食用油样品中游离甾醇组份分析方法及地沟油鉴别方法
【专利摘要】本发明涉及一种食用油样品中游离甾醇组份分析方法及地沟油鉴别方法，该分析方法为：将待测食用油样品中经过固相萃取处理，分离出其中的游离甾醇，再将游离甾醇进行硅烷化衍生后注入全二维气相色谱-飞行时间质谱进行检测，实现食用油样品中的甾醇类化合物进行定性和定量分析。该方法与传统甾醇化合物分析方法相比，具有灵敏、快速、高效的特点，通过分析不同食用油中植物甾醇和胆固醇及胆固醇和其他特定植物甾醇的比例关系，建立了食用油掺伪鉴别及地沟油鉴别方法，可实现食用油的真伪鉴定及地沟油的鉴别。
【专利说明】食用油样品中游离留醇组份分析方法及地沟油鉴别方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种食用油样品中游离留醇组份分析方法及地沟油鉴别方法，可用于 对食用油中的游离植物留醇和胆固醇进行定性和定量分析，并可依据判别因子对地沟油进 行鉴别。
【背景技术】
[0002] 食用油的质量和安全已经成为公众关注的一个热点问题。广义的"地沟油"包括地 沟油、潲水油（泔水油）、煎炸老油、以及由动物下脚料等炼制的油脂。一些通过精炼的"地 沟油"在色泽、气味、过氧化值、酸价、碘价等理化指标方面和正常的食用油脂没有明显的区 另IJ，给食用油的质量监督和安全管理带来了很大的困难。由于利益的诱惑，一些不法商贩将 精炼的"地沟油"当作食用油或者按照一定的比例添加到正常的食用油中进行销售。研究 表明："地沟油"由于发生了氧化和酸败，生成了大量的小分子的醛、酮、酸和烃类化合物，以 及由于油脂在高温下发生的热聚合和氧化热聚合作用，也形成了一定的环烃、环氧烃、聚脂 类和苯并比等，再加上一些环境污染物，如重金属离子、黄曲霉毒素等，这就导致其存在很 大的安全隐患，长期食用具有致病和致癌的风险。目前我国尚未建立检测"地沟油"的统一 标准。
[0003] 留醇是广泛存在于生物体内的一种重要的生物活性物质，每种植物油都有自己特 定甾醇组成模式，它们也是油脂不皂化物的重要组成部分。植物油中常见的植物留醇有菜 油甾醇、芸薹甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、Λ 5_燕麦甾烯醇、Λ 5'23-豆甾二烯醇、Λ 5'24-豆甾 二烯醇、Λ 7_豆甾烯醇等，而动物油中甾醇则以胆固醇为主。"地沟油"由于经过反复使用， 与动物油脂的接触概率较高，往往含有较高的胆固醇。另外，"地沟油"通常经过高温煎炸和 反复精炼处理，其留醇组成模式也会发生变化，因此可以通过确定食用油中留醇的种类和 特定留醇之间的比例关系来确定可能存在的"地沟油"。
[0004] 目前食用油中甾醇类化合物的检测方法主要有气相色谱-火焰离子检测 (GC-FID)和气相色谱-质谱（GC-MS)法。这类方法在进样前，样品都需要经过复杂的前处 理，如油脂的皂化、不皂化物的提取、氧化铝柱层析、薄层层析等，过程耗时费力，而且需要 消耗较多的有机溶剂，不能满足日常环保、快速的要求（ISO 12228:1999, Food Chemistry 2013, 136, 251-258, Food Research International, 2011，44, 103-108)。另外，GC-FID在分 析食用油样品中含量较低的留醇时往往能力不足，并且特别容易受到样品中基质的干扰， 对于微量留醇的定量误差较大；同时一维气相色谱和全二维气相色谱相比，其色谱分离能 力不足，对于留醇的一些同分异构体往往不能达到满意的分离效果，给单个留醇精确定量 带来干扰。因此，发明一种快速、简便、环保的食用油中游离留醇的分离和检测方法具有重 要的实际应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种食用油样品中游离留醇组份分析方法及地 沟油鉴别方法，具体来讲就是将食用油样品经过固相萃取处理，分离出其中的游离留醇，最 后再将游离留醇化合物硅烷化衍生后，用全二维气相色谱-飞行时间质谱进行检测，并对 食用油中的游离植物留醇和胆固醇进行定性和定量分析。进一步基于该方法分析结果可用 于地沟油的鉴别。该方法与传统留醇化合物分析方法相比，具有灵敏、快速、高效的特点。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0007] 提供一种食用油样品中游离留醇组份分析方法：将待测食用油样品中经过固相 萃取处理，分离出其中的游离留醇，再将游离留醇进行硅烷化衍生后注入全二维气相色 谱-飞行时间质谱进行检测，然后对食用油样品中的留醇类化合物进行定性和定量分析。
