抗日本脑炎病毒及西尼罗病毒的疫苗的制作方法

专利名称：抗日本脑炎病毒及西尼罗病毒的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗日本脑炎病毒(Japaneses encephalitis virus)及西尼罗病毒(West Nile virus)的疫苗。
背景技术：
黄病毒科的黄病毒属包括大约70种病毒，大部分为虫媒病毒，其中的很多如黄热(YF)、登革(DEN)、日本脑炎(JE)以及蜱媒脑炎(TBE)病毒是主要的人类病原体(rev.in Burke and Monath，Fields Virology，4thEd.1043-1126，2001)。例如，在亚洲，日本脑炎是病毒性脑炎的主要病因，每年报道有30,000至50,000例新病例。又如，自从1999年在纽约地区诊断出第一例病例，西尼罗病毒一直在北美迅速地蔓延。这种病毒迁移到南美并在不发达国家成为流行病的风险性非常高。需要有效的方法来预防这些病毒的感染，而疫苗接种是最合算的措施。
黄病毒颗粒包含由病毒RNA及衣壳蛋白C组成的核壳体。核壳体由含包膜糖蛋白E(50-60kDa)及小的膜蛋白M(7-8kDa)的包膜包围。基因组RNA经翻译生成多蛋白前体，该前体经细胞及病毒蛋白酶裂解依次形成病毒蛋白质C，prM/M，E，NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，2K，NS4B，以及NS5，其中C至E为病毒体的结构成分，NS1至NS5为复制所需的非结构蛋白(Lindenbach and Rice，Fields Virology，4thEd.991-1041，2001)。prM蛋白(～25kDa)是M的细胞内前体。包含prM的不成熟病毒体通过出芽(budding)到内质网的腔内来产生，然后通过胞吐途径运输到细胞表面。prM裂解发生在颗粒于后高尔基小泡中释放之前很短的时间内。成熟的细胞外病毒主要含M蛋白，但也会存在少部分未裂解的prM。
E蛋白是病毒体的主要的功能性和抗原性表面成分。已通过冷冻电子显微镜术分辨E的胞外结构域的分子结构，其在pH中性条件下在成熟病毒颗粒的表面上形成同型二聚体(Rey等，Nature 375291-298，1995)并已匹配(fitinto)到病毒颗粒的电子密度图中(Kuhn等，Cell 108717-725，2002)。感染期间，E蛋白作为II级融合蛋白起作用(Modis等，Nature 427313-319，2004)。在病毒结合到细胞受体并内化后，在所产生的内体里的酸性pH促使二聚体解离，从而使每个单体原先隐藏的疏水性融合环袢向外暴露。与此同时，这些环袢插入到细胞(内体)膜中，单体重排形成拉长的三聚体。三聚体的进一步再折叠使得细胞膜与病毒膜紧密相邻，并使它们融合，将病毒颗粒的内容物释放到细胞质中。先前的研究显示，通过在小鼠的脑细胞和培养的猴肾以及蚊细胞的连续传代物中选出的在DEN及JE的E蛋白上的一些替代，已经定位在该蛋白质3D结构的特定部位，并据报道与病毒融合功能的改变有关。这些研究表明，与对应的亲本病毒分离物相比，一些减毒疫苗的融合PH阈值降低了0.6至1个pH单位。在DEN3 E蛋白六个残基(残基54，191，202，266，268以及277)中的一些改变位于结构域II的区域中。这个区域被提议作为低pH介导的构象改变的关注点，而该构象改变是使保守的疏水性cd融合环袢表面暴露所需的(Lee等，Virology 232281-290，1997)。
没有证据表明小的(成熟)M蛋白在导致病毒自内体内化的事件中起作用或有任何其它明显的功能，但已知它的细胞内前体prM对于子代病毒颗粒的形态发生及运输是重要的。prM蛋白还利于E的正确折叠(Lorenz等，J.Virol.765480-5491，2002)，并起作用避免E蛋白二聚体在通过酸性分泌区室向细胞表面排出新颗粒的阶段中发生成熟前构象重排(Guirakhoo等，J.Gen.Virol.721323-1329，1991；Guirakhoo等，Virology 191921-931，1992)。
