真菌病毒、植物病害真菌、植物病害防治剂、植物病害防治方法和植物病害真菌减毒方法
【专利摘要】一种真菌病毒，其对植物病害真菌发挥更优异的防治效果。其特征在于：具有五种双链RNA，该五种双链RNA中，有四种双链RNA分别相对于SEQIDNO:1～4所示的核苷酸序列具有81%、75%、72%和73%以上的同源性。作为一个例子，使用新型真菌病毒MoCV3。
【专利说明】真菌病毒、植物病害真菌、植物病害防治剂、植物病害防治方法和植物病害真菌减毒方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及抑制植物病害真菌对植物的感染力的新型真菌病毒，还涉及感染了该真菌病毒的植物病害真菌、利用了该真菌病毒的植物病害防治剂以及植物病害防治方法、和使用了该真菌病毒的植物病害真菌减毒方法。
【背景技术】
[0002]植物病害中，存在因气象?土壤等环境因素发生的病害、因病毒?细菌?真菌(丝状菌)等感染性因素发生的病害、由于生理性障碍而发生的病害、因这些复合性因素发生的病害等。目前，植物病害中包括许多对粮食、花卉、花木、树木等的生产形成阻碍因素的病害，经济上的影响大的病害也有很多。
[0003]植物病害中，真菌是最重要的病害因子之一。据说约80%的植物病害是由真菌引起的。
[0004]例如，稻瘟病是在世界各地发生的最重要的植物病害之一。其病原菌是霉(丝状菌)的一种、即水稻稻痕病菌{学名“Magnaporthe orjzae (稻痕病菌)”)。25°C左右是水稻稻瘟病菌发育、胞子形成、感染的合适温度，另外，其喜欢湿润的环境。因此，由于夏季的低温、多雨、日照不足等气象因素而大量发生，导致水稻的歉收、品质下降，带来经济上的巨大打击。
[0005]此外，还存在纹枯病、锈病、白粉病、炭疽病、菌核病、霜霉病、灰霉病等以真菌为病因、经济上的影响也大的许多植物病害。因此，目前人们也在尝试着开发新的农药或改良品种等(关于稻瘟病的防治，例如参照专利文献1、2)。
[0006]在此，下面对本发明所关联的事项即真菌病毒进行说明。
[0007]将感染真菌类(Fungi，下同)的病毒称为真菌病毒。其中，有人报道了以双链RNA作为基因组的真菌病毒。这些真菌病毒中，潜在性地感染宿主菌、对宿主的形质几乎没有影响的真菌病毒较多。
[0008]以双链RNA作为基因组的真菌病毒，目前分为分体病毒科(学名uParti ti viridae ”，下同)、全病毒科(学名“ Tb viridae ”，下同)、金色病毒科(学名
下同)等五科。分体病毒科病毒在其病毒颗粒中有两个几乎相同大小的直链状双链RNA，总基因量为4~6kbp。全病毒科病毒在其病毒颗粒中有4~7kbp的一条直链状双链RNA。此外,在栗疫病菌{学名“Cryphonectria parasitica,y)中，发现了菌内源性地存在、且具有9~13kbp的双链RNA的病毒(低毒力病毒等)。
[0009]金色病毒科病毒具有球形的病毒样颗粒，并具有四种成分的双链RNA。另外，已知其与分体病毒科和全病毒科的病毒一样，具有编码RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependentRNA polymerase ；RdRP)的区。作为属于金色病毒科的病毒，例如已知有Hvl45SV(“长螺孢菌 145S 病毒{Helminthosporium victoriae 145S virus) ”,下同)、PcV ( “产毒青霉病毒iPenicillium chrysogenum virus) ”,下同)、AbVl (“双抱蘑燕病毒 I (Agaricus bisporusvirus 1) ”,下同)等(参照非专利文献I等)。
[0010]近年来，对于特定的植物病害，研究通过真菌病毒等将其病原菌减毒，之后使用该减毒菌来防治该病害的方法，一部分方法已经实际应用。例如，公开了下述方法:使用抑制栗疫病菌的毒性的病毒性双链RNA的全长cDNA将该菌减毒，再将该菌应用于栗疫病的防治的方法(参照非专利文献I等)；或者，发现了抑制紫纹羽病菌(学名“Heli—mompa”)的双链RNA病毒，使用内含该双链RNA的紫纹羽病菌减毒菌株来防治紫纹羽病的方法(参照非专利文献2、专利文献3等)等。
[0011]另外，在专利文献4中，公开了感染水稻稻瘟病菌、并使水稻稻瘟病菌的感染力降低的真菌病毒、以及感染了该真菌病毒的植物病害真菌减毒株。通过使用专利文献4中公开的真菌病毒，可以将植物病害真菌减毒，可以提供植物病害的新的防治方法。
[0012]现有技术文献 专利文献
专利文献1:日本特开2004-143045号公报；
专利文献2:日本特开2003-250370号公报；
专利文献3:日本特开2001-78752号公报；
专利文献4:国际公开W0/2009/093409号公报；
非专利文献
非专利文献 1:C.M.Fauquet, Mary Ann Mayo, J.Mani1ff, U.Desselberger,L.A.Ball, “Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses;Eighth Report Of The International Committee On Taxonomy Of Viruses，，，ElsevierAcademic Press:第 591-595 页；
非专利文献2:Gil H.Choi和Donald L.Nuss, ^Hypovirulence of chestnut blightfungus conferred by an infectious viral cDNA.” Science.1992 Aug 7; 257(5071):800-3 ；
非专利文献 3:H.0saki 等人,“Detection of Double-Stranded RNA Virus from aStrain of the Violet Root Rot Fungus Helicobasidium mompa Tanaka，， Virus Genes25: 2， 139-145， 2002。
【发明内容】
[0013]发明所要解决的课题
上述专利文献4中，虽然公开了将植物病害真菌减毒的真菌病毒，但使用该真菌病毒和感染了该真菌病毒的植物病害真菌减毒株时的防治效力还谈不上充分，人们要求达到更高的防治效力。因此，本发明的目的在于提供:对植物病害真菌具有更优异的防治效果的真菌病毒、感染了该真菌病毒的植物病害真菌、包含该真菌病毒和/或该植物病害真菌的植物病害防治剂、使用该真菌病毒和/或该植物病害真菌的植物病害防治方法、以及植物病害真菌的减毒方法。
[0014]解决课题的方法
达成上述目的的本发明包含下述内容。
[0015](I)真菌病毒，其特征在于:具有五种双链RNA，该五种双链RNA中有四种双链RNA分别相对于SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列具有81%、75%、72%和73%以上的同源性。
[0016](2) (I)所述的真菌病毒，其特征在于:该五种双链RNA分别为包含SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5所不的核苷酸序列的多核苷酸。
[0017](3)植物病害真菌，其中，上述(I)或上述(2)的真菌病毒感染了宿主。
[0018](4) (3)所述的植物病害真菌，其特征在于:上述宿主为水稻稻瘟病菌。
[0019](5)植物病害防治剂，其中包含上述(I)或上述⑵所述的真菌病毒或上述(3)或
(4)所述的植物病害真菌。
[0020](6)植物病害真菌防治方法，该方法包括:使上述(5)所述的植物病害防治剂与植物接触的步骤。
[0021](7)植物病害真菌减毒方法，该方法包括:使上述(I)或上述(2)所述的真菌病毒感染植物病害真菌的步骤。