[0008] 按上述方案，所述全二维气相色谱-飞行时间质谱分析所用的优选条件为：进样 口温度300?320°C，以氦气为载气，流速为0. 7?lmL/min，分流比为15?20 :1，调制器 温度补偿为35?40°C ;调制周期为3s，其中热吹时间为1. 15s，冷吹时间为0. 35s ;传输线 温度设在310?315°C ;质谱扫描范围：从50m/z到700m/z，溶剂延迟为500?700s，检测 器电压为1650?1750V，离子源温度设在230?250°C。
[0009] 按上述方案，所述的全二维气相色谱-飞行时间质谱分析中一维柱为 DB-5ms (30mX 0. 25mm I. D. X 0· 25 μ m)或 HP_5ms (30mX 0· 25mm I. D. X 0· 25 μ m)，均由美 国 Agilent Technologies 提供；二维柱为 Rxi_17Sil MS (2. OmX0.15mm I. D.X0.15 μ m), 由美国 Restek 公司提供，或 DB-17ht(l. 5mX0. 10mm I. D. X0. 15ym)，由美国 Agilent Technologies提供。一维炉温箱的升温程序为：初始温度180?190°C，保持lmin，然后以 10?15°C /min的速率升到250°C，保持lmin，再以2?3°C /min的速率升到280°C，保持 2min，最后以9?11°C /min的速率升到300°C，保持20min ;二维炉温箱的温度比一维炉温 箱高15°C，升温程序：初始温度195?205°C，保持lmin，然后以10?15°C /min的速率升 至lj 265°C，保持lmin，再以2?3°C /min的速率升到295°C，保持2min，最后以9?11°C / min的速率升到315°C，保持20min ;质谱数据采集频率为100谱图/s(spectra/s);进样量 为1?2 μ L〇
[0010] 按上述方案，所述的定性分析方法为：根据获得的待测食用油样品的二维色谱图， 将各留醇类化合物的一维和二维保留时间及其对应的质谱图与其对应的留醇标准品经硅 烷化衍生后检测获得的保留时间和质谱图进行相应比对，并同时与NIST库中相应留醇硅 烷化衍生物的标准质谱图进行比对，进行定性分析，获得食用油中留醇类化合物的定性结 果，其中，对于不易得到标准品的甾醇化合物（24-亚甲基胆固醇、芸薹甾烷醇、Λ 7_芸薹甾 烯醇、Λ 5' 23_豆甾二烯醇、谷甾烷醇、Λ 5_燕麦甾烯醇、Λ 5' 24_豆甾二烯醇、Λ 7_豆甾烯醇、 Λ 7_燕麦甾烯醇），将其相对保留时间与I SO 12228:1999标准中报道的相对保留时间进行 比对，同时将其质谱图与NIST谱库中相应留醇硅烷化衍生物的标准质谱图进行比对，获得 定性结果，所述的相对保留时间为各留醇化合物一维保留时间/胆固醇三甲基硅醚一维保 留时间的比值。
[0011] 按上述方案，所述的定量分析方法为：建立各留醇类化合物标准物内标曲线，具体 为：精确称取不同质量的各留醇类化合物标准物于不同的反应瓶中，并在每个反应瓶中加 入胆留烷醇内标，再加入硅烷化试剂，得到一系列不同浓度的各留醇标准物体系，然后分别 经硅烷化衍生反应后冷却至室温，进样到全二维气相色谱-飞行时间质谱进行分析，以各 标准物的浓度为横坐标，各标准物在不同浓度时对应的峰面积与内标物峰面积的比值为纵 坐标，经过回归拟合得到各标准物的内标曲线，食用油样品中胆固醇、菜油甾醇、芸薹甾醇、 豆甾醇和β-谷留醇的含量采用各自对应标准品的内标曲线进行计算；对于食用油样品中 没有相应的标准品的其它留醇的定量分析使用豆留醇内标曲线代替；