已将ChimeriVaxTM技术应用于产生抗医疗重要性黄病毒的减毒活疫苗候选物。它应用YF17D疫苗病毒作为载体，其中的prM-E基因被异源黄病毒如JE、登革、西尼罗或圣·路易(St.Louis)脑炎病毒的prM-E基因代替(Monath等，Vaccine 171869-1882，1999；Monath等，Curr.Drug Targets-Inf.Disorders 137-50，2001；Monath等，Vaccine 201004-1018，2002；Guirakhoo等，Virology 257363-372，1999；Guirakhoo等，J.Virol.757290-7304，2001；Guirakhoo等，Virology 298146-159，2002；Pugachev等，Int.J.Parasitol.33567-582，2003；Guirakhoo等，J.Virol.784761-4775，2004)。之前，包含来自SA14-14-2病毒(在中国使用的活的减毒JE疫苗)的prM-E基因的ChimeriVaxTM-JE疫苗病毒在非洲绿猴肾(Vero)细胞中增殖到高滴度，所述非洲绿猴肾细胞被培养在补充了胎牛血清(FBS)的培养基中(Monath等，Biologicals 33131-144，2005)。在临床前及I期、II期临床试验中成功地对它进行了试验(Monath等，Vaccine 201004-1018，2002；Monath等，J.Infect.Dis.1881213-1230，2003)。类似地，已经用ChimeriVaxTM-WN疫苗候选物进行了成功的I期临床试验，这种疫苗候选物包含西尼罗病毒(NY99株)的prM-E序列，并且在E蛋白中掺入了三个特定氨基酸的改变以增加减毒作用(Arroyo等，J.Virol.7812497-12507，2004)。
发明概述本发明提供了重组黄病毒，其包含一或多个膜(M)蛋白突变(例如替代、缺失或插入)，如使得所述黄病毒发生减毒的突变(例如降低所述黄病毒的趋内脏现象/病毒血症的突变)，提高所述黄病毒在细胞培养物中增殖时的遗传稳定性的突变(例如在无血清培养基中制备)，和/或提高疫苗病毒产量的突变。本发明的所述黄病毒可以是嵌合的黄病毒，所述黄病毒例如包含第一种黄病毒(例如黄热病毒如YF 17D)的衣壳和非结构蛋白和第二种黄病毒(例如日本脑炎病毒、西尼罗病毒、登革病毒(1型登革、2型登革、3型登革或4型登革病毒)、圣·路易(St.Louis)脑炎病毒、墨累山谷(Murray Valley)脑炎病毒、蜱媒脑炎病毒、以及是来自YF、JE、DEN、和TBE血清复合体的人/动物病原体的任何其它黄病毒)的膜和/或包膜蛋白。
在本发明的黄病毒中，所述突变(例如替代)可在膜蛋白M的跨膜或胞外结构域内。例如，所述突变可在所述黄病毒膜蛋白M的预测的膜螺旋(membrane helix)的第40-75位氨基酸区域内。举个例子，所述突变可以是替代，该替代在黄病毒(如日本脑炎病毒)膜蛋白的第60位氨基酸中(如将日本脑炎病毒M蛋白质中的精氨酸替代为半胱氨酸)，或在另一种黄病毒的对应氨基酸中。如本领域技术人员公知，可以用标准的氨基酸序列比对来确定给定黄病毒中哪一个氨基酸“对应于”另一种黄病毒中的氨基酸。举另外一个例子，所述突变可以是替代，该替代在黄病毒(如西尼罗病毒)膜蛋白的第66位氨基酸中(如将西尼罗病毒的M蛋白质中的亮氨酸替代为脯氨酸)，或在另一种黄病毒的对应氨基酸中。在另一个例子中，所述突变在另一个膜锚定氨基酸中，例如选自M66残基侧翼氨基酸组成的组的一或多个氨基酸，包括日本脑炎病毒或西尼罗病毒的位置60、61、62、63、64、65、和66(或其它黄病毒的对应氨基酸)或跨膜区的其它氨基酸残基。
我们也首次提供了M蛋白质的胞外结构域有重要功能意义的证据，因为在M5残基从谷氨酰胺到脯氨酸的改变提高了感染的pH阈值。因此现在预计，不仅其C-末端的疏水锚(anchor)，可以在所述M蛋白质的氨基末端胞外结构域或表面部分作氨基酸改变或引入多种缺失或插入，以实现黄病毒减毒。因此在其它例子中，本发明的病毒包含本文所述的在M蛋白质胞外结构域(第1-40位残基)中的一或多个突变。如果这使黄病毒的成熟M蛋白质丧失任何已知功能，那么这个结果是十分意外的。
除了上面所述的膜蛋白突变，在包含西尼罗病毒的膜和包膜蛋白的嵌合黄病毒的情况下，本发明的病毒可包含一或多个包膜蛋白突变，所述突变在选自由第107、138、176、177、224、264、280、316、和440位氨基酸组成的组的氨基酸上。在其它的黄病毒中，所述突变可以在与这些氨基酸对应的氨基酸上。一个具体的例子是，所述黄病毒可包含突变，该突变对应于在西尼罗M蛋白质第66位氨基酸上的突变和在与西尼罗病毒第107、316、和440位氨基酸对应的氨基酸上的E蛋白质突变。除了上述的突变，本发明的黄病毒还可包含如本文其他处所述在包膜蛋白铰链区的疏水袋中的一或多个突变。本发明的病毒可包含的更多突变是如下面所述在3’UTR、衣壳蛋白、或其它包膜蛋白区的突变。
