Maldi质谱分析用的试样架及质谱分析方法

专利名称：Maldi质谱分析用的试样架及质谱分析方法
技术领域：
本发明涉及一种使用基质辅助激光解吸离子化质谱分析法(MALDI—MS : Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-MassSpectrometry)实施质语分析用的作为激光吸收基质使用无机微粒的试样架及使用该试样架的质镨分析方法。在本说明书中，将使用基质辅助激光解吸离子化质i普分析法进行的质谱分析称为"MALDI质谱分析"。
背景技术：
在作为有机化学中重要的分析方法的质谱分析法中，通常是通过某种方法将对象物质离子化，利用质量电荷比(m/z)的差异并使用TOF装置将该离子分离，进行检测。在MALDI质谱分析法中，通过将有机低分子离子化辅助剂(基质剂)混合在测定试样中并对局部照射激光(例如337nrn),使基质剂吸收激光，只在照射部位产生急剧的温度上升，可以不分解试样分子而进行软电离化。该方法作为测定蛋白质及合成高分子等化合物的方法在医药、临床、食品、高分子材料、环境领域得到广泛应用。
在MALDI质谱分析法中所使用的基质(在本说明书中称为"激光吸收基质")大致分为以下几种。
(a)拥有双键及芳香环作为官能团的有机基质(b )使用无机微粒的无机基质
在使用上述(a)的有机基质的方法中，重要的是，分析前对每个样品 一一检查最佳的条件(添加在试样中的有机基质和溶剂的种类、它们的混合比、试样和基质的混合晶的结晶状态等)。虽然如此，但有时存在有机基质和有机化合物试样的化学反应的问题。特别是必须考虑激光照射情况下的反应。另外，由于有机基质其自身因激光照射而发生离子化、分解，因而多发生因此造成的干扰离子峰。因此，在
使用有机基质的MALDI质镨分析中存在特别是分子量比较小的有机化合物难以分析这一本质性的问题。
在使用上述(b)的微粒无机基质的方法中，公知有将丙三醇等高粘度液体包覆于无机微粒(例如Co微粒)上的悬浮体和试样物质进行混合而使用的方法(专利文献1)。在这样使用无机微粒时，通常由于试样分子牢固地吸附于(多点吸附)无机微粒，因而在照射激光的情况下造成难以产生试样分子的解吸，从而难以进行高精度的质语分析。另外，除一部分贵金属之外的过渡性金属的无机微粒易被空气氧化而使表面状态发生变化，因此，难以照原样用于质谱分析。这一点在使用由上述的丙三醇等高粘度液体粘附的方法时，成为试样分子在覆盖无机微粒的高粘性液体中游离的状态，通过激光照射进行了离子化的试样分子能够容易地从基质解吸。另外，由于高粘度液体成为保护剂，因而还可防止使用金属微粒的情况下的空气氧化。但是，在质谱分析装置中，由于离子源部处于高真空下，因而造成因丙三醇等保护剂而引起的装置的污染的问题。因此，现状是该方法现在几乎不能使用。
另外，还提出了一种对氧化硅粒子进行表面处理而在表面形成官能团，将此作为基质使用的方法(专利文献2)。但是，该方法中必须根据分析对象即试样物质实施合适的表面处理准备，从而操作烦杂。另外，有时因表面处理而吸附的物质成为干扰离子峰的原因。
此外，尽管也提出了将一些金属纳米粒子作为基质，但在制作金属纳米粒子时所添加的还原剂及纳米粒子的表面保护剂往往成为干扰离子峰的原因，从而仍难以进行低分子量有机化合物的分析。
另一方面，公知有一种DI0S法，其将载有试样物质的基板自身用于激光吸收离子化介质，并使用具有数十纳米的微细的细孔结构的多孔表面基板(非专利文献1 )。其中，使用多孔质硅的DI0S法在分子量1000以下的测定区域的由激光吸收离子化介质带来的干扰离子峰少，已经供实际应用。但是，硅表面易被空气氧化因而存在离子化效 率明显降低的耐久性的课题。