[0012] 根据上述获得的食用油样品中游离甾醇的GCXGC-T0F/MS总离子流图，计算样品 中各甾醇化合物的峰面积与内标峰面积的比值，利用相应的内标曲线，获得食用油中各甾 醇化合物的含量。
[0013] 按上述方案，所述对食用油样品中胆固醇、菜油甾醇、芸薹甾醇、豆甾醇和 β-谷甾醇进行定量分析时所用的内标曲线中：胆固醇内标曲线的浓度梯度为：〇. 1、 0.2、0.4、0.8、1.5、3.0yg/100yL;菜油甾醇、芸薹甾醇、豆甾醇内标曲线的浓度梯度都 设在1、5、10、20、30、40μ g/100yL ;β-谷甾醇内标曲线浓度梯度为5、10、20、40、80、 120 μ g/100 μ L ;所述对食用油样品中没有标准物质的其他留醇化合物进行定量分析时所 用的豆甾醇内标曲线中豆甾醇的浓度梯度为〇. 1，〇. 5, 1，2, 4, 8 μ g/100 μ L。
[0014] 按上述方案，所述定量分析时计算各留醇类化合物峰面积的定量离子组合为：胆 固醇三甲基硅醚：247+353+329+368+458 ;胆留烷醇三甲基硅醚：215+306+355+445+460 ; 菜油留醇三甲基硅醚：255+341+365+380+470 ;24_亚甲基胆固醇三甲基硅醚： 253+296+371+386+470 ;芸薹留醇三甲基硅醚：255+343+367+382+472 ;芸薹留烷醇 三甲基硅醚：215+305+343+382+474 ;豆留醇三甲基硅醚：255+355+379+394+484 ; Λ 7_芸薹留烯醇三甲基硅醚：255+367+382+457+472 ; Λ 5'23-豆留二烯醇三甲基硅醚： 255+355+379+394+484 ;β -谷留醇三甲基硅醚：255+357+381+396+486 ;谷留烷醇三甲 基硅醚：215+305+383+473+488 ; Λ 5_ 燕麦留烯醇三甲基硅醚：257+281+296+386+484 ; Λ 5'24-豆留二烯醇三甲基硅醚：253+281+343+386+484 ; Λ 7_豆留烯醇三甲基硅醚： 255+357+381+471+486 ;Λ 7_ 燕麦留烯醇三甲基硅醚：255+343+386+469+484。
[0015] 按上述方案，所述的食用油样品是大豆油、菜籽油、花生油、葵花籽油、玉米油和地 沟油。
[0016] 按上述方案，所述的留醇类化合物是胆固醇、菜油留醇、24-亚甲基胆固醇、芸薹 甾醇、芸薹甾烷醇、豆甾醇、Λ 7_芸薹甾烯醇、Λ 5'23-豆甾二烯醇、β-谷甾醇、谷甾烷醇、 Λ 5_燕麦甾烯醇、Λ 5' 24_豆甾二烯醇、Λ 7_豆甾烯醇和Λ 7_燕麦甾烯醇。
[0017] 按上述方案，所述的固相萃取处理方法为：
[0018] (1)固相萃取上样液的制备：在食用油样品中加入胆留烷醇内标，然后用正己烷 溶解，涡旋震荡均匀，备用；
[0019] (2)上样：将步骤⑴中震荡均匀的样品液注入到活化后的固相萃取柱（SPE)中， 弃去流出液；
[0020] (3)淋洗：用体积百分比浓度为5?6%的乙醚的正己烷溶液（ν/ν)进行淋洗，弃 去流出液；
[0021] (4)洗脱：用体积百分比浓度为15?25%的乙醚的正己烷溶液（ν/ν)洗脱游离甾 醇。
[0022] 按上述方案，所述的固相萃取处理方法具体步骤为：
[0023] (1)固相萃取上样液的制备：准确称取0.04?0.06g食用油样品，并加入20yg胆 甾烷醇内标，然后用5?8mL正己烷溶解，涡旋震荡均匀，备用；
[0024] (2)上样：将步骤⑴中震荡均匀的样品液注入到活化后的固相萃取柱（SPE)中， 控制流速为1. 2?1. 6mL/min，弃去流出液；所述的固相萃取柱为娃胶柱；所述固相萃取柱 的活化为：称取1. 〇?1. 5g无水硫酸钠加到固相萃取柱（SPE)的上方，然后用10?15mL 正己烷溶液活化，流速为1. 0?2. OmL/min，弃去流出液；
