专利名称：羊毛甾醇粗品分离提纯的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种有机物提纯技术领域的方法，具体是一种羊毛甾醇粗品分
离提纯的方法。
背景技术：
羊毛甾醇是真核细胞甾醇合成途径中重要的中间体。在人体内，它是胆固醇及 多种类固醇激素的合成前体(Crit.Rev.Biochem.Mol.， 34(2)， 123-140， 1999);在真菌细 胞中，它是麦角固醇及多种具有抗癌，消炎，降血脂等生物活性的三萜类化合物的重要 前体(Nat.Prod.Rep.， 15， 653-696， 1998 ; Int.Immunopharmacol.， 7， 701-724， 2007)。
因此高纯度的羊毛甾醇纯品在各种由于甾醇代谢导致的人体疾病和三萜类天然化合物生 物合成机制过程的研究中，具有十分重要的地位和作用。目前市售的高纯度羊毛甾醇 (97%以上)主要由Sigma， TCI，西域等几家公司所垄断，售价高达1000元/毫克，难为 大部分科研院所所承受。然而随着近年来人们对于疾病和健康不断关注，相关方面的研 究也愈加迫切，所以廉价地分离制备高纯度羊毛甾醇成为一个重要的研究内容。高纯度 羊毛甾醇分离纯化的瓶颈主要在于羊毛甾醇和二氢羊毛甾醇，以及其他固醇类物质的分 离(J.Org.Chem.， 20(12)， 1627-1630， 1955)。 传统羊毛甾醇的制备主要有提取法和溴化 法两种。经典的溴化法所用的试剂昂贵，回收率低；传统的提取法(许菲菲.从羊毛脂中 胆甾醇的工艺研究。浙江大学硕士论文.2005)存在步骤繁琐，周期长，回收率很低，结 晶纯度差等缺点，需要反复多次才能得到微量的纯品。因此，通过以上方法生产的羊毛 甾醇纯品价格不菲。基于以上背景， 一种快速、高效、成本低、纯度好的羊毛甾醇分离 纯化方法急需被开发，建立来满足市场的需求。 制备型高效液相色谱(Prep-HPLC)是基于20世纪60年代发展起来的高效液相 色谱技术的一种新型、高效的分离方法。其原理是利用样品中不同组分在液固两相中具 有不同的分配系数来进行分离纯化。在化合物的制备方面，相比于传统的分离工艺， Prep-HPLC具有有机溶剂消耗少，污染低，回收高等优点，可以满足快速，大制备量的 分离需求；相比于高速逆流色谱技术，Prep-HPLC分离度更好，重复性更佳，特别适合 结构类似物的分离纯化。目前，国内外学者已将Prep-HPLC运用于有效天然产物和结构 类似物的分离纯化中。因此，Prep-HPLC可能是分离纯化高纯度羊毛甾醇的较好方法。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种羊毛甾醇粗品分离提纯的方 法，在低成本和高回收率的情况下满足羊毛甾醇大量制备的需求，并亦能满足对于该工 艺的重复性以及线性放大的要求。 本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤 第一步、将羊毛甾醇粗品在25-4(TC条件下经超声处理溶解于有机溶剂中，制成 羊毛甾醇溶液；
所述的超声处理是指将样品置于超声清洗仪中超声促溶，超声清洗仪功率为 40-160W ; 所述的有机溶剂为HPLC级甲醇或HPLC级乙腈；
所述的羊毛甾醇溶液的浓度大于等于100 g/ml ; 第二步、将羊毛甾醇溶液由过滤膜过滤后用高效液相制备色谱采用重叠进样进
行分离纯化处理，得到提纯羊毛甾醇；所述的过滤膜是指滤膜孔径为0.22-0.45 m ; 所述的提纯羊毛甾醇的纯度为97% ; 所述的高效液相制备色谱为反相高效液相制备色谱，其填充材料为反相硅胶 C18，粒径5-10iim;流动相为100X的HPLC级甲醇或乙腈；定量环为2-10mL，采取满 环进样，流速为5-25mL/min ;柱温控制在15-25°C ，同时采用紫外检测器210nm在线检 测流出曲线，从而控制接样时间。 所述的采用重叠进样的进样方式是指所述定量环的容积、流动相的流速及每 针间隔时间满足TXV = V;所述的流动相的流速和制备柱内径满足V = kXd2;其 中T为每次进样间隔时间，V为柱流速，V为定量环容积，d为制备柱内径，k为常数。