需要指出，在DI0S法中，由于既难以再现性良好地制作具有同样 的多孔质结构的试样基板，又不容易清洗测定后的多孔质基板，所以， 存在不太适合重复测定的问题。因此，专利文献3中，通过将具有高 效率地吸收激光的性质的晶体元件(热电性元件及铁电元件)用作试 样基板，试图解决DI0S法的此类问题。但是，在该方法中，必须预备 特殊的试样基板，不能使用市场销售的MALDI质镨分析用的试样基板 (SiC基板等)。因此，现状是缺乏通用性，且测定成本高。
专利文献l:特开昭62 - 43562号公报
专利文献2:特表2005 - 502050号公报
专利文献3:特开2006 - 201042号公报
非专利文献 1: Wei， J.; Buriak， J.M. ; Siuzdak， G. Nature 1999， 399， 243-
发明内容
如上所述，在现有的MALDI质谱分析法中，干扰离子峰少、可高 精度地分析低分子量有机化合物的通用性高的简便方法尚未确立。
本发明是鉴于这样的现状而完成的，其目的在于提供一种MALDI 质语分析技术，在将不需要使用特殊材料作为试样基板的以无机微粒 作为基质的方法中，不夹杂成为干扰离子峰原因的物质，而将试样物 质直接保持于基质粒子，可精度良好地进行分析。
本发明人进行各种研究的结果是，发现通过将作为Cu0纳米粒子 的集合体的氧化铜粉末作为激光吸收基质使用，可极为简便地进行高 分析精度的MALDI质谱分析。
即，在本发明中，提供一种MALDI质谱分析用的试样架，所述试 样架具有CuO二次粒子作为激光吸收基质，所述二次粒子由平均粒径 100nm以下的Cu0 —次粒子集合而成，并具有由构成最表层的一次粒 子的形状所引起的凹凸表面。在此，试样架在保持分析试样的状态下装填于MALDI分析装置 中，其构成要素至少包含导电性基板(例如不锈钢基板)、载持于 该基板上的Cu0二次粒子。在此， 一次粒子的平均粒径通过下述方法 决定，用场致发射型扫描电子显微镜(FE - SEM)对Cu0 —次粒子进行 观察，在该FE-SEM图像中随机选择200个以上的粒子(但是，要除 去不能掌握粒子整体形状的粒子)，测定显示于该图像上的各粒子最 长部分的长度(长径)，求出其平均值。
所述CuO 二次粒子的来源可以为，将在对碳酸氢铵水溶液和硝酸 铜水溶液进行混合的工序中所生成的碱式碳酸铜，通过在200 ~ 300°C 下进行大气烧结而合成的CuO粉末。CuO 二次粒子的平均粒径例如为 0. 3~ lOiam。 二次粒子的平均粒径可对在用于试样架的状态下适当粉 碎的CuO粉末使用激光衍射型粒度分布测定装置求得。
另外，本发明提供一种质谱分析方法，作为利用所述试样架的 MALDI质谱分析的方法，包括将由平均粒径100nm以下的CuO —次 粒子集合而成的二次粒子即具有由构成最表层的一次粒子的形状所引 起的凹凸表面的CuO二次粒子分散于液状介质中的工序；通过在将该 分散液涂敷于MALDI质谱分析用的试样基板上之后使其干燥，得到载 持有所述CuO 二次粒子的试样架的工序；通过在将溶解有作为分析对 象的有机化合物(试样物质)的试样溶液涂敷于所述试样架的CuO二 次粒子载持部位之后使其干燥，将试样物质粘附于CuO上的工序；通 过在将该试样架设置于MALDI质i瞽分析装置中之后照射脉冲激光，使 CuO 二次粒子作为激光吸收基质发挥功能，对试样物质进行离子化的 工序。在作为试样物质以分子量为100~ 5000、优选200 ~ 5000左右 的有机化合物为对象的情况下，可进行特别良好的分析。
根据本发明，在MALDI质语分析中得到以下这样的优点。
(1) 由于利用基质粒子表面特殊的凹凸在基质上粘附试样分子， 因而不需要夹杂丙三醇等高粘性介质及具有官能团的物质。因此，基 本上不产生因这些物质造成的干扰离子峰。
(2) 由于通过其特殊的凹凸在易于解吸的状态下粘附试样分子，因而分子量分布的测定精度高。