[0022](8) (7)所述的植物病害真菌减毒方法，其特征在于:上述植物病害真菌为水稻稻瘟病菌。
[0023] 本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本国专利申请2011-38951号的说明书和/或附图中记载的内容。
[0024]发明效果
与以往的真菌病毒相比，本发明的真菌病毒对植物病害真菌的防治效力非常优异。因此，通过使用本发明的真菌病毒和该真菌病毒感染的植物病害真菌，可以以较以往优异的效率防治植物病害。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1是显示观察PDA培养基中的水稻稻瘟病菌S-0412-1I 2a株和水稻稻瘟病菌S-0412-1I Ia株的集落的结果的照片；
图2是显示在PDA培养基中观察水稻稻瘟病菌S-0412-1I 2a株和水稻稻瘟病菌S-0412-1I Ia株的病毒治愈株的集落的结果的照片；
图3中，(A)是显示水稻稻瘟病菌S-0412-1I 2a株及其病毒治愈株的菌丝产量的特性图，(B)是显示水稻稻瘟病菌S-0412-1I Ia株及其病毒治愈株的菌丝产量的特性图；
图4是显示喷雾接种水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株时的病斑数的柱形图；
图5是MoCV3颗粒的电子显微镜照片；
图 6 是显示通过 PCR 扩增 MoCV3 全长 cDNA 克隆 dsRNAl、dsRNA2、dsRNA3、dsRNA4 和dsRNA5后，再亚克隆到pUC19中的质粒的构成的图；
图7是显示用于构建穿梭载体的pRSA313、pRSA314和pRSA315的构成的图；
图8是显示用于构建穿梭载体的pRSA316和pRSA317的构成的图；
图9中，(a)是显示通过蔗糖浓度梯度离心分馏重构建的MoCV3，再使用抗MoCV3抗血清对所得的组分进行蛋白质印迹分析的结果的图；(b)是显示使用电子显微镜观察MoCV3病毒样颗粒的结果的图。
【具体实施方式】[0026]以下，详细说明本发明。本发明的真菌病毒具有五种双链RNA。这五种双链RNA中，有四种双链RNA分别包含相对于SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列具有81%、75%、72%和73%以上的同源性的核苷酸序列。本发明的真菌病毒具有感染水稻稻瘟病菌(学名“Magnaporthe oryzae (稻瘟病菌)”)、并将水稻稻瘟病菌等植物病害真菌减毒的功能。
[0027]作为本发明的真菌病毒的一个例子，具有包含SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列的五种双链RNA。需要说明的是，序列表中的SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:5的核苷酸序列均以DNA序列的形式记载，但它们均还包含RNA情形的序列(胸腺嘧啶被取代成尿嘧啶的序列)。
[0028]本发明的真菌病毒可以以内含在水稻稻瘟病菌内的形式保存。作为本发明的真菌病毒的一个例子，可以列举本发明人等鉴定、命名的MoCV3 (Magnaporthe oryzaechryso virus 3，稻温病菌金色病毒属3)。该MoCV3具有包含SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的五种双链RNA，以内含在水稻稻瘟病菌内的形式保存。
[0029]内含该MoCV3的水稻稻瘟病菌S-0412-1I 2a株在独立行政法人制品评价技术基础机构特许微生物保藏中心，以内含病毒为理由，证明为不适于保藏。另外，本菌保存在国立大学法人东京农工大学农学部植物病理学研究室，在遵守各法令的条件下，可以转让给第三方。另外，将本菌保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)的手续正在进行中。
[0030]需要说明的是，本菌株的原产地是越南。双链RNA中，在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列中包含编码RdRp (RNA依存性RNA合成酶)的保守基序的区，并且该区的核苷酸序列与金色病毒科病毒具有同源性。因此，推测该真菌病毒是分类为金色病毒科的新型病毒。
`[0031]该MoCV3与国际公开W0/2009/093409号公报中公开的MoCVl非常类似，但与MoCVl相比不同点在于:其水稻稻瘟病菌的减毒能力优异。另外，MoCV3中的五种双链RNA中，SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 4所示的四种双链RNA相对于MoCVl的四种双链RNA分别显示出80.5%,74.5%、71.3%和72.5%的同源性。即，含有包含相对于SEQ ID NO:1~SEQID NO: 4所示的四种双链RNA分别具有81%、75%、72%和73%以上的同源性的核苷酸序列的四种双链RNA的真菌病毒作为新型真菌病毒包含在本发明的技术范围内。
[0032]另外，本发明的真菌病毒具有相对于SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列分别具有例如85%以上、优选90%以上、更优选95%以上、最优选97%以上的同源性的五种双链RNA，可以是能够将水稻稻瘟病菌等植物病害真菌减毒的真菌病毒。这里，“同源性”是指核苷酸序列完全一致，而“类似性”是指通过取代腺嘌呤和鸟嘌呤、或胸腺嘧啶(尿嘧啶)和胞嘧啶，核苷酸序列完全一致。
[0033]需要说明的是，本发明的真菌病毒不限于该MoCV3，还包含向MoCV3中人为或自然地导入突变的真菌病毒。即，本发明的真菌病毒可以是能够将水稻稻瘟病菌等植物病害真菌减毒的突变体，是相对于SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列有I个或多个(例如2~100个、优选2~50个、更优选2~25个、最优选2~10个)核苷酸被取代、缺失、添加或插入的核苷酸序列。
[0034]另外，在SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列中，分别包含蛋白的编码区。由SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5包含的编码区所编码的推测蛋白的氨基酸序列分别见 SEQ ID NO: 6 ~SEQ ID NO: 10。
[0035] 本发明的真菌病毒具有抑制植物病害真菌的生长等的作用。因此，例如用该真菌病毒感染规定的植物病害真菌，使其内含在该植物病害真菌内，从而可以制作该植物病害真菌的减毒菌株。
[0036]另外，例如通过将含有本发明的真菌病毒和/或所制作的植物病害真菌的减毒菌株的植物病害防治剂附加(散布、涂布等)在植物(水稻等)上，有可能可以防治其植物病害。此外，本发明的真菌病毒具有以下特征。以往，真菌病毒是通过菌丝融合从宿主菌的细胞垂直传播给细胞，认为在真菌病毒的生活链中不存在存在于宿主菌的细胞外的阶段。相对于此，通过本发明人等的研究，可知本发明的真菌病毒还可以存在于细胞外。
[0037]因此，可以不依赖于菌丝融合而从细胞外感染宿主菌，所以即使在接合型的不同的菌主、菌株间，也可以广泛地感染本发明的真菌病毒，而且，还可以高效率地感染宿主菌。即，由此可以简易且高效率地进行植物病害真菌的减毒或植物病害的防治的可能性大。
[0038]另外，由于本发明的真菌病毒还存在于细胞外，所以例如通过在液体培养基中培养宿主菌,再从其培养上清中回收真菌病毒,可以简易且较大量地生产真菌病毒。
[0039]当本发明的真菌病毒内源性地存在于规定的水稻稻瘟病菌中时，例如可以利用公知的方法从该水稻稻瘟病菌株中进行分离、回收。需要说明的是，内含本发明的真菌病毒的水稻稻瘟病菌可以在与普通的水稻稻瘟病菌相同的培养基、培养条件下进行培养。