[0025] (3)淋洗：用体积百分比浓度为5?6%的乙醚正己烷溶液（v/v)溶液进行淋洗， 流速控制在1. 2?1. 6mL/min，弃去流出液；
[0026] (4)洗脱：用体积百分比浓度为15?25%的乙醚正己烷（v/v)溶液洗脱游离甾 醇，流速控制在1. 2?1. 6mL/min。
[0027] 按上述方案，所述的硅烷化衍生为将固相萃取处理后的样品脱除溶剂，再加入硅 烷化试剂经硅烷化衍生后冷却至室温供分析。
[0028] 按上述方案，所述脱除溶剂为在35?40°C，用真空旋转蒸发仪脱除大部分溶剂， 然后转移到反应瓶中，继续用氮气缓缓吹干溶剂。
[0029] 按上述方案，所述硅烷化试剂为由N-甲基-N-三甲基硅烷基七氟丁酰胺和1-甲 基咪唑按体积比计为93?95 :7?5组成，所述的硅烷化试剂用量为每mg食用油样品 1. 5?2· 5μ L，硅烷化反应条件为：102?108°C反应15?20min。
[0030] 地沟油鉴别方法，其特征在于：将待鉴别样品采用上述食用油样品中游离甾醇组 份分析方法进行检测分析，获得待鉴别样品中各留醇化合物的含量，然后由此计算得到样 品中（Λ 5_燕麦甾烯醇+ Λ 5'24_豆甾二烯醇+ Λ 7_燕麦甾烯醇）/胆固醇的比值即判别因 子，当判别因子> 5,判为正常食用油，判别因子< 5则判为地沟油。
[0031] 本发明的有益效果：
[0032] 本发明采用固相萃取对食用油中的游离甾醇进行富集和分离，有机溶剂用量少， 具有快速、经济和环保的特点，能够满足大量样品的快速前处理需求。
[0033] 本发明采用的全二维气相色谱和普通一维气相色谱相比色谱分离能力强，在分析 基质复杂的样品时具有较大的优势。同时飞行时间质谱（TOF/MS)数据采集频率高，在后续 的峰解析、峰匹配中具有较强的优势，由此在目标物的定量时，可以更好、更方便快速地选 择多个定量离子组合来对目标物进行积分，既提高了选择性又增强了痕量目标物的信号强 度，使定量更加准确。该方法与传统留醇化合物分析方法相比，具有灵敏、快速、高效的特 点。
[0034] 由于经过反复使用和高温处理，地沟油和其他回收油中通常含有较多的动物源甾 醇，同时其他植物源留醇也会发生氧化和降解作用，因此，该方法通过区分食用油中的胆固 醇和植物留醇，以及分析胆固醇和其他特定植物留醇的比例关系，为进一步测定和区分可 能存在的地沟油以及其他回收利用的劣质油奠定基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0035] 图1甾醇标准物质经硅烷化衍生后的GCXGC-TOF/MS色谱图；
[0036] 图2大豆油中游离甾醇经硅烷化衍生后的GCXGC-TOF/MS色谱图；
[0037] 图3菜籽油中游离甾醇经硅烷化衍生后的GCXGC-TOF/MS色谱图；
[0038] 图4花生油中游离甾醇经硅烷化衍生后的GCXGC-TOF/MS色谱图；
[0039] 图5葵花籽油中游离甾醇经硅烷化衍生后的GCXGC-TOF/MS色谱图；
[0040] 图6玉米油中游离甾醇经硅烷化衍生后的GCXGC-T0F/MS色谱图；
[0041] 图7地沟油1中游离甾醇经硅烷化衍生后的GC X GC-T0F/MS色谱图；
[0042] 附图中各峰对应的甾醇如下，1 :胆固醇，2 :胆甾烷醇，3 :菜油甾醇，4 :24_亚甲基 胆固醇，5 :芸薹甾醇，6 :芸薹甾烷醇，7 :豆甾醇，8 :Λ7-芸薹甾烯醇，9 :Λ5'23-豆甾二烯醇， 10 : β -谷甾醇，11 :谷甾烷醇，12 :Λ 5_燕麦甾烯醇，13 :Λ 5'24-豆甾二烯醇，14 :Λ 7_豆甾 烯醇，15 :Λ 7_燕麦甾烯醇。
【具体实施方式】
[0043] 以下【具体实施方式】将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。
[0044] 实施例1 :食用油样品中游离甾醇的定性和定量分析
[0045] (1)上样液的制备：准确称取0· 05g(精确到小数点后4位）食用油样（大豆油、 菜籽油、花生油、葵花籽油、玉米油和地沟油），并加入20 μ g胆甾烷醇内标，然后用5mL正己 烷溶解，涡旋震荡均匀，备用。