(3) 由于基质粒子为氧化物，因而其在大气中难以变质(氧化)。 因此，操作性优良，同时，因为不需要保护剂，所以不产生由此引起 的干扰离子峰。
(4) 基质自身的分解峰也几乎没有。
(5) 由于不需要考虑试样物质和基质的反应及混晶的生成，因而 不限试样物质的种类都可通过简单的操作进行分析。即，质镨分析的 快速性及通用性高。
(6 )由于可对分子量1000以下或者不足500的低分子量试样物 质进行精度良好的分析，因而也适用于各种表面活性剂及药剂的分析。 另外，由于即使微量也可得到高的分析精度，因而还有希望应用在人 及家畜的药检(doping test)。


图1是在实施例中所使用的氧化铜粉末粒子的FE-SEM照片； 图2是在实施例中所使用的氧化铜粉末粒子的FE-SEM照片； 图3是在实施例中所使用的氧化铜粉末粒子的FE-SEM照片； 图4是显示通过超声波振动将图1的氧化铜粒子粉碎而得到的 Cu0 二次粒子表面的FE - SEM照片；
图5是在比较例中所使用的氧化铜粉末粒子的FE-SEM照片；
图6是表示实施例1的分析结果的分子量分布语图7是表示比较例1的分析结果的分子量分布谱图8是表示现有例1的分析结果的分子量分布谱图9是表示实施例2的分析结果的分子量分布谱图IO是表示比较例2的分析结果的分子量分布谱图11是表示现有例2的分析结果的分子量分布谱图12是表示实施例3的分析结果的分子量分布谱图13是表示比较例3的分析结果的分子量分布i普图14是表示现有例3的分析结果的分子量分布谱图；图15是表示实施例4的500ng/mL溶液的分析结果的分子量分布 谱图16是表示实施例4的50ng/mL溶液的分析结果的分子量分布 谱图17是表示实施例4的5ng/mL溶液的分析结果的分子量分布谱
图18是表示实施例4的500pg/mL溶液的分析结果的分子量分布 谱图19是表示实施例4的50pg/mL溶液的分析结果的分子量分布 谱图。
具体实施例方式
图1~图3表示可适用于本发明的氧化铜粉末粒子的FE-SEM照 片。图2、图3为用更高倍率观察图l的粒子的照片。该氧化铜粉末 通过下述的"氧化铜粉末的合成例1"而合成。在图1中看到的粉末 粒子的表面性状不是平滑的。其表面如图2、图3所表明，由微细的 纳米粒子构成。调查的结果为，该纳米粒子是由CuO晶体构成的一次 粒子，该粉末粒子是CuO—次粒子的集合体即CuO二次粒子。
在水、乙醇等液状介质中对由该CuO 二次粒子构成的氧化铜粉末 施加超声波振动时，很容易粉碎成一些粒子。图4中例示了用高倍率 观察的在水中施加超声波振动而得到的粉碎粒子的表面的FE - SEM照 片。在制作本发明的MALDI质谱分析用试样架的过程中，使用图l所 示的氧化铜粉末准备CuO粒子的分散液，但此时，如下述的实施例那 样有时进行施加超声波振动的操作。在该情况下，因为产生粒子的粉 碎，所以构成在实施例中制作的试样架的CuO粒子为在图4中看到的 那样的具有由CuO —次粒子的形状所引起的特殊的凹凸表面的二次粒 子。
在构成本发明试样架的CuO二次粒子中，认为这样的特殊的凹凸 表面在提高分子量分布的测定精度方面发挥了很大的作用。虽然其作
8用迄今尚有许多未解释清楚之处，但可考虑如下。
即，如果基质粒子的表面是平滑的，则认为试样分子在所谓的多 点吸附的状态下进行粘附的可能性变高。认为吸附的机理与由配位键
引起的电子授受有关，但是在该情况下，在多点吸附中将在试样分子 多个部位与基质粒子产生配位键。于是，由于未必通过激光照射的加
热在所有的吸附点的化学键同时断开，所以，不发生离子化及从基质
解吸的试样分子的比例增大，这认为是使分子量分布的测定精度下降
的主要原因(参照下述的比较例1、 2)。
