一种用于中药药代动力学评价的多组分高通量定量分析技术的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物药物分析领域，具体涉及用于评价中药药代动力学的生物样品中 多组分同时定量分析的UPLC-MS/MS技术。
【背景技术】
[0002] 中药药代动力学是中药药效物质基础研究与阐述的重要手段，是采用现代分析技 术测定生物样品中各中药组分的浓度，运用数学原理和模型阐述生物体内中药组分随时间 变化的规律，并与中药的临床表征关联以阐释中药的药效物质。传统的中药药代动力学常 规方法依照化学药物药代动力学模式，仅仅检测生物样品中极少数可获得标准对照品的指 标成分并评价其药代动力学行为特征，但少数指标成分的药动学行为难以阐释整体中药的 多组分、多靶点的协同作用机制。因此，中药药效物质的整体药代动力学评价方法亟待建 立。但是，中药的药效物质组分复杂、并且其中的大多数难以获得标准对照品，这是中药多 组分整体药代动力学评价的技术瓶颈。
[0003] 为了解决这一技术瓶颈，吉林大学顾景凯等提出了 "一种用于多组分中药的药 物代谢动力学的分析方法"（中华人民共和国国家知识产权局.发明专利.发明【申请号】 201010613662. 8 ;申请公布号：CN102175783A)，该方法以原料药为"标准品"，相对定量生 物样品中各组分的浓度，并以此评价中药多组分的药动学行为特征，初步解决了在没有标 准品的情况下，实现对生物样品中多组分中药进行"相对定量"分析。他们运用该技术以升 麻总皂苷原料药为"标准品"，对升麻总皂苷中的14种已知和未知组分进行了药代动力学 评价，并对其中3种已知组分与对照品外标法进行了比较，部分药动学参数，如体内滞留时 间MRT cm、达峰时间Tmax和半衰期t1/2等评价结果一致。
[0004] 然而，该技术仍然存在2个无法克服的缺陷：①运用该技术测得的数据，仅能够对 诸如体内滞留时间MRT(h)、达峰时间T max(h)和半衰期t1/2(h)等以时间为单位的药动学参 数进行定量评价；而无法评价诸如峰浓度C max(y g/mL)、曲线下面积AUC(y g/mL*h)、表观 分布容积Vd(L/kg)及肾清除率CL(L/kg/h)等多项与浓度或量有关的重要指标；②原料药 进入生物体内后可产生I相与II相代谢产物，这些代谢产物常与中药的原形组分具有协同 作用，需要同时分析与评价。但该技术仅能够实现对原料药中存在的原形组分的监测，而对 于生物体内产生的代谢产物则无法进行监测与评价。
【发明内容】
[0005] 为了克服常规方法与上述新技术的缺陷，本发明建立了一种基于不加校正因子的 内参比物多组分高通量分析技术，以实现仅需少数标准对照品即可对生物样品中中药的原 形组分及其代谢产物进行多组分的同时定量，进而全面评价中药的整体药代动力学特征。 具体的技术方案是：
[0006] (1)制备一定浓度的中药（单味或复方）提取物溶液（以下称为"原药液"）；
[0007] (2)给予实验动物原药液后收集动物尿液（以下称为"尿液"）；
[0008] (3)采用液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS)多反应监测（MRM)模式，建立原药液 与尿液中各组分及代谢产物的离子反应的母离子与子离子等定性定量参数；
[0009] (4)建立并验证所选取的内参比物的分析法，包括：内标物、生物样品预处理、内 参比物的线性范围与定量限、方法精密度与准确度、回收率与基质效应等；
[0010] (5)实验动物给予原药液后按拟定时间点采集生物样品；
[0011] (6)依据步骤（3)建立的各组分及代谢产物的分析条件记录各时间点生物样品中 各组分的质谱响应信号；
[0012] (7)依据步骤⑷建立的各内参比物标准曲线计算步骤（6)获得的各时间点生物 样品中各内参比物及其相关组分的浓度；
[0013] (8)建立各组分的浓度-时间曲线，并计算药代动力学参数；
[0014] (9)经与药效动力学的生物效应-时间曲线拟合，评价各组分的PK-ro相关性；
[0015] (10)将各组分的浓度通过数学模型"整合"后，以"整合"浓度与药效动力学的生 物效应响应拟合，最终评价并验证中药的药效物质及其作用机制。
[0016] 所述的中药为植物性中药材、中成复方及中药的各种现代剂型。所述的中药溶液 为用中药制成的供口服或注射用的溶液。所述的给予优选经灌胃或静脉注射给予。所述的 实验动物为小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬。所述的生物样品优选动物血清、血浆。所述的动物排泄 物优选动物尿液、粪便。所述的现代分析技术优选液相色谱-质谱（LC-MS)、液相色谱-串 联质谱（LC-MS/MS)技术，其中液相色谱优选高效液相色谱（HPLC)、超高效液相色谱（UPLC 或Ultra-HPLC)。所述的分析条件优选选择离子监测模式（SM)的特征离子、多反应离子监 测模式（MRM)模式的反应离子对。所述的原形组分为中药中存在的可监测的已知与未知组 分。所述的代谢产物为中药在动物体内经I相与II相代谢所产生的I相代谢物与II相代 谢物。所述的内参比物为一类具有共同结构特征的系列化合物的典型结构化合物。所述的 相关组分为与内参比物具有共同结构特征的同类系列化合物。所述的计算为使用内参比物 的标准曲线计算包括内参比物在内的具有共同结构特征的同类系列化合物的浓度。