本发明采用反相高效液相色谱法，能够保证分离度佳、产量高、回收率高、纯 度好等特点，能直接分离得到97%以上纯度的羊毛甾醇，可以用于各类甾醇相关疾病和 多种天然产物生物合成途径的研发。运用重叠进样，线性放大等技术弥补了使用反相色 谱分离羊毛甾醇溶解度低的劣势，使用内径20mm，柱长250mm的制备柱，日制备量可 达到近250mg，能满足多种科研需求。 本发明廉价地得到高纯度的羊毛甾醇，保守假设回收率高于85%，以一月生 产1克97%纯度的羊毛甾醇(最小产量)计算，柱损耗+流动相+粗品价格+人员费用 =2000+1600+80+5000 = 8880元，其费用为市售同等产品的8.88%，具有明显的价格优 势，可为相关方面的研究开发大幅降低成本。
图1为实施例1中羊毛甾醇粗品的高效液相分析色谱图。 图2为实施例2羊毛甾醇高效液相制备色谱图。 图3为实施例4羊毛甾醇高效液相制备色谱图。 图4为实施例1中纯化后的羊毛甾醇的高效液相分析色谱图。 图5为纯化后的羊毛甾醇经硅烷化后的气相质谱比对结果。
具体实施例方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进 行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的 实施例。 实施例1 1.称取lg以上市售羊毛甾醇粗品(高效液相色谱分析见图1)，加入200mL甲 醇，并超声处理5分钟促溶，将悬浊液置于25-35t:的水浴槽中静止30分钟，上清液即为羊毛甾醇粗品的甲醇饱和溶液。 2.将上述饱和溶液过0.22ym滤膜，作为制备色谱进样溶液。制备色谱柱内径为10mm，柱长250mm，柱填料为C18(粒径5 y m)，定量环2mL。用HPLC级甲醇作为洗脱相，以5mL/min的流速等梯度洗脱，运行时间18分钟。通过在线的紫外检测器监测流分，检测波长为210nm，按峰切割并收集流出液，可得到羊毛甾醇0.65mg，纯度大于97%，回收率大于95%，如图4所示。 本实施例说明使用高效液相色谱法分离纯化羊毛甾醇效果良好，产品纯度
高。其中羊毛甾醇的化学结构如下
羊毛甾醇
实施例2 羊毛甾醇粗品甲醇饱和溶液的制备方法同实施例1，过0.22ym滤膜，作为制备色谱进样溶液。制备色谱柱内径为10mm，柱长250mm，填料为C18(粒径5 y m)，定量环2mL.将样品注入制备色谱的进样环中开始洗脱，并每隔0.4分钟再进一次样品，连续五次。用HPLC级甲醇作为洗脱相，以5mL/min的流速等梯度洗脱，运行时间22分钟。通过在线的紫外检测器监测流分，检测波长为210nm，按峰切割并收集流出液，可得到羊毛甾醇3.2mg，纯度大于97%，回收率大于95%，如图2所示。
实施例3 羊毛甾醇粗品甲醇饱和溶液的制备方法同实施例1，过0.22ym滤膜，作为制备色谱进样溶液。制备色谱柱内径为10mm，柱长250mm，填料为C18(粒径5 y m)，定量环2mL.将样品注入制备色谱的进样环中开始洗脱，并每隔0.4分钟再进一次样品，连续五次。用HPLC级乙腈作为洗脱相，以5mL/min的流速等梯度洗脱，运行时间22分钟。通过在线的紫外检测器监测流分，检测波长为210nm，如图2所示，按峰切割并收集流出液，可得到羊毛甾醇3.4mg，纯度大于97%，回收率大于95%。 上述三个实施例说明重复进样的策略能够在不影响纯度的情况下，成倍提高生长效率，具有重要的应用价值。
实施例4 羊毛甾醇粗品甲醇饱和溶液的制备方法同实施例1，过0.45ym滤膜，作为制备色谱进样溶液。制备色谱柱内径为20mm，柱长250mm，填料为C18(粒径10 y m)，进样环10mL.将样品注入制备色谱的进样环中开始洗脱，并每隔0.4分钟再进一次样品，连续五次。用HPLC级甲醇作为洗脱相，以25mL/min的流速等梯度洗脱，运行时间30分钟。通过在线的紫外检测器监测流分，检测波长为210nm，如图3所示，按峰切割并收集流出液，可得到羊毛甾醇15.8mg，纯度大于97%，回收率大于90%。
实施例5
5