与此相对，构成本发明的试样架的Cu0 二次粒子具有上述那样的 特殊的凹凸表面。该情况下，认为试样分子的粘附方式与其说是多点 吸附的程度明显降低，还不如说是在接近单点吸附的状态下粘附于基 质粒子上。其结果是，通过激光照射的加热，稳定且容易引起试样分 子的离子化及从基质的解吸，推测这带来了分子量分布的测定精度的 大幅度提高。
构成本发明中的基质粒子(Cu0 二次粒子)的Cu0 —次粒子以平 均粒径100nm以下的为对象。在一次粒子粒径大于此值时，有可能多 点吸附的程度增加。另外，也考虑到产生粉碎成各个一次粒子的现象， 这样就不能期待接近单点吸附的吸附状态。更优选Cu0 —次粒子的平 均粒径为60nm以下。根据以下述的"氧化铜粉末的合成例1~3"为 基准的方法，可得到一次粒子的平均粒径为10~ 100nm范围的氧化铜 粉末。
作为基质粒子的CuO二次粒子只要具有由上述的FE-SEM照片所 示的那样的一次粒子形状而引起的特殊的凹凸表面，就可使用调整为 各种尺寸的粒子，但在二次粒子的粒径过小时，与一次粒子的粒径差 缩小，也认为不能实现有效的单点吸附的方式。各种研究的结果是， 优选二次粒子的平均粒径为0. 3um以上。另外，由于过于粗大的二次 粒子易于被粉碎而不稳定，因而优选使用平均粒径大致lOum以下的 二次粒子。根据以下述的"氧化铜粉末的合成例1 ~ 3"为基准的方法， 可制作CuO二次粒子的平均粒径1 ~ 10jLim左右的氧化铜粉末。也可以将这样的CuO二次粒子以原有的尺寸用于基质粒子，但是优选使用通 过施加超声波振动而粉碎的更稳定状态的Cu0二次粒子。
本发明的MALDI质镨分析用的试样架例如可按如下制作。 首先，准备包含平均粒径为100nm以下、优选10~60nm的作为 CuO—次粒子的集合体的CuO 二次粒子的氧化铜粉末。由于杂质多时 根据测定条件有时将招致干扰离子峰的发生，因此优选尽可能使用高 纯度的粉末。例如，优选按除去氧的元素含量计，Cu: 97质量％以上、 Fe、 Ni、 Al、 Si分别为10ppm以下的高纯度氧化铜粉末。这样的氧化 铜粉末的合成例如可使用特开2005 - 372946号公报公开的方法进行。 具体而言，可采用以下述的"氧化铜粉末的合成例1~ 3"为基准的方 法。
然后，制作使该氧化铜粉末分散于液状介质中的分散液(以下有 时称为"基质分散液")。作为液状介质可使用水及醇等。在分散液 制作阶段，优选施加超声波振动。由这样合成的状态下的Cu0的二次 粒子被粉碎成某种程度的小的二次粒子，成为更稳定的状态。
通过滴注等将基质分散液涂敷于MALDI质谱分析用的试样基板 (例如具有导电性的SiC基板)上。然后使液体干燥。由此，构筑成 具有载持有Cu0 二次粒子作为激光照射基质的试样基板的试样架。
作为试样物质，以各种有机化合物为对象，但是特别是在分子量 为5000以下的区域可进行噪声更小的的清晰的分析，使用本发明的效 果大。另外，本发明的方法还适用于对分子量1000以下或者小于500
的低分子量的表面活性剂及药剂等进行分析的情况。即，在分子量为 100~ 5000左右的有机化合物的分析中，本发明发挥出了特别优良的 效果。
在分析时，将溶解有作为分析对象的有机化合物(试样物质)的 试样溶液通过滴注等涂敷于上述试样架的CuO 二次粒子载持部位之 后，使其干燥。由此，将试样物质粘附于作为基质的Cu0二次粒子上。 试样溶液优选使用水作为溶剂，但是在试样不溶于水的情况下酌情使 用有机溶剂。但是，至为重要的是选择与试样物质没有反应性且在质谦分析中容易进行峰分离的液状介质。在试样为中性物质的情况下，
作为离子化剂优选添加少量的Na0等。在使用本发明的试样架的情况 下，基质为CuO,且该基质没有夹杂特别的物质，因此，几乎不用考 虑试样物质和基质的反应性，从而可以以更多的试样为对象通过同样 的操作进行分析。