[0040]<关于本发明的基因、核酸、蛋白等>
本发明人等对本发明的一个真菌病毒进行序列分析，得到了全长的核苷酸序列(SEQID NO:1~SEQ ID NO: 5)。因此，该真菌病毒基因、具有其核苷酸序列或其中一部分序列的核酸、这些核苷酸序列所编码的蛋白等均包含在本发明内。
[0041]本发明还包含所有的具有上述的全部或一部分核苷酸序列的核酸。核酸可以是双链、单链中的任一种，另外还包含所有的DNA、cDNA、RNA等。
[0042]例如,SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5的全部或任意一个序列、该序列中具有规定功能的特定部分的序列、具有与这些序列同等的核苷酸序列的cDNA、插入了与这些序列同等的核苷酸序列的重组载体(质粒、病毒等)等也包含在本发明内。
[0043]序列分析的结果可知:在SEQ ID NO:1的序列部分中，存在RdRp (RNA依赖性RNA合成酶)的保守基序；以及在SEQ ID NO: 4的序列部分与法兰西病病毒(La Francedisease virus)的双链RNA片段具有同源性。因此，根据目的、用途，例如作为具有规定功能的特定部分，可以制作、使用至少具有上述序列部分的核酸、重组载体等。
[0044]需要说明的是，本发明的核酸(或基因)中，还广泛包含与上述核苷酸序列具有同源性的核酸、例如和包含与其核苷酸序列互补的核苷酸序列的核酸在严格条件下杂交、且具有水稻稻瘟病菌抑制作用的核酸。这里，严格条件可以通过双链核酸的Tm值等公知技术而获得。
[0045]本发明还包含上述的真菌病毒基因和核酸所编码的所有蛋白。本发明的蛋白的氨基酸序列见 SEQ ID NO: 6 ~SEQ ID NO: 10。
[0046]SEQ ID NO: 6是SEQ ID NO:1记载的核苷酸序列中的可读框的氨基酸序列，SEQID NO: 7是SEQ ID NO: 2记载的核苷酸序列中的可读框的氨基酸序列，SEQ ID NO: 8是SEQ ID NO: 3记载的核苷酸序列中的可读框的氨基酸序列，SEQ ID NO: 9是SEQ ID NO:4记载的核苷酸序列中的可读框的氨基酸序列，SEQ ID NO: 10是SEQ ID NO: 5记载的核苷酸序列中的可读框的氨基酸序列。
[0047]需要说明的是，本发明的蛋白除了包含具有SEQ ID NO: 6-SEQ ID NO: 10的任意一个氨基酸序列的蛋白，还包含所有的与这些蛋白具有同源性且保持其功能的蛋白。
[0048]例如，通过在重组载体中插入上述的核酸、并使之在该宿主中强制表达，有可能可以大量制备这些蛋白。认为宿主可以使用大肠杆菌类、酵母类、培养细胞等公知的宿主。若考虑到真菌病毒感染真菌、以及酵母类具有高增殖性且利用也比较简便等，作为宿主，酵母类有可能最适合。关于重组载体，认为可以使用公知的重组载体。
[0049]另外，例如通过使用多个插入有SEQ ID NO:1-SEQ ID NO: 5中的任意一个的载体，使这五种基因中的多个共表达，可以重建真菌病毒。这种情况下，也可以使用公知的宿主和公知的重组载体，在可以同时导入多个载体方面，酵母类成为最适合的宿主。需要说明的是，SEQ ID NO:1-SEQ ID NO: 5所示的五种核酸片段，可以通过以从真菌病毒中提取的dsRNA为模板的RT-PCR法来获得。另外，SEQ ID NO:1-SEQ ID NO: 5所示的五种核酸片段还可以根据其序列信息进行全合成。换言之，即使本发明的真菌病毒本身和/或内含该真菌病毒的水稻稻瘟病菌S-0412-1I 2a株没有保藏在保藏机关，本领域技术人员也可以使用上述重组载体来制造该真菌病毒。
[0050]<关于植物病害真菌减毒菌株>
本发明的植物病害真菌减毒菌株包含所有的内含本发明的真菌病毒的菌株。即，例如包含已经内含该真菌病毒的水稻稻瘟病菌等菌株和感染了该真菌病毒的植物病害真菌的菌株两者。
[0051]作为使真菌病毒感染植物病害真菌等的方法，例如有如以往所述在菌丝融合时使宿主菌感染的方法。另外，如上所述，本发明的真菌病毒还能够存在于细胞外，因此例如还可以从细胞外直接感染宿主菌。
[0052]作为该植物病害真菌减毒菌株的例子，可以列举上述的S-0412-1I 2a株。该菌株是感染了本发明的真菌病毒的水稻稻瘟病菌的菌株。因此，其形态的性质、培养的性质、胞子形成、生理学?化学分类学的性质基本上与公知的水稻稻瘟病菌相同。但是，其较普通的水稻稻瘟病菌生长快，菌丝成长成非同心圆状，色素沉着也不均匀。另外，发现气生菌丝异常发达，观察到扇形面形成或溶菌。
[0053]<关于植物病害防治剂>
本发明的植物病害防治剂包含所有的至少含有本发明的真菌病毒或本发明的植物病害真菌减毒菌株的任意一方的植物病害防治剂。另外，可以含有该真菌病毒和该植物病害真菌减毒菌株两者，也可以含有其他成分。
[0054]作为其他成分，例如可以含有规定的载体、粘合剂、增稠剂、固着剂、防腐防霉剂、溶剂、稳定化剂、抗氧剂、防紫外线剂、防晶体析出剂、消泡剂、物性提高剂、着色剂等。另外，还可以含有其他农药成分、例如杀螨剂、杀线虫剂、杀菌剂、抗病毒剂、诱导剂、除草剂、植物生长调节剂、增效剂等。
[0055]作为载体，例如可以使用固体载体和/或液体载体。作为固体载体,例如可以列举:淀粉、活性炭、大豆粉、小麦粉、木粉、鱼粉、奶粉等动植物性粉末；滑石粉、高岭土、膨润土、沸石、硅藻土、白炭黑、粘土、氧化铝、碳酸钙、氯化钾、硫胺等矿物性粉末。作为液体载体，例如可以列举:水、异丙醇、乙二醇等醇类；环己酮、丁酮等酮类；丙二醇单甲醚、二甘醇单正丁醚等醚类；煤油、轻油等脂肪族烃类；二甲苯、三甲基苯、四甲基苯、甲基萘、溶剂石脑油等芳族烃类；N-甲基-2-吡咯烷酮等酰胺类；脂肪酸的甘油酯等酯类；大豆油、菜籽油等植物油。
[0056]作为粘合剂、增稠剂、固着剂，例如可以列举:淀粉、糊精、纤维素、甲基纤维素、乙
基纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基淀粉、普鲁兰多糖、海藻酸钠、海藻酸铵、海藻酸丙二醇酯、瓜尔胶、刺槐豆胶、阿拉伯胶、黄原胶、明胶、酪蛋白、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、聚乙二醇、乙烯?丙烯嵌段聚合物、聚丙烯酸钠、聚乙稀批略烧丽等。
[0057]对本防治剂的剂型没有特别限定。例如可以使用乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、片剂、水合剂、水溶剂、液剂、流动剂、颗粒水合剂、气溶胶剂、糊剂、油剂、乳浊剂等形式。
[0058]<关于植物病害真菌抑制性真菌病毒生产方法>
本发明的植物病害真菌抑制性真菌病毒生产方法，其包含所有的至少包含下述步骤的方法，所述步骤是指用液体培养基等培养含有真菌病毒的植物病害真菌，并从其培养上清中回收真菌病毒的步骤。
[0059]如上所述，本发明的真菌病毒还能够存在于宿主菌的细胞外。因此，例如用液体培养基等培养感染了真菌病毒的植物病害真菌，通过离心分离来分离菌体，之后从其培养上清中分离、回收病毒，从而可以简易且较大量地回收病毒。
[0060]但是，本发明的真菌病毒并不局限于利用该生产方法得到的真菌病毒。即，本发明还广泛包含例如从内含真菌病毒的水稻稻瘟病菌中分离、回收而获得的真菌病毒。
[0061]另一方面，作为本发明的植物病害真菌抑制性真菌病毒生产方法，还包括下述方法:如上所述，使用多个插入有SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5的任一个核酸片段的载体，使这五种基因中的多个在宿主细胞内共表达，回收在该宿主细胞内重建的真菌病毒的方法。作为宿主细胞，可以使用酵母。作为用于插入上述五种基因的载体，只要是可以使所插入的基因在宿主细胞内表达的载体即可，没有特别限定，可以使用任何载体。另外，关于插入到载体中的核酸片段，可以根据SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列进行全合成。