本发明也提供疫苗组合物，其包含上述及本文其他处所述的黄病毒以及可药用的载体或稀释剂，还提供通过施用这种疫苗组合物来诱导患者对黄病毒的免疫应答的方法。根据这种方法治疗的患者包括尚未但有风险被黄病毒感染的那些，以及被黄病毒感染的患者。进一步地，本发明包括本文所述黄病毒在本文所述的预防和治疗方法中的用途，以及在用于这些目的的药物制备中的用途。
本发明还提供了制备包含本文所述黄病毒的疫苗的方法，其涉及向所述黄病毒的膜蛋白引入降低趋内脏现象(viscerotropism)/病毒血症和/或增加遗传稳定性/产量的突变。进一步地，本发明提供了对应于本文所述黄病毒的基因组(或其互补物)的核酸分子(RNA或DNA)，以及使用这些核酸分子来制备本发明病毒的方法。
本发明的黄病毒是有益处的，因为其具有降低的毒力(例如通过下降的趋内脏现象/病毒血症来显示)，相对于它们的未突变的对应物(counterparts)，在施用给患者时它们提供了更高水平的安全性。另一个益处是一些突变如在ChimeriVaxTM-JE中的M-60突变，排除了在没有它们时在疫苗制备中会损害安全性的不理想突变的累积，并提高了制备产量。这些病毒的其它益处是由它们能包含黄热病毒株YF17D序列(例如编码衣壳和非结构性蛋白质的序列)的事实来提供的，YF17D(i)已经确认其安全性超过60多年，在这个阶段已经将3.5亿以上的剂量施用给人类，(ii)在单一剂量后诱导长期的免疫，和(iii)在接种的几天内迅速诱导免疫力。另外，本发明的疫苗病毒会主动感染被治疗患者。由于经过免疫接种的个体的细胞因子环境(milieu)和先天性免疫应答与在天然感染中的那些类似，因此抗原性物质(mass)会在宿主中扩散(expand)，正确折叠的构象表位经有效加工，适应性免疫应答较强，并建立了记忆。
假如黄病毒的成熟M蛋白质丧失任何已知的功能，那么M蛋白质中的突变在疫苗安全性和细胞培养中制备的有利方面将是新的并且是出乎意料的。
通过如下具体的说明书、附图和权利要求，本发明的其它特征和益处将是明显的。
附图简述

图1A图示了黄热病毒的3’未翻译区的，它显示了此区内的结构域(重复序列(RS)，保守序列CS2，CS1，和3’-末端的茎环-结构)，以及在本发明病毒中包含的突变的例子(例如缺失dA，dB，dC，dD，d7，d14，CS2 d5，和CS2d16)。
图1B图示了黄热17D病毒的3’未翻译区从第三RS元件的中部到UTR末端的序列和公布的二级结构预测(Proutski等，J.Gen.Virol.781543-1549，1999)。
图1C是用Zuker RNA折叠算法产生的最合理的YF 17D 3′UTR二级结构预测的示意图。
图1D是在最合理的YF 17D结构上3′UTR缺失(显示dC缺失；Zuker方法)的影响(与图1C相比)的示意图。
图2A图示了蜱媒脑炎病毒的衣壳蛋白的序列，以及在Kofler等，J.Virol.763534-3543，2002所报道的此蛋白中的缺失。
图2B图示了YF 17D病毒的衣壳蛋白的序列。其中指出了在某些ChimeriVaxTM-WN病毒中通过计算机分析预测为具有α-螺旋二级结构(α-螺旋I-IV)的区域，以及疏水区(实心柱)和引入此蛋白质中的缺失(例如缺失C1和C2；加框)。
图3显示了所示病毒(WN01，WN02 P5，大蚀斑(plaque)，小蚀斑，和YF/17D)在HepG2细胞中的生长。
图4显示了所示病毒(WN01，WN02 P5，大蚀斑，小蚀斑，和YF/17D)在THLE-3细胞中的生长。
图5显示了由所示病毒(WN02 P5；混合蚀斑)，小蚀斑(PMS，P10)，和大蚀斑(PMS，P10))诱导的仓鼠中的病毒血症。
图6图示了SF ChimeriVaxTM-JE病毒样品的传代物(g.s.，研究遗传稳定性的实验室传代物)。
图7是显示本发明SF ChimeriVaxTM-JE病毒(未克隆的P2，P3 MS(E-107)，P4 PS(E-107)，P5 g.s.(M-60)，和P5 VB(E-107))在感染后指定时间的生长曲线，这显示了含M-60[精氨酸(R)→半胱氨酸(C)和E-107苯丙氨酸(F)→亮氨酸(L)]突变体的病毒样品与非突变体病毒(P2)相比在SF培养物中有较高的生长速度。