在将这样操作使试样物质得以保持的试样架设置于MALDI质镨分 析装置中之后，照射脉冲激光，由此，使CuO二次粒子作为激光吸收 基质发挥作用，可使试样物质高效地离子化、并使其解吸。 (氧化铜粉末的合成例1 )
准备纯度为99. 9%以上的硝酸铜水合物(Cu (NH3) 2 nH20)和纯 度95%以上的碳酸氩铵(NH4HC03)。
将硝酸铜20kg投进内容量为60L的罐中，加入导电率为liaS的 纯水35L，用搅拌机搅拌10分钟使其溶解，制成Cu浓度为162g/L 的硝酸铜水溶液。将此时的溶解温度设为20°C。
另一方面，在内容量为200L的罐中投入碳酸氢铵15kg,加入导 电率为1 jaS的纯水150L，之后使用搅拌机使其溶解，制成浓度为100g /L的碳酸氢铵水溶液。此时，将溶解温度设为151C时，在搅拌时间 60分钟内碳酸氢铵完全溶解。
对该溶解后的碳酸氩铵水溶液进行搅拌，并向其按3L/min的速 度连续添加上述硝酸铜水溶液进行中和反应。此时，使用3片、l段 桨叶的搅拌机，将其设置于距该200L罐的底部中心7cm的位置。另外， 将搅拌机的转速设为150rpm。
用20分钟生成核完成反应，得到浆状的碱式碳酸铜。此时的反应 液温度为15'C。
将得到的碱式碳酸铜浆料置于上排出式离心分离机内进行固液分 离。而且，将反应液全部进行固液分离后，当不再排出滤液时，从该 上排出式离心分离机投入口加入60'C的温纯水进行50分钟的清洗。 所使用的温纯水量约为1200L。该清洗后的浆状碱式碳酸铜的残留氨 浓度为500ppm。另外，残留氨浓度的分析按如下进行，即，将浆状碱式碳酸铜的 残留氨溶入纯水中，用离子色镨计(,4才净夕义社制)测定该纯水 中的氨浓度。
将这样得到的清洗后的浆状碱式碳酸铜用强制排气式干燥机在
ll(TC的温度下进行17个小时的干燥，得到碱式碳酸铜粒子。用场致 发射型扫描电子显微镜(FE-SEM)对得到的碱式碳酸铜(CuC03 . Cu (OH) 2 nH20)的粒子进行确认时，碱式碳酸铜的一次粒子的平均粒 径约为30nm。另外，用激光衍射型粒度分布测定装置进行确认时，该 碱式碳酸铜的二次粒子为平均粒径2 jam的均勻性高的凝聚体。利用 TEM计算一次粒子的平均粒径的方法如上。另外，二次粒子的平均粒 径是使用WINDOX制造的HELOS&RODOS干式激光衍射型粒度分布测定装 置在分散压3. OObar、吸引压125. OOmbar下测定的值。
接着，将该碱式碳酸铜干燥物细分到IO个左右不锈钢槽，在大气 下用250'C的温度进行10个小时的烧结，得到氧化铜。进行X射线衍 射的结果确认，该氧化铜就是CuO。
对该氧化铜粉末，与上述一样求出一次粒子及二次粒子的平均粒 径时，CuO—次粒子的平均粒径为40nm, 二次粒子的平均粒径为2 p m， 都与烧结前的碱式碳酸铜相同。
另外，进行除去氧的成分元素的分析时，该氧化铜粉末的成分为 Cu"8质量0/。、 Fe<lppm、 Ni < lppm、 Al<10ppm、 Si<10ppm。在此， Fe、 Ni、 Al、 Si的浓度通过ICP分析求出，Cu含量通过插值法求出。
此外，确认了该氧化铜粉末的BET比表面积处于50~70m2/g的 范围。
示于上述的图1 ~ 3的粒子的FE - SEM照片为通过该例制作的氧化 铜粉末粒子的照片。
(氧化铜粉末的合成例2)
除了将温纯水清洗时的纯水温度设为20'C之外，用与上述氧化铜 粉末的合成例1相同的方法制作了氧化铜粉末。作为中间物质的碱式 碳酸铜的残留氨浓度为0.1%。用上述的方法调查平均粒径时，碱式碳酸铜的一次粒子的平均粒径为50nm， 二次粒子是平均粒径为3um的 均匀性高的凝聚体。
得到的氧化铜粉末的CuO—次粒子的平均粒径为30nra， 二次粒子 的平均粒径为3jum，都与烧结前的碱式碳酸铜相同。 (氧化铜粉末的合成例3)