[0062]<关于植物病害真菌减毒方法>
如上所述，例如通过使本发明的真菌病毒感染特定的植物病害真菌等，可以抑制该宿主菌的生长等，将该菌减毒。关于真菌病毒的感染方法，可以采用与上述相同的方法。
[0063]<关于植物病害防治方法>
本发明的植物病害防治方法，其包含所有的至少包含下述步骤的方法，所述步骤是指将上述的水稻稻瘟病防治剂附加在特定的植物(水稻等)上的步骤。
[0064]作为在植物上附加防治剂的方法，例如可以列举:在叶的表面或背面涂布防治剂的方法、使用规定的载体等使防治剂附着在叶的表面或背面的方法、向叶上散布或供给防治剂的方法等。
[0065]关于防治剂的涂布量或散布量，根据有效成分的浓度、制剂的形态、对象病害或作物的种类、病害所引起的被害的程度、施用场所、施用方法、施用时期、混用?并用的药剂或肥料等的使用量、种类等各种条件，可以适当选择。
[0066]例如，通过向每片叶子喷洒或供给I~1，OOOmL调整至IX IO3~IX 101°个/mL的水稻稻痕病菌减毒菌株的分生孢子(conidia)含有液，另外通过在每Imm2的叶子上，在叶表面或背面涂布或附着IXlO3~IXIOki个水稻稻瘟病菌减毒菌株的分生孢子，有可能可以抑制植物病害。
[0067]另外，将培养上清中存在的MoCV3适度稀释得到的病毒溶液(原液的10倍~100倍左右)、或者将由水稻稻瘟病菌S-0412-1I 2a株的菌体提取的MoCV3病毒颗粒成分适度稀释，直接散布在水稻叶上，从而可以实现具有对水稻稻瘟病菌的防治效果、或治愈效果的水稻稻瘟病菌的防治法。作为实际的防治效力，使用MoCV3作为病毒散布剂时，得到了 63.6以上的防治效力的结果，可以得到国际公开W0/2009/093409号公报中公开的MoCVl的防治效力即56.8以上的优异的结果。
[0068]本发明有可能可以适用于以真菌作为主要病因的所有的植物病害。作为具有应用可能性的植物病害，例如可以列举下述植物病害(并不限于这些)。
[0069]作为水稻科植物的植物病害，例如有:水稻稻瘟病(病原菌为“稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae) ”)、水稻芝麻叶枯病(病原菌为“宫部旋孢腔菌iCochliobolusmiyabeanus) ”)、纹枯病(病原菌为“水稻纹枯病菌(Jhanatephorus cucumeris) ”)、恶苗病(病原菌为“腾仓赤霉{Gibberella”)、立枯病(病原菌为“镰刀菌(Fusarium菌)”、“根霉{Rhizopus)菌”、“腐霉(Pythium)菌”、“绿色木霉 ijrichoderma viride) ”)、稻曲病(病原菌为“麦角菌属菌{Claviers Kirez7l5) ”)、麦类的赤霉病(病原菌为“玉米赤霉{Gibberella zeae) ”、“燕麦键刀菌 ipusarium avenaceum) ”、“大刀键刀菌 ifusariumcu Imorum) Monographella nivale” )、雪腐病(病原菌为“腐霉菌(Pythium 菌)”、“瑚菌{Typhula菌)”、“雪腐明梭孢iMonographella ni valis) ”、“小麦雪霉叶枯病有性(Myriosclerotinia AoreaJi1S) ”)、散黑穗病(病原菌为“裸黑粉菌 iUstilago /wt/a)”)、小麦矮腥黑穗病(病原菌为“小麦矮腥黑穗菌UilletiamrM) ”)、眼斑病(病原菌为“小麦基腐病菌(Pseudocerco sporella AerjDotricAoiofe1S) ”)、叶斑病(病原菌为壳针孢类叶枯病菌“ tritici) ”)、颖枯病(病原菌为“小麦颖枯病菌{Phaeosphaerianodorum) ”)、白粉病(病原菌为“小麦白粉病菌iBlumeria graminis) ” )。
[0070]作为其他的植物病害，例如有:柑桔类的黑点病(病原菌为“柑橘间座壳菌Wiaporthe ci tri) ”)、小黑点病(病原菌为“ QJiaporthe medusa) ”、“柑桔链格孢菌(Alternaria ci tri) ” )、疮痂病(病原菌为“柑桔痂囊腔菌 iBlsinoe fawcettii) ”)、褐色腐败病(病原菌为“柑橘褐腐疫霉{Phytophthora citrophthraTUm'm (病原菌为“指状青霉iPenicillium digitatum) ”、、着霉病(病原菌为“意大利青霉菌iPenicillium
苹果的花腐病(病原菌为“苹果链核盘菌(Monilinia黑星病(病
原菌为“苹果黑星菌iyenturiei”)、斑点落叶病(病原菌为“苹果斑点落叶
病病菌ternaria mali) ”)、黑点病(病原菌为“苹果斑点小球壳菌iMycosphaerelIapomi) ”)、煤斑病(病原菌为“仁果粘壳孢{Gloeodes pomigena) ”)、煤点病(病原菌为“ (^ygophiala jamaicensis) ”)、轮纹病(病原菌为“苹果轮纹病菌{BotryosphaeriaAereflgeriaaa) ”)、褐斑病(病原菌为“苹果双壳菌(Piplocarpon /mJ/) ”)、赤星病(病原菌为“苹果赤星病菌iGymnosporangium yamadae)”、)、腐1 烂鬼(病原菌为“苹果树腐烂病菌(VaIsa C6?ra(05776?/m3) ”)、梨的黑星病(病原菌为“梨黑星病菌(Jenturia nashicola)”、、赤星病(病原菌为“梨胶锈菌{Gymnosporangium asiaticum)”)、轮级病(病原菌为“轮纹病菌(Botryosphaeria Aereflgeriaaa) ”)、胴枯病(病原菌为“梨褐腐病菌(Phomopsis/i/ksAii) ”)、桃的缩叶病(病原菌为“桃缩叶病菌{Taphrina ofe/h/mms) ”)、灰星病(病原菌为“桃褐腐菌(Monilinia />Y/c(ico7a) ”、“苹果褐腐菌(Monilinia fructigenay,)星病(病原菌为“嗜果枝孢霉{Cleidosporium carmphiluniY")、褐腐病(病原菌为“拟茎点霉{Phomopsis sp.) ”)、黄桃的灰星病(病原菌为“桃褐腐病菌(Monilinia fructicola) ”、“苹果褐腐菌(Monilinia fructigena) ”)、幼果菌核病(病原菌为“ (Moniliniakusanoi) ”)、梅子的黑星病(病原菌为“嗜果枝孢菌{Cladosporium carpophilum) ”)、葡萄的黑痘病(病原菌为“葡萄黑痘病菌msinoe ampema)”)、晚腐病(病原菌为“尖孢炭疽菌{Colletotrichum”、“杉木炭疽病菌{Glomerella”)、褐斑
病(病原菌为“葡萄拟尾孢菌(Pseudocercospora”)、蔓割病(病原菌为“拟茎点
霉病菌(Phomopsis”)、柿的角斑落叶病(病原菌为“柿角斑病菌{Cercospora
”)、圆星落叶病(病原菌为“柿叶球腔菌iMycosphaerella flawae) ”)、茶的轮斑病(病原菌为 “”、“茶轮斑病菌 iPestalotiopsis theae) ”)、
揭色圆星病(病原菌为 “ {Pseudocercospora ocellata) ”、“ {Cercospora chaae) ”)、茶饼病(病原菌为“坏损外担菌iBxdmsidium J^raz7lS) ”)、茶网饼病(病原菌为“网状外担菌Qixobasi di um re ti cula turn) ”)、瓜类的蔓枯病(病原菌为“蔓枯病菌 iMycosphaerellame1nis) ”)、蔓割病(病原菌为“尖孢镰刀菌iFusarium oxysporum) ”)、黑星病(病原菌为“黄瓜黑星病菌{Cladosporium cucumerinum) ”)、褐斑病(病原菌为“多主棒孢菌{pjrynespora cassiicola) ”)、西红柿的叶霉病(病原菌为“番爺叶霉病菌{Fulvia/Wra)”)、轮纹病(病原菌为“番茄早疫病菌{AltGnrnvia茄子的褐纹
