12个 氨基酸组成的多肽，对新生血管内皮细胞具有特异识别和附着作用，可作为微核酸导入系 统的靶向因子。
[0035] 三组分载体系统RGD-PEG-HKP的HKP端可以和微核酸通过电荷键结合形成纳米级 颗粒（约150nM)，RGD处于纳米颗粒外部行使细胞祀向功能。
[0036] 具体地，所述的微核酸分子microRNA的摩尔浓度大于等于InM。
[0037] 本发明的HKP委托外包公司API，按照本发明人拥有的专利技术合成。图2详述了 HKP合成的具体步骤。
[0038] -种所述的药物组合物在制备治疗大肠癌的靶向药物中的应用。
[0039] -种所述的药物组合物和小分子化药或单克隆抗体协同使用在制备治疗大肠癌 的靶向药物中的应用。
[0040] 本发明所使用的四条miRNA单链，经化学方法经由单体核苷酸全合成，而且采用 化学修饰增加其稳定性。修饰位置为RNA单链的全碱基2'-0_甲基化（2'-〇me)或者2'-F 代修饰（图14)，然后通过体外细胞实验中mimics的相对活性筛选并确定化学修饰类型。
[0041] 由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
[0042] 本发明通过将微核酸分子microRNA和载体按不同比例混合时，会自动组装成不 同粒径的纳米颗粒，该纳米颗粒适用于体内核酸导入，可以诱导大肠癌细胞的程序化死亡， 从而抑制大肠癌的肿瘤生长，对大肠癌具有显著药效。
【附图说明】
[0043] 附图1为组氨酸-赖氨酸分枝状多肽以及侧链增加一个组氨酸修饰的结构示意 图，其中，R表示四个分支侧链的氨基酸顺序。
[0044] 附图2为HKP的合成步骤图。
[0045] 附图3为琼脂糖凝胶电泳定性检测不同质量的HKP包载microRNA的能力。micro 尺熟统一为1耶，!1即与1^1?熟质量比分别为1:1、2:1、4:1、6:1、8:1;) ;]\1:]\&^1?^。
[0046] 附图4为琼脂糖凝胶电泳定性检测不同质量的HKP包载microRNA的能力。micro RNA统一为lug，HKP与miRNA质量比分别为 2:1、2· 5:1、3:1、3· 5:1、4:1;M:Marker。
[0047] 附图5为RiboGreen染色miRNA的荧光-浓度标准曲线。
[0048] 附图6为HKP与miR-150不同氮磷质量比（N/P)下游离miRNA占初始miRNA的比 例，即不同氮磷质量比（N/P)下，HKP对miRNA的包封能力。
[0049]