准备与在上述氧化铜粉末的合成例1所使用的相同的硝酸铜和碳 酸氢铵。
将硝酸铜20kg投进内容量为200L的罐中，加入35L导电率为1 U S的纯水，用搅拌机进行10分钟搅拌使其溶解，制成Cu浓度为200g /L的硝酸铜水溶液，将液体温度控制在26'C。
另一方面，在内容量为200L的罐中投入碳酸氢铵15kg,加入导 电率为ljiS的纯水150L，之后用搅拌机使其溶解，制成浓度为100g /L的碳酸氢铵水溶液。此时，将溶解温度设为26'C时，在搅拌时间 60分钟内碳酸氩铵完全溶解。因此，将该碳酸氢铵水溶液的液体温度 一直控制在26'C，并将其作为中和剂。
然后，以将液体温度控制在26。C的碳酸氢铵水溶液为中和剂，向 装有上述硝酸铜水溶液的200L罐使用定量泵一点点连续注入。在该注 入时，以使反应温度达到26°C ( ±1°C)左右的方式，使用温度控制 器调节装有上述硝酸铜水溶液的200L罐内的温度。然后，使用与上述 氧化铜粉末的合成例l相同的搅拌装置，在同样的搅拌条件下对硝酸 铜水溶液进行45分钟中和，得到浆状的碱式碳酸铜。
将得到的碱式多灰酸铜浆料置于上排出式离心分离机内进行固液分 离。然后，将反应液全部进行固液分离后，当不再排出滤液时，从该 上排出式离心分离才几投入口加入20'C的温纯水进行3个小时的清洗。 执行两次这样的清洗操作。所使用的温纯水量约为9000L。该清洗后 的浆状碱式碳酸铜的残留氨浓度为0.6%。分析方法与上述相同。
将这样得到的清洗后的浆状碱式碳酸铜用强制排气式干燥机在 110。C的温度下进行24个小时的干燥，得到碱式碳酸铜粒子。在用上 述的方法对粒径进4亍调查时，该碱式碳酸铜的一次粒子的平均粒径为
1350nm， 二次粒子的粒径在l-10jam的范围内波动。
接着，通过对该碱式碳酸铜干燥物在上述条件下进行大气退火而 得到氧化铜。进行X射线衍射的结果确认，该氧化铜为CuO。
对该氧化铜粉末，与上述一样调查一次粒子及二次粒子的粒径时， CuO —次粒子的平均粒径为60nm，二次粒子的粒径在1 ~ 10jum的范围 内波动，都与烧结前的碱式碳酸铜相同。
另外，进行除去氧的成分元素的分析时，该氧化铜粉末的成分为 Cu>97质量％、 Fe<lppm、 Ni < lppm、 Al<10ppm、 Si<10ppm、 C为 0. 5%。
此外，确认该氧化铜粉末的BET比表面积处于40~50m7g的范围。
实施例 (实施例1 ) (试样溶液的调制)
以试剂聚乙二醇(PEG 1000 )为分析对象。取10g PEG 1000，将 其加入lmL蒸馏水中后，施加15分钟超声波振动使其完全溶解。其后， 稀释至10倍，得到浓度为lmg/mL的聚乙二醇溶液。
另一方面，使用Nal作为离子化剂。取10g Nal,将其加入lmL 蒸馏水中使其完全溶解。其后，稀释至10倍，得到浓度为lmg/mL 的Nal溶液。
将上述同浓度的聚乙二醇溶液和Nal溶液按体积比计，以"聚乙 二醇溶液""NaI溶液"=5: 1的比例进行混合，将此作为试样溶 液。
(基质分散液的调制)
将由上述的"氧化铜粉末的合成例1"得到的氧化铜(CuO)粉末 用作激光吸收基质的材料。将该氧化铜粉末500mg加入5mL甲醇中， 实施l个小时超声波振动。由此，将氧化铜粉末的粒子(CuO 二次粒 子)稍微粉碎，得到平均粒径处于0. 3 2um范围的CuO二次粒子。 该二次粒子如上所述，根据TEM的投影图像求得的CuO —次粒子的平均粒径为30nm,具有由构成最表层的一次粒子的形状所引起的凹凸表 面(参照图4)。将该分散液再稀释至30倍，将其作为基质分散液。 (试样架的制作)
准备市场销售的MALDI质i瞽分析用不锈钢试样基板。在该试样基 板上通过滴注涂敷上述基质分散液0. 5 jaL。其后，使涂敷液干燥，得 到CuO二次粒子载持于不锈钢基板上的试样架。 (试样物质的粘附)