病(病原菌为“茄褐纹病菌iPhomo`psis vexans) ”)、煤霉病(病原菌为“灰毛茄菌绒孢菌(Mycovollosiollei”)、十字花科野菜的白点病(病原菌为“大孢白锈菌
(Albugo ?acras77ora) ”)、白斑病(病原菌为“白斑病菌{Cercosporella brassicae)”、“芸苔假小尾孢{Pseudocercosporella”)、洋葱的灰色腐败病(病原菌为“葱
腐葡萄孢切。trytis allii) ”)、草莓蛇眼病(病原菌为“草莓球腔菌(Mycosphaerella/ragariae) ”)、马铃薯的夏疫病(病原菌为“马铃薯早疫病菌iAltorrmri3 solanf)”、、欠豆的茎疫病(病原菌为“大豆疫霉菌iPhytophthora”)、紫斑病(病原菌为“大豆
紫斑病菌{Cercospora AitocAii) ”)、赤豆的莖疫病(病原菌为“紅豆疫霉iphytophthora”)、落花生的褐斑病(病原菌为“落花生球腔菌(Mycosphaerella arachidis)”)、甜菜的褐斑病(病原菌为“甜菜褐斑病菌{Cercospora知(icoh) ”)、叶腐病(病原菌为“水稻纹枯病菌iJhanatephorus”)、矮草的弯孢霉叶枯病(病原菌为“弯孢
菌 iCurvularia 菌)”)、银圆斑病(病原菌为“核盘菌{Sclerotinia homoeocarpa) ”)、螺孢属叶枯病(病原菌为“旋孢腔菌菌)”)、蔷薇的黑星病(病原菌为“蔷薇双壳菌(Piplocarpon rosae) ”)、菊花的白锈病(病原菌为“堀氏菊柄锈菌{Pucciniahoriana) ”)、各种作物的霜霉病(病原菌为“霜霉病菌iPeronospora菌)”、“假双霉属菌iPseudoperonospora 菌)”、“单轴霉属菌 QjIasmopara 菌)”、“盘梗霉属菌(Bremia 菌)”)、疫病(病原菌为“疫霉菌(Phytophthora菌)”)、白粉病(病原菌为“白粉菌{Erysiphe菌)”、“布氏白粉菌属菌Qilumeria菌)”、“单丝壳属菌{Sphaerotheca菌)”、“叉丝单囊壳属{Podosphaera 菌)”、“球针壳属菌(Phyllactinia 菌)”、“钩丝壳属菌 Wncinula 菌)”、“拟粉孢属菌{Oidiopsis菌)”)、锈病(病原菌为“柄锈菌属菌iPuccinia菌)”、“单孢锈菌属菌Wromyces菌)”、“锈菌iPhysopella菌)”)、黑斑病(病原菌为“链格孢属菌(AlternariaMy,)、灰霉病(病原菌为“灰霉菌lBotrytis cinerea)，，)、菌核病(病原菌为“菌盘菌{Sclerotinia”)、白纹羽病(病原菌为“褐座坚壳菌{RoselIinia
necatrix)，，)、紫纹羽病(病原菌为“桑卷担菌iBelicobasidium mompa)，，)、白絹病(病原菌为“白絹病菌ISclerotium rWAii) ”)、其他各种土壤病害(病原菌为“镰刀菌(Fusarium菌)”、“丝核菌{Rhizoctonia 菌)”、“腐霉菌{Pythium 菌)”、“丝囊霉菌{Aphanomyces 菌)”、“茎点霉菌{Phoma 菌)”、“轮枝菌{VerticilIium 菌)”、“芸蓝根肿菌(Plasmodiophorabrassicae)，，等)。
实施例
[0071]下面，利用实施例来更详细地说明本发明，但本发明的技术范围并不限于下述实施例。
[0072]〔实施例1〕
在本实施例中，根据国际公开W0/2009/093409号公报中公开的方法，分离鉴定内含新型真菌病毒的水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株。具体而言，分别培养本实施例中分离鉴定的水稻稻瘟病菌S-0412-1I 2a株和国际公开W0/2009/093409号公报中鉴定的内含真菌病毒的水稻稻瘟病菌S-0412-1I Ia株，观察集落。在这些水稻稻瘟病菌的培养中使用PDA培
养基。结果见图1。
[0073]如图1所示，本实施例中鉴定的水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株显示出白化的菌丛，观察到生长抑制。另外，还完全观察不到分生孢子形成。另外，水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株不同于水稻稻瘟病菌株S-0412-1I Ia株，其在PDA培养基上形成了集落，该集落的特征在于:不会发生色素沉着(黑色素化)，显示出气生菌丝的生长抑制、湿化等异常的生长不良。
[0074]另外，制作上述水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株和水稻稻瘟病菌株S-0412-1IIa株的病毒治愈株，同样进行集落观察。结果见图2。需要说明的是，病毒的治愈方法根据国际公开W0/2009/093409号公报中公开的方法来进行。如图2所示，两个菌株均通过病毒治愈而形成了与普通的稻瘟病菌相同的集落。
[0075]而且，比较水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株和水稻稻瘟病菌株S-0412-1I Ia株以及它们的病毒治愈株的生长速度。作为比较的方法，测定从培养基的中心到菌丝顶端的距离。需要说明的是，所有菌株的生长条件如下:使用PDA培养基，以明期12小时和暗期12小时作为循环，培养天数为9天。结果见图3A和3B。图3A是水稻稻瘟病菌株S-0412-1I2a株及其病毒治愈株的测定结果。图3B是水稻稻瘟病菌株S-0412-1I Ia株及其病毒治愈株的测定结果。如图3A和3B所示，关于水稻稻瘟病菌株S-0412-1I Ia株，即使通过病毒治愈，在生长速度上也没有发现显著的差异，但在水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株中，生长速度存在显著的差异，可知病毒感染株的生长速度降低。
[0076]由上述图1和图2的结果可知:两菌株均因内含真菌病毒而出现生长抑制。另外，如图3所示，在本实施例中，与水稻稻瘟病菌株S-0412-1I Ia株中内含的真菌病毒(MoCVl)相比，水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株中内含的真菌病毒对水稻稻瘟病菌具有更强效的生长抑制能力。
[0077]将本实施例中分离鉴定的水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株中内含的真菌病毒命名为MoCV3。结论是:该MoCV3是水稻稻瘟病菌的强效的生长抑制因子(减毒因子)。
[0078]〔实施例2〕
在本实施例中，研究实施例1中分离鉴定的水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株中内含的MoCV3是否还存在于菌体外。
[0079]在实施例1中在2.8~3.6kb检测到五种成分的内源性双链RNA的谱带的菌株中，将3株移植到液体培养基中进行培养，之后将培养液离心，回收其培养上清。接下来，将所得的培养上清在1%琼脂糖凝胶中、20V下电泳18小时，用溴化乙锭进行染色。
[0080]其结果，在上述菌株的培养上清中，在与菌内源性双链RNA相同的位置也检测到双链RNA的谱带。该结果显示:本发明的真菌病毒不仅存在于水稻稻瘟病菌的菌体内还存在于菌体外。