[0046] (2)上样：将⑴中震荡均匀的样品液注入到活化后的SPE柱中，控制流速为 1. 2?1. 6mL/min，弃去流出液；所述的SPE柱为0. 5mg/6mL硅胶柱，所述的活化为称取1. 0g 无水硫酸钠加到SPE柱的上方，然后用10?15mL正己烷溶液活化，流速为1. 0?2. OmL/ min,弃去流出液；
[0047] (3)淋洗：用10mL体积百分比浓度5?6%的乙醚正己烷溶液（v/v)溶液进行淋 洗，流速控制在1. 2?1. 6mL/min，弃去流出液；
[0048] (4)洗脱：用10?15mL体积百分比浓度15?25%的乙醚正己烷（v/v)溶液洗脱 甾醇类化合物，流速控制在1. 2?1. 6mL/min。
[0049] (5)将步骤（4)中得到的洗脱液在35?40°C真空旋转蒸发至大约lmL，然后转移 到反应瓶中，用氮气缓缓吹干溶剂，再加入100 μ L硅烷化试剂（N-甲基-N-三甲基硅烷基 七氟丁酰胺：1-甲基咪唑=95:5, ν/ν)，旋紧反应瓶盖，放于105°C的恒温箱中反应15min， 然后冷却至室温供分析。
[0050] (6)将步骤（5)中的各样品以1 μ L的进样量注入到全二维气相色谱-飞行时间质 谱进行分析。留醇标准物质经硅烷化衍生后的GCXGC-T0F/MS色谱图如图1所示；大豆油、 菜籽油、花生油、葵花籽油、玉米油和地沟油1中游离留醇经硅烷化衍生后的GCXGC-T0F/ MS色谱图如图2、3、4、5、6、7所示。
[0051] 所述全二维气相色谱-飞行时间质谱分析所用条件为：全二维气相色谱分析中 包含2根毛细管柱，其中一维柱为DB-5ms(30mX0· 25mm I. D. X0. 25 μ m)，由美国Agilent Technologies 提供；二维柱为 Rxi-17Sil MS (2.0mX 0.15mm I.D.X 0.15 μ m)，由美国 Restek公司提供。进样口温度设在320°C，以氦气为载气，流速为0. 7mL/min。进样量为 1 μ L，分流比为20 :1。一维炉温箱的升温程序为：初始温度180°C，保持lmin，然后以10°C / min的速率升到250°C，保持lmin，再以2°C /min的速率升到280°C，保持2min，最后以 10°C /min的速率升到300°C，保持20min ;二维炉温箱的温度比一维炉温箱高15°C，升温程 序：初始温度195°C，保持lmin，然后以10°C /min的速率升到265°C，保持lmin，再以2°C / min的速率升到295°C，保持2min，最后以10°C /min的速率升到315°C，保持20min。调制 器温度补偿为40°C;调制周期为3s，其中热吹时间为1. 15s，冷吹时间为0. 35s ;传输线温度 设在315°C。质谱数据采集频率为lOOspectra/s，扫描质量数从50m/z到700m/z，溶剂延迟 为700s。检测器电压为1750V，离子源温度设在250°C。
[0052] (7)图谱解析，对食用油中游离甾醇进行定性和定量分析。
[0053] 所述的定性分析为：根据获得的待测食用油样品的二维色谱图，将各留醇类化合 物的一维和二维保留时间及其对应的质谱图与其对应的留醇标准品经硅烷化衍生后检测 获得的保留时间和质谱图进行相应比对，并同时与NIST库中相应留醇硅烷化衍生物的标 准质谱图进行比对，进行定性分析，获得食用油中留醇类化合物的定性结果。其中，对于不 易得到标准品的甾醇化合物（24-亚甲基胆固醇、芸薹甾烷醇、Λ 7_芸薹甾烯醇、Λ 5'23-豆 甾二烯醇、谷留烷醇、Λ 5_燕麦留烯醇、Λ 5'24_豆留二烯醇、Λ 7_豆留烯醇、Λ 7_燕麦甾烯 醇），可根据其一维保留时间/胆固醇三甲基硅醚一维保留时间的比值即相对保留时间和 质谱图来进行判定，具体做法是：将其相对保留时间与ISO 12228:1999标准中报道的相对 保留时间进行比对，同时将其质谱图与NIST谱库中相应留醇硅烷化衍生物的标准质谱图 进行比对，获得定性结果。