在上述试样架的CuO 二次粒子载持部位通过滴注涂敷上述试样溶 液O. 5jaL，其后，使试样溶液干燥，制成在粘附于CuO的状态下搭栽 试样物质的试样架。 (分析)
将搭载有试样物质的试样架固定于MALDI质谱分析装置(岛津制 作所制造，AXIMA-CFR)之后，照射脉沖激光(337nm)，由此，使 CuO 二次粒子作为激光吸收基质发挥作用。利用TOF型质谱分析仪对 进行了离子化且从CuO基质解吸的试样分子进行分析。
分析结果如图6所示。判断出试样聚乙二醇试剂的分子量分布大 致为正态分布(在下述的各聚乙二醇试剂中相同)。如图6所示，得 到反映了该正态分布的i普图，噪声水平极小。看不见干扰离子峰。
据推断，由于基质粒子为具有由CuO纳米粒子(一次粒子)的形 状所引起的特殊的凹凸表面的二次粒子，由此，试样分子的吸附状态 接近单点吸附，通过激光照射，平稳地进行吸附分子的离子化及解吸。 (比较例1 )
作为激光吸收基质，除了取代实施例1的CuO二次粒子而使用市 场销售的CuO粉末粒子(日進^厶3株式会社制)之外，用与实施例1 同样的方法，对试剂聚乙二醇(PEG 1000 )进行了分析。
所使用的CuO粒子的FE-SEM照片示于图5。认为微米级的各个粒 子具有平滑的表面，其自身为CuO的一次粒子。
分析结果示于图7。检测到的试样分子的绝对数比实施例1的场 合低，在将最大频度标准化为100%的镨图中，图7 (比较例1)的噪声比图6 (实施例1)明显，另外，正态分布的形状也发生了变形。看 不到干扰离子峰。
由于基质CuO粒子的表面平滑，因此推断为，试样分子向基质的 粘附状态与实施例1的场合相比，多点吸附的程度大，激光照射难以 引起试样分子的离子化及解吸。 (现有例1)
通过使用有机基质的现有通常的方法，对与实施例l相同的试剂 聚乙二醇(PEG 1000 )进行了分析。所使用的MALDI质谱分析装置也 与实施例l相同。该情况下，作为有机基质使用了 CHCA ( oc -氰基-4-羟基苯曱酸)。
分析结果示于图8。呈现出有机基质引起的干扰离子峰，成为对 试样分子的准确分析产生妨碍的状态。这样，使用有机基质的方法例 如在分子量1000以下的较低分子量的化合物为分析对象的情况下，大 多同时产生困难。 (实施例2)
作为分析试样，除了以分子量比实施例1大的试剂聚乙二醇(PEG 4000 )为对象之外，用与实施例1同样的方法进行了质谱分析。
分析结果示于图9。得到反映了正态分布的清晰的谱图，噪声水 平极小。也看不到千扰离子峰。
该情况也推断为，试样分子以近似于单点吸附的形式吸附于基质 粒子的特殊的凹凸表面。 (比较例2 )
作为激光吸收基质，取代实施例2的CuO二次粒子而使用市场销 售的Cu0粉末粒子(与比较例l相同的粒子)，除此之外，用与实施 例2相同的方法对试剂聚乙二醇(PEG 4000 )进行了分析。
分析结果示于图10。噪声水平比比较例1 (图7)的情况大幅度 增力口。
推断为，在此使用的表面平滑的CuO基质粒子的情况下，当试样 物质的分子量像该例这样大时，多点吸附的程度进一步增大。(现有例2)
通过使用有机基质的现有通常的方法，对与实施例2相同的试剂 聚乙二醇(PEG 4000 )进行了分析。分析方法与现有例l相同。
分析结果示于图11。通过将测定范围转移到高分子侧，看不到干 扰离子峰，但是，与实施例2 (图9)相比较，不仅噪声大，而且正态 分布的准确度方面也有一定下降。 (实施例3)
作为分析试样，以分子量比实施例2还大的试剂聚乙二醇(PEG 6000 )为对象，除此之外，用与实施例l、 2同样的方法进行了质谱分 析。
分析结果示于图12。虽然噪声水平变大，但是可足以确认试样物 质(PEG 6000 )的存在。 (比较例3 )