[0081] 〔实施例3〕
在本实施例中，研究存在于菌体外的真菌病毒MoCV3是否具有对正常菌株(未保有真菌病毒的菌株)感染能力。
[0082]首先，将水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株移植到液体培养基中，培养4周后，将培养液离心，回收其培养上清。对于该培养上清，按照与实施例2相同的步骤，在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，结果可以确认到双链RNA的谱带。对于所得的培养上清，使用0.22 y L的滤器进行过滤灭菌。
[0083]接下来，将50ml YG培养基装入100ml的烧瓶(Kolben)中，在其中接种水稻稻瘟病菌的正常菌株(未保有真菌病毒的菌株)，培养3天后，添加500 u L所得的培养上清，观察菌体的生长。
[0084]其结果，在观察的第3天，在没有添加培养上清的菌株中，菌丝的顶端笔直地伸展，显示出正常的生长，相对于此，在添加了培养上清的菌株中，菌丝的顶端不太伸展，形成缠绕状态。
[0085]认为该结果是由于:存在于培养上清中的真菌病毒感染了水稻稻瘟病菌正常菌株，抑制了其生长的缘故。即，本实验结果显示:存在于菌体外的真菌病毒具有对正常菌株的感染能力。
[0086]〔实施例4〕
在本实施例中，对于感染了真菌病毒的水稻稻瘟病菌株，测定其分生孢子数。
[0087]将水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株移植到YG板上，培养两周后，用直径为4mm的打孔器(cork ball)选取、采集菌体。接下来,在1.5ml试管中加入5%的甘油,再加入采集的菌体，混和5分钟使其悬浮。然后，使用血细胞计算盘测量悬浮液中存在的分生孢子数。
[0088]其结果，在水稻稻瘟病菌的正常菌株(对照，未保有真菌病毒的菌株)中，分生孢子数为33X IO4个/mL，相对于此，在水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株中，分生孢子数为
IX104f/mL 以下。
[0089]该结果显示:本发明的真菌病毒抑制宿主菌的分生孢子形成。即，MoCV3抑制植物病害菌的增殖，同时还可以抑制其传播、感染扩大等。
[0090]〔实施例5〕
在本实施例中，分析从水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株中提取的双链RNA的核苷酸序列。来自水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株的双链RNA的提取、纯化、以所得的双链RNA为模板的cDNA的合成、接着利用5’ RACE法进行的两末端序列的分析，均按照国际公开W0/2009/093409号公报中公开的方法来进行。
[0091]其结果，明确了 MoCV3中包含五种双链RNA。这五种双链RNA的核苷酸序列见SEQID NO:1~SEQ ID NO: 5。需要说明的是，为了将双链RNA取代成cDNA进行序列测定，在序列表中“尿嘧啶”被取代成“胸腺嘧啶”。
[0092]需要说明的是，对所得的核苷酸序列进行分析，其结果，在SEQ ID NO:1所示的RNA序列中，不包含存在于全病毒及其近缘病毒等中的RdRp (RNA依赖性RNA合成酶)的保守基序。另外，在SEQ ID NO: 4所示的RNA序列中，包含与法兰西病病毒的L3双链RNA片段具有同源性的区域。
[0093]该结果显示:本发明的五种双链RNA是新型真菌病毒的基因信息。
[0094]〔实施例6〕
在本实施例中，利用喷雾接种法研究水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株对植物病害真菌的防治是否有效。
[0095]将水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株接种在燕麦培养基板上，在25°C的室内培养。接种后第15天，在分生孢子没有充分形成的情况下，向板上注入2mL左右的灭菌蒸馏水，用笔蹭(C + c 7:)培养基表`面，去除气生菌丝，将该板在不可见光下放置3天，诱导分生孢子形成，再注入ImL左右的灭菌蒸馏水，再次用笔蹭培养基表面，连气生菌丝一起回收分生孢子，得到分生孢子含有液。接种后第15天，在分生孢子没有充分形成的情况下，向板上注入2mL左右的灭菌蒸馏水，用笔蹭培养基表面，连气生菌丝一起回收分生孢子，得到分生孢子含有液。另外，作为对照，按照与实施例1相同的步骤制作水稻稻瘟病菌的真菌病毒完全治愈株，按照相同的步骤由该菌得到分生孢子含有液。
[0096]接下来,用Kimwipe或纱布过滤上述的分生孢子含有液,将分生孢子浓度调节至
2X IO6个/mL，再加入0.02%(v/v)的吐温20，制成分生孢子悬浮液。
[0097]接下来，使用喷嘴向水稻苗(考虑到稻瘟病真性抵抗性基因型和菌的种族(race)而适当选择的品种，接种后第2~3周的水稻苗)均匀地喷洒分生孢子悬浮液，将植物体在26°C、相对湿度为100%的接种箱中静置24小时，之后将容器移到温室中，维持室温在23~300C，喷雾接种后培养7天。然后，在喷雾接种后第7天，测量每个一定叶面积上的达到3~4mm的罹病性病斑的数目。
[0098]结果见图4。图4是显示接种了水稻稻瘟病菌的叶上的病斑数的柱形图。图中，纵轴表示接种了水稻稻瘟病菌的叶上的病斑数。图中，“混合感染株”表示喷洒由感染了本发明的真菌病毒的水稻稻瘟病菌制备的分生孢子悬浮液时的病斑数，“完全治愈株”表示喷洒由水稻稻瘟病菌的真菌病毒完全治愈株制备的分生孢子悬浮液时的病斑数(对照)。
[0099]如图4所示，喷洒由感染了本发明的真菌病毒的水稻稻瘟病菌制备的分生孢子悬浮液时，与对照相比，病斑数明显减少。该结果显示:水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株对植物病害真菌的防治有效。[0100]〔实施例7〕
在本实施例中，通过冲孔带伤接种法(付傷接種法)研究水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株对植物病害真菌的防治是否有效。
[0101]按照与实施例6相同的步骤制备分生孢子悬浮液，使该悬浮液附着在3%普通琼脂膜上，切下边长为约2mm的正方形琼脂膜，制作琼脂片。使用接种用冲头剪下在23~30°C的温室中栽培的水稻的第4片叶，造成浸润状的伤，将琼脂片放在其带伤部分，将植物体在26°C、相对湿度为100%的接种箱中静置24小时，之后将箱(pot)移到温室中，维持室温在23~30°C，接种后培养14天。然后，在接种后第14天测量病斑的大小。
[0102]其结果，接种由水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株制备的分生孢子悬浮液时，与对照相比，病斑的大小明显小。该结果显示:与实施例6 —样，本发明对植物病害真菌的防治有效。
[0103]〔实施例8〕
在本实施例中，通过电子显微镜鉴定存在于菌体外的MoCV3颗粒。在这之前，与公开的方法一样，对MoCV3的病毒颗粒进行生化学特性分析。其结果，通过SDS-PAGE明确了病毒蛋白的主要成分(外皮蛋白)的分子量为约70kDa的大小。即，可以确认MoCV3颗粒的存在。
[0104]在电子显微镜观察中，首先，在YG培养基(0.5%的酵母提取物，2%的葡萄糖)中培养水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株，从其培养上清中分离病毒颗粒。将该培养上清离心(10，000 X g、5分钟)，再将该上清超离心(100，000 X g、30分钟)，得到包含病毒颗粒的沉淀物。将该沉淀物溶解在0.05M的磷酸缓冲液(pH7.0)中，使用磷钨酸或乙酸铀进行负染色，在电子显微镜(倍率:X 20，000~40，000)下观察。