羊毛甾醇粗品甲醇饱和溶液的制备方法同实施例1，过0.45ym滤膜，作为制备色谱进样溶液。制备色谱柱内径为20mm，柱长250mm，填料为C18(粒径10 y m)，进样环10mL.将样品注入制备色谱的进样环中开始洗脱，并每隔0.4分钟再进一次样品，连续两次。用HPLC级甲醇作为洗脱相，以25mL/min的流速等梯度洗脱，运行时间30分钟。通过在线的紫外检测器监测流分，检测波长为210nm，按峰切割并收集流出液，可得到羊毛甾醇6.3mg，纯度大于97%，回收率大于95%。
实施例6 羊毛甾醇粗品甲醇饱和溶液的制备方法同实施例1，过0.45ym滤膜，作为制备色谱进样溶液。制备色谱柱内径为20mm，柱长250mm，填料为C18(粒径10 y m)，进样环10mL.将样品注入制备色谱的进样环中开始洗脱，并每隔0.4分钟再进一次样品，连续四次。用HPLC级甲醇作为洗脱相，以25mL/min的流速等梯度洗脱，运行时间30分钟。通过在线的紫外检测器监测流分，检测波长为210nm，按峰切割并收集流出液，可得到羊毛甾醇12.5mg，纯度大于97%，回收率大于92%。 以上三个实施案例说明该工艺可按发明方法中提出的公式线性放大，单位面积流量是主要的放大因子。此外，填料粒径在5-10iim之间，对分离和重复进样策略的实施影响不大。IO能的填料会稍微降低回收率，但仍能超过90%。 如图4和图5所示，为了确认所得产物，对上述晶体粉末进行了液相色谱和气质联用鉴定，并与标准品对照。质谱分析结果说明纯化后的产物经硅烷化后分子量为498。羊毛甾醇的质谱结果与对照品及NIST谱库中检索的结果一致。
权利要求
一种羊毛甾醇粗品分离提纯的方法，其特征在于，包括以下步骤第一步、将羊毛甾醇粗品在25-40℃条件下经超声处理溶解于有机溶剂中，制成羊毛甾醇溶液；第二步、将羊毛甾醇溶液由过滤膜过滤后用高效液相制备色谱采用重叠进样进行分离纯化处理，得到提纯羊毛甾醇。
2. 根据权利要求1所述的羊毛甾醇粗品分离提纯的方法，其特征是，所述的超声处理 是指将样品置于超声清洗仪中超声促溶，超声清洗仪功率为40-160W。
3. 根据权利要求1所述的羊毛甾醇粗品分离提纯的方法，其特征是，所述的有机溶剂 为HPLC级甲醇或HPLC级乙腈。
4. 根据权利要求1所述的羊毛甾醇粗品分离提纯的方法，其特征是，所述的羊毛甾醇 溶液的浓度为大于等于100 ii g/ml。
5. 根据权利要求1所述的羊毛甾醇粗品分离提纯的方法，其特征是，所述的过滤膜是 指滤膜孔径为0.22-0.45 ii m。
6. 根据权利要求1所述的羊毛甾醇粗品分离提纯的方法，其特征是，所述的提纯羊毛 甾醇的纯度为97%。
7. 根据权利要求1所述的羊毛甾醇粗品分离提纯的方法，其特征是，所述的高效液 相制备色谱为反相高效液相制备色谱，其填充材料为反相硅胶C18，粒径5-10ym;流动 相为100%的HPLC级甲醇或乙腈；定量环为2-10mL，采取满环进样，流速为5-25mL/ min;柱温控制在15-25°C，同时采用紫外检测器210nm在线检测流出曲线，从而控制接 样时间。
8. 根据权利要求1所述的羊毛甾醇粗品分离提纯的方法，其特征是，所述的采用重 叠进样的进样方式是指所述定量环的容积、流动相的流速及每针间隔时间满足TXv=V;所述的流动相的流速和制备柱内径满足V = kXd2;其中T为每次进样间隔时间，v为柱流速，V为定量环容积，d为制备柱内径，k为常数。
全文摘要
一种有机物提纯技术领域的羊毛甾醇粗品分离提纯的方法，包括将羊毛甾醇粗品在25-40℃条件下经超声处理溶解于有机溶剂中，制成羊毛甾醇溶液；将羊毛甾醇溶液由过滤膜过滤后用高效液相制备色谱采用重叠进样进行分离纯化处理，得到提纯羊毛甾醇。本发明采用反相高效液相色谱法，能够保证分离度佳、产量高、回收率高、纯度好等特点，能直接分离得到97％以上纯度的羊毛甾醇，可以用于各类甾醇相关疾病和多种天然产物生物合成途径的研发。运用重叠进样，线性放大等技术弥补了使用反相色谱分离羊毛甾醇溶解度低的劣势，使用内径20mm，柱长250mm的制备柱，日制备量可达到近250mg，能满足多种科研需求。
文档编号C07J9/00GK101691391SQ20091030843
公开日2010年4月7日 申请日期2009年10月19日 优先权日2009年10月19日
发明者李英波, 王家乐, 钟建江 申请人:上海交通大学