作为激光吸收基质，取代实施例3的CuO二次粒子而使用市场销 售的Cu0粉末粒子(与比较例1、 2相同的粒子)，除此之外，用与实 施例3相同的方法对试剂聚乙二醇(PEG 6000 )进行了分析。
分析结果示于图13。 PEG 6000的检测峰被埋没在噪声中，几乎不 能进行分析。
(现有例3)
通过使用有机基质的现有通常的方法，对与实施例3相同的试剂 聚乙二醇(PEG6000 )进行了分析。分析方法与现有例1、 2相同。
分析结果示于图14。该情况下，噪声比实施例3小，也较好地反 映了正态分布。得知，使用了有机基质的现有MALDI质谱分析，有利 于这种分子量比较大的有机化合物的分析。 (实施例4 )
作为试样，选择用于表面活性剂等的DTAB (溴化十二烷基三曱基 铵)，使用本发明的方法进行了质谱分析。操作顺序除在实施例l变 更了试样物质之外，基本上与实施例l相同。其中，以500ng/mL~ 50pg/mL的浓度范围按5个等级准备DTAB溶液，分别使用与各DTAB
17溶液同浓度的Nal溶液并按"DTAB溶液，，"NaI溶液"- 5: 1的比 例进行混合，制作了 DTAB浓度不同的5种试样溶液。
分析结果示于图15(浓度500ng/mL)、图16 (浓度50ng / mL)、 图17 (浓度5ng/mL)、图18 (浓度500pg/mL)、图19 (浓度50pg /mL)。确认没有干扰离子峰，这样的低分子量的物质也可以清晰地 分析。另外，由于即使为极为稀薄的溶液也能够检测试样物质，因而 可考虑应用于人及家畜的药检。
权利要求
1、一种MALDI质谱分析用的试样架，所述试样架具有CuO二次粒子作为激光吸收基质，所述二次粒子由平均粒径100nm以下的CuO一次粒子集合而成，并具有由构成最表层的一次粒子的形状所引起的凹凸表面。
2、 如权利要求1所述的MALDI质谱分析用的试样架，其中，所述Cu0 二次粒子的来源为，通过将在对碳酸氩铵水溶液和硝酸铜水溶液进行混合的工序中所生成的碱式碳酸铜在200 ~ 300。C下进行大气烧结而合成的CuO粉末。
3、 如权利要求1或者2所述的MALDI质谱分析用的试样架，其中，所述CuO二次粒子的平均粒径为0. 3~ 10Mm。
4、 一种质谱分析方法，其包括将由平均粒径100nm以下的CuO —次粒子集合而成的二次粒子即具有由构成最表层的一次粒子的形状所引起的凹凸表面的CuO二次粒子分散于液状介质中的工序；通过在将该分散液涂敷于MALDI质谱分析用的试样基板上之后使其干燥，得到载持有所述CuO 二次粒子的试样架的工序；通过在将溶解有作为分析对象的有机化合物(试样物质)的试样溶液涂敷于所述试样架的CuO 二次粒子载持部位之后使其干燥，将试样物质粘附于CuO上的工序；通过在将该试样架设置于MALDI质谱分析装置中之后照射脉沖激光，使CuO 二次粒子作为激光吸收基质发挥功能，对试样物质进行离子化的工序。
5、 如权利要求4所述的质语分析方法，其中，所述试样物质是分子量为100 ~ 5000的有机化合物。
全文摘要
本发明提供一种MALDI质谱分析用的试样架，所述试样架具有CuO二次粒子作为激光吸收基质，所述二次粒子由平均粒径100nm以下的CuO一次粒子集合而成，并具有由构成最表层的一次粒子的形状所引起的凹凸表面。可使用的上述CuO二次粒子的来源为，通过将在对碳酸氢铵水溶液和硝酸铜水溶液进行混合的工序中所生成的碱式碳酸铜在200～300℃下进行大气烧结而合成的CuO粉末，该CuO二次粒子的平均粒径为0.3～10μm。
文档编号G01N27/62GK101688847SQ20088002203
公开日2010年3月31日 申请日期2008年6月25日 优先权日2007年6月27日
发明者佐藤王高, 米泽彻 申请人:国立大学法人东京大学;同和电子科技有限公司