[0105]结果见图5。图5是由水稻稻瘟病菌株S-0412-1I 2a株的培养上清得到的病毒颗粒的电子显微镜照片。如图5所示，利用电子显微镜可以鉴定本发明的真菌病毒的病毒颗粒。该病毒颗粒呈边长为约30~40nm的正六边形形状,包含在被膜样(envelope-like)的结构中。
[0106]〔实施例9〕
在本实施例中，将所分尚的MoCV3作为散布剂直接散布在水稻叶上,研究其对水稻稻瘟病菌的防治效果和治愈效果。
[0107]具体而言，准备将存在于培养上清中的MoCV3适度稀释而得到的病毒溶液(原液的10倍~100倍左右)作为病毒喷雾液。接下来，对从发芽起经过2周~3周的水稻苗喷洒稀释了的来自培养上清的病毒溶液后，接下来使其感染水稻稻瘟病菌，然后算出各试验区的防治效力。按照与用于特定防治物资(特定农药)指定的评价有关的准则，以防治效力=100 —(处理区的被害/未处理区的被害)XlOO的形式算出防治效力。
[0108]其结果，使用MoCV3作为病毒散布剂时，得到了 63.6以上的防治效力的结果。另外，利用相同的方法，计算国际公开W0/2009/093409号公报中公开的MoCVl的防治效力时，防治效力为56.8。由该结果可知:与以往公知的真菌病毒相比，水稻稻瘟病菌株S-0412-1I2a株中内含的MoCV3对水稻稻瘟病菌的防治效果、或者由治愈效果产生的水稻稻瘟病菌的防治效果极其优异。
[0109]〔实施例10〕在本实施例中，研究酵母细胞内的MoCV3病毒颗粒的重建。即，为了在面包酵母(酿酒酵母cerevisiae))的细胞内重建MoCV3病毒,制作以MoCV3所具有的五个dsRNA基因组为模板的完全长cDNA克隆，分别与具有五种标记基因的穿梭载体(以下参照)连接，使MoCV3基因产物在面包酵母细胞内表达，进行MoCV3病毒颗粒的重建。
[0110]<酵母基因表达用穿梭载体的构建>
作为基本载体的 pRS313、pRS314、pRS315、pRS316 从 National BioResource (http://yeast, lab.nig.ac.jp/nig/index, html)购入，pRS317、pRS412、pRS423、pRS424、pRS425、pRS426 从 ATCC (http://www.atcc.0rg/)购入。[0111]使用BamHI从pAUR123 (TaKaRa Bio公司制)中切出ADHl (醇脱氢酶I)组件(cassette) (ADH1启动子+MCS+ADH1终止子)，将其亚克隆到pUC19中。为了构建TDH3(甘油醒_3_磷酸脱氢酶)组件,通过以面包酵母株W303-1A (Mat a ura3 leu2 his3 trplade2 can I)的基因组DNA为模板的PCR，亚克隆在TDH3上游600bp的3’侧添加有MCS (多克隆位点)的二分之一的扩增产物、和在TDH3下游350bp的5’侧添加有MCS的剩下的二分之一的扩增产物。连接所得的两个结构物，使形成TDH3上游600bp+MCS+TDH3下游350bp，作为TDH3组件。
[0112]除去上述基本载体的MCS，在该位点重新插入ADHl组件或TDH3组件。将插入了ADHl 的 pRS313、pRS314、pRS315、pRS316 和 pRS317 分别作为 pRSA313、pRSA314、pRSA315、PRSA316 和 pRSA317。将插入了 TDH3 的 pRS313、pRS314、pRS315、pRS316、pRS317、pRS423、pRS424、pRS425 和 pRS426 分别作为 pRST313、pRST314、pRST315、pRST316、pRST317、PRST423、pRST424、pRST425 和 pRST426。
[0113]<表达来自 MoCV3 的基因(dsRNAl、dsRNA2、dsRNA3、dsRNA4 和 dsRNA5)的穿梭载体结构物的制作>
以 MoCV3 全长 cDNA 克隆 dsRNAl、dsRNA2、dsRNA3、dsRNA4 和 dsRNA5 为模板，通过 PCR扩增全长序列。将所得的DNA片段亚克隆到pUC19中，之后进行序列分析，筛选正确的克隆(图6)。使用限制酶从所得的克隆中切出目标区域，进行纯化，之后插入到上述的穿梭载体中。最后，根据序列测定确认插入序列及其周边序列是否有变化。
[0114]< MoCV3 全长 cDNA 的制作>
<dsRNAl >
以通过天然的PAGE分离成各区段(成分r i )的dsRNAl或纯化MoCV3 dsRNA为模板进行RT-PCR，得到全长的DNA片段。在溶解于蒸馏水中的模板双链RNA (约50ng-100ng)中加入各 20pmol 的 dsRNAl 特异性引物(MoCV3-cDNA-dsRNAl-5end_SmaI和MoCV3-cDNA-dsRNAl-3end-XbaI)，在98°C下温育5分钟，之后在冰上骤冷3分钟。之后，在40ii I的反应系统中，在IX第一链合成缓冲液(IXfirst strand synthesisbuffer) (invitrogen 公司制)、lmM 的 CH3Hg0H、10mM 的 DDT、ImM 的 dNTPmix、40U 的RNase OUT Recombinant (invitrogen 公司制)、200U 的 Super Script III 逆转录酶的条件下，在42°C下温育30分钟，之后在70°C下温育15分钟，然后添加5U的RNase H。在37 °C下温育10分钟、之后在70 °C下温育15分钟后，使用QIA快速PCR纯化试剂盒(QIAquick PCR Purification Kit) (QIAGEN 公司制)纯化、浓缩 cDNA。以该 cDNA 溶液为模板，在PCR中使用2U的Pfu-x (Greiner公司制)和其所附带的缓冲液、磷酸化引物(MoCV3-cDNA-dsRNAl-5end-SmaI:GCC CCG GGG CAA AM AGA GM TAA AGC TTT CTC C (SEQID NO: 11)和 MoCV3-cDNA-dsRNAl-3end-XbaI:GTT CTA GAG GTA CTT ACA CCT CAC AGCGTA AGA A (SEQ ID NO: 12))。反应条件如下:在95°C下反应2分钟后，以95°C下30秒、55°C下30秒和68°C下3分30秒作为I个循环，进行30个循环，之后在68°C下反应7分钟。琼脂糖凝胶电泳后，从凝胶中提取、纯化目标cDNA扩增片段，使用DNA连接试剂盒第
2.1 版(DNA Ligation kit Ver.2.1) (TaKaRa Bio 公司制)，将其插入到质粒载体 pUC19DNA SmaI (MBI Fermentas公司制)中。根据序列测定获得通过青白筛选得到的克隆的插入片段的全长序列，选择与MoCV3 dsRNA I的序列完全一致的克隆。
[0115]< dsRNA2 >
使用 dsRNA2 特异性引物(MoCV3-cDNA-dsRNA2-5end-SacI: GCG AGC TCG CAA AAA AGAGAA TAA AGC ATT CCC T (SEQ ID NO: 13)和MoCV3-cDNA-dsRNA2-3end_Hpal:GTG TTA ACGGTA CTT ACG TTG TCA CGT AAG AAG T (SEQ ID NO: 14))，按照与 dsRNAl 的全长 cDNA 的制作相同的方法，得到与MoCV13dsRNA 4的序列完全一致的克隆。
[0116]< dsRNA3 >
使用 dsRNA3 特异性引物(MoCV3-cDNA-dsRNA3-5end-Sall:GCG TCG ACG CAA AAA AGAGAA TM AGC TTT CTC C (SEQ ID NO: 15)和MoCV3-cDNA-dsRNA3-3end_Xbal:GTT CTA GAGGTA CTT GTT GGG ACC CTA CGT CCG A (SEQ ID NO: 16))，按照与 dsRNAl 的全长 cDNA 的制作相同的方法，得到与MoCV13dsRNA 4的序列完全一致的克隆。