[0054] 所述的定量分析为：首先建立各留醇化合物内标曲线，具体为：精确称取不同质 量（先将标准物质配成一定浓度的正己烷溶液，然后分别移取不同体积的溶液）的各甾醇 类化合物标准物于不同的反应瓶中，并在每个反应瓶中各加入胆留烷醇内标20 μ g，然后用 氮气缓缓吹干正己烷，再加入1〇〇 μ L硅烷化试剂（N-甲基-N-三甲基硅烷基七氟丁酰胺： 1-甲基咪唑=95:5, ν/ν)，旋紧反应瓶盖，得到不同浓度的各留醇标准物的体系，随后将反 应瓶放于102?108°C的恒温箱中加热反应15?20min，然后冷却至室温按照步骤（6)进 行分析，并以标准物的浓度为横坐标，各标准物在不同浓度时对应的峰面积与内标物峰面 积的比值为纵坐标，经过回归拟合得到各标准物质的内标曲线及计算公式。油样中胆固 醇、菜油留醇、芸薹留醇、豆留醇和谷留醇的计算分别采用各自内标曲线，其中胆固醇内标 曲线的浓度梯度为：〇. 1、〇. 2、0.4、0.8、1.5、3.〇μ8/100μ?;菜油甾醇、芸薹甾醇、豆甾醇 内标曲线的浓度梯度都设在l、5、10、20、30、40yg/100yL;@ -谷甾醇内标曲线浓度梯度 为5、10、20、40、80、120yg/100yL。另外，对于油样中没有标准物质的其他甾醇（24-亚甲 基胆固醇、芸薹甾烷醇、Λ 7_芸薹甾烯醇、Λ 5,23-豆甾二烯醇、谷甾烷醇、Λ 5_燕麦甾烯醇、 Λ 5'24_豆甾二烯醇、Λ 7_豆甾烯醇、Λ 7_燕麦甾烯醇），其计算统一使用豆甾醇内标曲线， 内标曲线中豆甾醇的浓度梯度为〇. 1，〇. 5, 1，2, 4, 8 μ g/100 μ L ;
[0055] 根据上述的获得的食用油样品中游离甾醇的GCXGC-T0F/MS总离子流图，计算样 品中各甾醇化合物的峰面积与内标峰面积的比值，利用相应的内标曲线，获得食用油中各 甾醇化合物的含量。
[0056] 所述食用油样本中14种游离留醇经全二维气相色谱-飞行时间质谱分析得到的 一维保留时间和二维保留时间如表1所示；所述定性分析用定性碎片离子和定量分析时计 算各留醇化合物峰面积的定量离子如表2所示。
[0057] 表1.食用油样本中14种游离甾醇经全二维气相色谱-飞行时间质谱分析得到的 一维保留时间和二维保留时间
[0058]
【权利要求】
1. 一种食用油样品中游离留醇组份分析方法，其特征在于：将待测食用油样品中经 过固相萃取处理，分离出其中的游离留醇，再将游离留醇进行硅烷化衍生后注入全二维气 相色谱-飞行时间质谱进行检测，然后对食用油样品中的留醇类化合物进行定性和定量分 析。
2. 根据权利要求1所述的食用油样品中游离留醇组份分析方法，其特征在于：所述全 二维气相色谱-飞行时间质谱分析所用的分析条件为：进样口温度300?320° C，以氦气 为载气，流速为〇. 7?lmL/min，分流比为15?20 :1，调制器温度补偿为35?40° C ;调制 周期为3s，其中热吹时间为1. 15s，冷吹时间为0. 35s ;传输线温度设在310?315° C ;质 谱扫描范围：从5(fe/z到700?/a溶剂延迟为500?700s，检测器电压为1650?1750V，离 子源温度设在230?250° C。
3. 根据权利要求1或2所述的食用油样品中游离留醇组份分析方法，其特征在于：所 述的全二维气相色谱-飞行时间质谱分析中一维柱为DB-5ms (30m X 0.25mm I.D. X 0· 25 μ m)或 HP_5ms (30m X 0. 25mm I. D. X 0· 25 μ m)，均由美国 Agilent Technologies 提供；二维柱为 Rxi-17Sil MS (2.0m X 0.15mm I.D. X 0.15以111)，由美国1^8七61^公司 提供，或 DB_17ht (1. 5m X 0. 10mm I. D. X 0· 15 μ m)，由美国 Agilent Technologies 提 供，一维炉温箱的升温程序为：初始温度180?190° C，保持lmin，然后以10?15° C/ min的速率升到250° C，保持lmin，再以2?3° C/min的速率升到280° C，保持2min， 最后以9?1Γ C/min的速率升到300° C，保持20min ;二维炉温箱的温度比一维炉温箱 高15° C，升温程序：初始温度195?205° C，保持lmin，然后以10?15° C/min的速率 升到265° C，保持lmin，再以2?3° C/min的速率升到295° C，保持2min，最后以9? 1Γ C/min的速率升到315° C，保持20min ;质谱数据采集频率为100谱图/s (spectra/ s);进样量为1?2yL。