[0017] 本发明还提供了基于权利要求1的方法原理编制的数据采集与处理程序。所述的 数据为检测的质谱信号以及由此衍生出来的生物样品中各组分浓度、整合组分浓度、中药 药代动力学参数。所述的整合组分浓度为生物样品中各效应组分浓度经一定的数学模型整 合的表观效应浓度。所述的效应组分为与生物效应存在相关性（包括正相关和负相关）的 可检测组分。所述的表观效应浓度为所有可检测效应组分的综合浓度。所述的数学模型包 括但不限于以下数学公式：
【主权项】
1. 一种用于中药药代动力学评价的多组分高通量分析方法，具有以下步骤： 制备一定浓度的供口服或注射用的中药溶液； 经灌胃或静脉注射给予实验动物由步骤（1)制备的溶液后收集动物尿液或粪便排泄 物，并制成相应的溶液； 米用液相色谱_质谱（LC-MS)、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS)等现代分析技术，建立 由步骤（1)与步骤（2)制备的溶液中所含的中药原形组分及其已知或未知I相或II相代 谢产物的定性定量参数； 采用由步骤（3)建立的组分分析条件，建立并验证所选取的内参比物的分析方法，包 括：生物样品预处理、内参比物的线性范围与定量限、方法精密度与准确度、回收率与基质 效应等； 给予实验动物由步骤（1)制备的溶液后按拟定时间点采集生物血清、血浆样品； 采用由步骤（3)建立的分析条件，检测并记录各时间点生物样品中各组分的质谱响 应信号；采用步骤（4)建立的方法计算各内参比物及其相关组分的浓度；建立各组分的浓 度-时间曲线，并计算药代动力学参数。
2. -种中药药代动力学评价软件，其特征在于：基于权利要求1的方法原理编制的数 据采集与处理程序。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的中药为植物性中药材、中成复方及 中药的各种现代剂型。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的实验动物为小鼠、大鼠、豚鼠、兔、 犬。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的内参比物为一类具有共同结构特 征的系列化合物的典型结构化合物。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的计算为使用内参比物的标准曲线 计算包括内参比物在内的具有共同结构特征的同类系列化合物的浓度。
7. 根据权利要求2所述的软件，其特征在于：所述的数据为检测的质谱信号以及由此 衍生出来的生物样品中各组分浓度、整合组分浓度、中药药代动力学参数。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的整合组分浓度为生物样品中各效 应组分浓度经一定的数学模型整合的表观效应浓度。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的表观效应浓度为所有可检测效应 组分的综合浓度。
10. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的数学模型包括但不限于以下数学 公式：
式中，f i为第i个时间点生物样品中效应组分的"表观效应浓度";为第i个时间 点生物样品中第j个效应组分的浓度;矣为第j个效应组分PK-ro拟合曲线的斜率，正相关 时符号不变，当负相关时符号相反。
【专利摘要】本发明属于组分药物分析技术领域。采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)多反应监测(MRM)扫描模式，建立生物体内多组分的定量反应离子，以典型结构类型的代表组分作为“内参比物”，定量分析生物体内的中药原形组分与生物体内代谢产物的浓度，并以中药原形组分与代谢产物制备混合质控样品验证方法并监控分析过程。本发明建立的基于不加校正因子的内参比物多组分高通量分析技术，解决了多组分定量分析缺乏标准对照品的技术障碍，实现仅以少数组分的标准对照品即可对生物样品中可监测中药原形组分及其代谢产物进行多组分的整体定量。采用本技术对中药复方的已知与未知组分及代谢产物进行了多组分整体药代动力学评价。结果表明，本技术符合CFDA的相关技术要求。
【IPC分类】G01N30-88
【公开号】CN104833748
【申请号】CN201410048405
【发明人】于治国, 赵云丽, 赵星, 陈晓辉
【申请人】沈阳药科大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2014年2月11日