[0117]< dsRNA4 >
使用 dsRNA4 特异性引物(MoCV3-cDNA-dsRNA4-5end-Sall:GCG TCG ACG CAA AAA AGAGAA TM AGC TTT CTC C (SEQ ID NO: 17)和MoCV3-cDNA-dsRNA4-3end_Xbal:GTT CTA GAGGTA CTT GTT GAA GCC CCA TGC TCA A (SEQ ID NO: 18))，按照与 dsRNAl 的全长 cDNA 的制作相同的方法，得到与MoCV13dsRNA 4的序列完全一致的克隆。
[0118]< dsRNA5 >
使用 dsRNA5 特异性引物(MoCV3-cDNA-dsRNA5-5end-Smal:GCC CCG GGG CAA AAA AGAGAA TM AGC ATT CTC C (SEQ ID NO: 19)和MoCV3-cDNA-dsRNA5-3end_Xbal:GTT CTA GAGGTA CTT ACG TCA TCA CGT AAG AAG T (SEQ ID NO: 20))，按照与 dsRNAl 的全长 cDNA 的制作相同的方法，得到与MoCV13dsRNA 5的序列完全一致的克隆。
[0119]<用质粒DNA转化酵母>
<乙酸锂法>
通过乙酸锂法进行的转化如下进行。首先，将酵母种菌在5ml的液体培养基中，在30°C下进行10~16小时的预培养。培养后，将其种菌在50ml的液体培养基中，使测定吸光度(OD600)时达到OD600=0.1~0.2。在30°C、IOOrpm下培养,直至OD600=0.8,通过离心分离回收细胞，之后用蒸馏水悬浮、清洗。将已沉淀的细胞悬浮于Sol A (0.1M的乙酸锂、IOmM的Tris-HCl pH7.8、lmM的EDTA)中，进行离心分离，向沉淀物中再次加入Sol A进行悬浮，作为酵母溶液。将其在30°C下温育50分钟后，依次加入IOiU进行了热处理的ssDNA (lmg/ml、来自鲑睾丸)、50iil酵母溶液、IOiil穿梭载体、20iil Sol A,750u I 50%的聚乙烯甘油，之后在30°C下温育30分钟，然后在42°C下温育15分钟。离心分离后，向沉淀物中加入蒸馏水，之后涂布在SC琼脂平板培养基(根据穿梭载体的选择标记选择撤除成分培养基)上，在30°C下培养。
[0120]<原生质球法>
通过原生质球法进行的转化如下进行。首先，与上述的乙酸锂法一样，培养、回收酵母细胞，将细胞悬浮在1.2M的山梨醇溶液中，通过离心分离(2500rpm、5分钟)回收细胞。将已沉淀的细胞再次悬浮于1.2M的山梨醇溶液中，添加Zymorase (20TU/10容积量)。在30°C下温育，直至大多数的细胞发生原生质球化。用1.2M的山梨醇溶液清洗细胞3次，之后将其悬浮于STC溶液中。向100 ill该原生质球悬浮液中加入23 u I质粒溶液和I 进行了热处理的ssDNA (I mg/ml、来自鲑睾丸)、4ml PEG溶液，充分混和。静置10分钟后，通过离心分离(1200rpm、5分钟)使原生质球沉淀，将其悬浮于150 U I的SOS溶液中。在30°C下培养I小时后，与5ml的SD山梨醇-低融点琼脂糖溶液混和，涂布在SD山梨醇板上。
[0121]<电穿孔法>
通过电穿孔法进行的转化如下进行。首先，与乙酸锂法一样，培养、回收酵母细胞，通过离心分离回收细胞，之后用蒸馏水进行悬浮、清洗。悬浮于12.5ml的LiAC/DTT/TE溶液中，在室温下静置I小时，之后通过离心分离(6，000rpm、5分钟)使细胞沉淀。将该沉淀用12.5ml的冰冷水悬浮，清洗2次。将细胞悬浮于5ml IM的山梨醇溶液中，通过离心分离(6, 000 rpm、5分钟)使细胞沉淀。将该沉淀悬浮于50 IM的山梨醇溶液中，作为细胞悬浮液。向70 ill细胞悬浮液中加入5 u I质粒溶液，在冰上静置5分钟。将其加入到0.2cm的透明试管中，在1.5kV、25ii FD、200 ohms下进行电穿孔。立即添加Iml IM的山梨醇溶液，涂布在IM的山梨醇板培养基上。
[0122]<通过导入 MoCV3 dsRNAl、dsRNA2、dsRNA3、dsRNA4 和 dsRNA5 在酵母内重建 MoCV3 > 为了制作 pRSAA313-dsRN`Al、pRSA314_dsRNA2、pRSA315_dsRNA3、pRSA316_dsRNA4 和
pRSA317-dsRNA5以表达MoCV3 dsRNAl~5，将按照上述方法制作的从dsRNAl到dsRNA5的完全长cDNA克隆分别与pRSA313、pRSA314、pRSA315、pRSA316、pRSA317的限制酶切位点连接，构建穿梭载体(图7和8)。将dsRNAl的完全长cDNA与pRSA313连接时，使用限制酶切位点SmaI和XbaI (图7a)，将dsRNA2的完全长cDNA与pRSA314连接时，使用限制酶切位点SacI和HpaI位点(图7b)，将dsRNA3的完全长cDNA与pRSA315连接时，使用限制酶切位点SalI和XbaI (图7c)，将dsRNA4的完全长cDNA与pRSA316连接时，使用限制酶切位点SalI和XbaI (图8a)，将dsRNA5的完全长cDNA与pRSA317连接时，使用限制酶切位点SmaI和XbaI (图8b)。利用乙酸锂法，将通过连接得到的表达各dsRNAl~dsRNA5基因的穿梭载体导入到面包酵母YPH499株(Mat a ura3 lys2 ade2 leu2 his3 trpl)中。
[0123]将所得的转化集落在微生物培养装置中培养，尝试着进行病毒样颗粒的纯化。使用弗氏压碎器将酵母细胞破碎，之后利用与MoCV3病毒颗粒纯化法相同的方法进行纯化，通过蔗糖浓度梯度离心进行分馏。对于得到的组分，使用抗MoCV3抗血清进行蛋白质印迹分析(图9a)。其结果，在导入了 MoCV3 dsRNAl_5的酵母样品的24%蔗糖浓度附近检测到认为是来自MoCV3蛋白的信号。进行电子显微镜观察时，观察到MoCV3病毒样颗粒(图9b)。
[0124]本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请，直接作为参考而纳入本说明书中。
【权利要求】
1.真菌病毒，其特征在于:具有五种双链RNA，该五种双链RNA中，有四种双链RNA分别相对于SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列具有81%、75%、72%和73%以上的同源性。
2.权利要求1所述的真菌病毒，其特征在于:该五种双链RNA分别是包含SEQID NO:1~SEQ ID NO: 5所不的核苷酸序列的多核苷酸。
3.植物病害真菌，其中，权利要求1或2所示的真菌病毒感染宿主。
4.权利要求3所述的植物病害真菌，其特征在于:上述宿主是水稻稻瘟病菌。
5.植物病害防治剂，其中包含权利要求1或2所述的真菌病毒或权利要求3或4所述的植物病害真菌。
6.植物病害真菌防治方法，该方法包括:使权利要求5所述的植物病害防治剂与植物接触的步骤。
7.植物病害真菌减毒方法，该方法包括:使权利要求1或2所述的真菌病毒感染植物病害真菌的步骤。
8.权利要求7所述的植物病害真菌减毒方法，其特征在于:上述植物病害真菌是水稻稻瘟病菌。`
【文档编号】C12N7/00GK103492556SQ201280010278
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年2月24日 优先权日:2011年2月24日
【发明者】森山裕充, 福原敏行, 有江力, 寺冈彻 申请人:国立大学法人东京农工大学