4. 根据权利要求1或2所述的食用油样品中游离留醇组份分析方法，其特征在于：所 述的定性分析方法为：根据获得的待测食用油样品的二维色谱图，将各留醇类化合物的一 维和二维保留时间及其对应的质谱图与其对应的留醇标准品经硅烷化衍生后检测获得的 保留时间和质谱图进行相应比对，并同时与NIST库中相应留醇硅烷化衍生物的标准质谱 图进行比对，进行定性分析，获得食用油中留醇类化合物的定性结果，其中，对于不易得到 标准品的甾醇化合物（24-亚甲基胆固醇、芸薹甾烷醇、Λ 7_芸薹甾烯醇、Λ 5,23_豆甾二烯 醇、谷留烷醇、Λ 5_燕麦留烯醇、Λ 5'24_豆留二烯醇、Λ 7_豆留烯醇、Λ 7_燕麦留烯醇)，将 其相对保留时间与ISO 12228: 1999标准中报道的相对保留时间进行比对，同时将其质谱 图与NIST谱库中相应留醇硅烷化衍生物的标准质谱图进行比对，获得定性结果，所述的相 对保留时间为各留醇化合物一维保留时间/胆固醇三甲基硅醚一维保留时间的比值； 所述的定量分析方法为：建立各留醇类化合物标准物内标曲线，具体为：精确称取不 同质量的各留醇类化合物标准物于不同的反应瓶中，并在每个反应瓶中加入胆留烷醇内 标，再加入硅烷化试剂，得到一系列不同浓度的各留醇标准物体系，然后分别经硅烷化衍 生反应后冷却至室温，进样到全二维气相色谱-飞行时间质谱进行分析，以各标准物的浓 度为横坐标，各标准物在不同浓度时对应的峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标，经过 回归拟合得到各标准物的内标曲线，食用油样品中胆固醇、菜油甾醇、芸薹甾醇、豆甾醇和 β_谷留醇的含量采用各自对应标准品的内标曲线进行计算；对于食用油样品中没有相应 的标准品的其它留醇的定量分析使用豆留醇内标曲线代替； 根据上述获得的食用油样品中游离甾醇的GCXGC-TOF/MS总离子流图，计算样品中各 甾醇化合物的峰面积与内标峰面积的比值，利用相应的内标曲线，获得食用油中各甾醇化 合物的含量。
5. 根据权利要求4所述的食用油样品中游离留醇组份分析方法，其特征在于：所述对 食用油样品中胆固醇、菜油甾醇、芸薹甾醇、豆甾醇和β_谷甾醇进行定量分析时所用的内 标曲线中：胆固醇内标曲线的浓度梯度为：〇. 1、〇. 2、0. 4、0. 8、1. 5、3. Ο μ g/ΙΟΟμ L ;菜油 甾醇、芸薹甾醇、豆甾醇内标曲线的浓度梯度都设在1、5、10、20、30、40 μ g/ΙΟΟ μ L ; β -谷 甾醇内标曲线浓度梯度为5、10、20、40、80、120 μ g/100 μ L ;所述对食用油样品中没有标 准物质的其他留醇化合物进行定量分析时所用的豆留醇内标曲线中豆留醇的浓度梯度为 0.1， 0.5， 1， 2， 4， 8 yg/100yL。
6. 根据权利要求1或4所述的食用油样品中游离留醇组份分析方法，其特征在于：所 述定量分析时计算各留醇类化合物峰面积的定量离子组合为：胆固醇三甲基硅醚：247 + 353 + 329 + 368 + 458 ;胆甾烷醇三甲基硅醚：215 + 306 + 355 + 445 + 460 ;菜油甾醇 三甲基硅醚：255 + 341 + 365 + 380 + 470;24_亚甲基胆固醇三甲基硅醚：253 + 296 + 371 + 386 + 470 ;芸薹甾醇三甲基硅醚：255 + 343 + 367 + 382 + 472 ;芸薹甾烷醇三甲 基硅醚：215 + 305 + 343 + 382 + 474;豆甾醇三甲基硅醚：255 + 355 + 379 + 394 + 484;Λ7-芸薹甾烯醇三甲基硅醚：255 + 367 + 382 + 457 + 472;Λ5'23-豆甾二烯醇三甲 基硅醚：255 + 355 + 379 + 394 + 484 ;β-谷甾醇三甲基硅醚：255 + 357 + 381 + 396 + 486 ;谷甾烷醇三甲基硅醚：215 + 305 + 383 + 473 + 488 ;Λ 5_燕麦甾烯醇三甲基硅醚： 257 + 281 + 296 + 386 + 484; Λ 5'24-豆甾二烯醇三甲基硅醚：253 + 281 + 343 + 386 + 484;Λ7-豆甾烯醇三甲基硅醚：255 + 357 + 381 + 471 + 486;Λ7-燕麦甾烯醇三甲 基硅醚：255 + 343 + 386 + 469 + 484。
7. 根据权利要求1或2所述的食用油样品中游离留醇组份分析方法，其特征在于：所 述的食用油样品是大豆油、菜籽油、花生油、葵花籽油、玉米油和地沟油；所述的留醇类化合 物是胆固醇、菜油甾醇、24-亚甲基胆固醇、芸薹甾醇、芸薹甾烷醇、豆甾醇、Λ 7_芸薹甾烯 醇、Λ5'23-豆甾二烯醇、β-谷甾醇、谷甾烷醇、Λ 5_燕麦甾烯醇、Λ5'24-豆甾二烯醇、Λ7_豆 甾烯醇和Λ 7_燕麦留烯醇。
8. 根据权利要求1或2所述的食用油样品中游离留醇组份分析方法，其特征在于：所 述的固相萃取处理方法为： (1) 固相萃取上样液的制备：在食用油样品中加入胆留烷醇内标，然后用正己烷溶解， 润旋震荡均勻，备用； (2) 上样：将步骤（1)中震荡均匀的样品液注入到活化后的固相萃取柱中，弃去流出 液； (3) 淋洗：用体积百分比浓度为5?6%的乙醚的正己烷溶液进行淋洗，弃去流出液； (4) 洗脱：用体积百分比浓度为15?25%的乙醚的正己烷溶液洗脱游离甾醇。
9. 根据权利要求1或2所述的食用油样品中游离留醇组份分析方法，其特征在于：所 述的固相萃取处理方法具体步骤为： (1)固相萃取上样液的制备：准确称取0.04?0.06g食用油样品，并加入20 μ g胆甾 烷醇内标，然后用5?8mL正己烷溶解，涡旋震荡均匀，备用； (2) 上样：将步骤（1)中震荡均匀的样品液注入到活化后的固相萃取柱中，控制流速为 1. 2?1. 6mL/min,弃去流出液；所述的固相萃取柱为娃胶柱；所述固相萃取柱的活化为：称 取1. 0?1. 5g无水硫酸钠加到固相萃取柱的上方，然后用10?15mL正己烷溶液活化，流 速为1. 0?2. OmL/min，弃去流出液； (3) 淋洗：用体积百分比浓度为5?6%的乙醚正己烷溶液溶液进行淋洗，流速控制在 1. 2?1. 6mL/min，弃去流出液； (4) 洗脱：用体积百分比浓度为15?25%的乙醚正己烷溶液洗脱游离留醇，流速控制 在 L 2 ?L 6mL/min。
10. 根据权利要求1或2所述的食用油样品中游离留醇组份分析方法，其特征在于：所 述的硅烷化衍生为将固相萃取处理后的样品脱除溶剂，再加入硅烷化试剂经硅烷化衍生后 冷却至室温供分析； 所述硅烷化试剂为由甲基三甲基硅烷基七氟丁酰胺和1-甲基咪唑按体积比计 为93?95 :7?5组成，所述的硅烷化试剂用量为每mg食用油样品1. 5?2. 5 μ L，硅烷化 反应条件为：1〇2?108° C反应15?20min。
11. 地沟油鉴别方法，其特征在于：将待鉴别样品采用权利要求1或2所述的食用油样 品中游离留醇组分分析方法进行检测分析，获得待鉴别样品中各留醇化合物的含量，然后 由此计算得到样品中（Λ 5_燕麦甾烯醇+ Λ 5'24-豆甾二烯醇+ Λ 7_燕麦甾烯醇）/胆固醇 的比值即判别因子，当判别因子> 5,判为正常食用油，判别因子彡5则判为地沟油。
【文档编号】G01N30/08GK104267123SQ201410524887
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2014年9月30日
【发明者】李培武, 徐宝成, 张良晓, 马飞, 张奇, 王秀嫔, 张文 申请人:中国农业科学院油料作物研究所