图8A是显示与P5未克隆的成批疫苗(vaccine bulk)和克隆I(E-107突变体)，非-突变体(克隆A)，和M-60突变体(克隆C)相比，在用一定范围的酸性pH处理后M-5 ChimeriVaxTM-JE突变体(克隆E)的感染性。有意义的是斜坡的出现以及病毒丧失感染性的pH，而不是稀释样品的原始滴度(例如在pH6.8)。
图8B是ChimeriVaxTM-JE疫苗(经接种体反向滴定(back titration ofinocula)测定为1.9log10PFU/剂量)与ChimeriVaxTM-JE M5突变体(经接种体反向滴定测定为1.4log10PFU/剂量)相比，在通过脑内途径接种的3-4日龄乳鼠中的存活图谱。
图8C是ChimeriVaxTM-JE M5突变体病毒(经接种体反向滴定测定为1.4log10PFU/剂量)与YF-VAX_(经接种体反向滴定测定为0.9log10PFU/剂量)相比，在通过脑内途径接种的3-4日龄乳鼠中的存活图谱。
图8D显示了间接融合试验(Indirect Fusion assay)的结果，其比较了ChimeriVaxTM-DEN1-4病毒的P7和P10。用标准蚀斑试验来测定每个试验的病毒产量(output)。A，ChimeriVaxTM-DEN1 PMS P7(三角形)和P10(菱形)；B，ChimeriVaxTM-DEN2 PMS P7(三角形)和P10(菱形)；C，ChimeriVaxTM-DEN3PMS P7(三角形)和P10(菱形)；D，ChimeriVaxTM-DEN4 PMS P7(三角形)和P10(菱形)。
图8E显示ChimeriVaxrTM-DEN3的间接融合试验的结果，其比较了PMS(P7)疫苗与疫苗批(lot)(P10)和P15病毒。用标准蚀斑试验来测定每个试验的病毒产量。ChimeriVaxTM-DEN3 PMS P7(三角形)，P10(菱形)，和P15(方形)。
图8F显示了ChimeriVaxTM-DEN1病毒的DEN1 E-蛋白质二聚体(1到394位氨基酸)的结构(Guirakhoo等，J.Virol.789998-10008，2004)。(A)带正电的赖氨酸(K)在P7病毒的204位残基(PMS，204K)的位置通过CPK(显示大小为范德华(van der Waal)半径的球形)示意图来显示。三个结构域用黑色(结构域I)，浅灰(结构域II)，和深灰(结构域III)来显示。(B)图A中标示区的局部放大图。(C)来自突变体DEN1病毒的E蛋白质模型与图B相同的区域(P10，204R用黑色显示)。在图B和C中所选的氨基酸用棍状示意图来显示。中灰(Medium grey)，碳；深灰，氮；黑，氧；浅灰，硫。
图9A显示了ChimeriVaxTM-JE病毒M60突变体(克隆C)，E107突变体(克隆I)，和非-突变体(克隆A)在指定时间的穿透效率。这些结果表明M60突变在5和10分钟的时间点明显有利于穿透进入SF非洲绿猴肾细胞。用适当稀释的病毒(在无血清培养基中的克隆A，C，和I)感染SF非洲绿猴肾细胞5，10，20，或60分钟，然后用0.1M甘氨酸，0.1M NaCl，pH 3.0的溶液处理3分钟，来灭活胞外病毒。用PBS洗涤孔两次，然后用甲基纤维素覆盖单细胞层，之后用结晶紫在第5天对蚀斑进行染色。穿透效率用在甘氨酸处理后观察到的蚀斑数占用PBS而不是甘氨酸处理的对照感染的孔的百分比来显示。
图9B是E-107，M-5，和M-60氨基酸残基在包膜蛋白E和M中的位置的示意图，显示了M-5残基对融合的假设作用。在含E-107残基的E蛋白质的结构域II的顶端的虚线序列(stretch)代表了插入细胞膜的融合肽(c-d环)(Rey等，Nature 375291-298，1995)。M-5残基在M蛋白质的胞外结构域的N末端部分。E蛋白质单体重排成三聚体复合物，通过它的折叠来迫使细胞和病毒膜融合(Modis等，Nature 427(6972)313-319，2004)。M蛋白质可以是复合物中的功能组分，例如有利于病毒膜通过与E蛋白质的相互作用而与细胞膜融合。M-60残基在M的两个C-末端跨膜序列之间，并可以参与在融合中细胞与病毒的膜的相互作用。
说明书详述本发明提供了用于预防和治疗黄病毒(例如日本脑炎(JE)或西尼罗(WN)病毒)感染的疫苗和方法。本发明的方法通常涉及给受试者免疫接种活的减毒嵌合黄病毒，该黄病毒由第一种黄病毒(例如黄热病毒)组成，其中一或多个结构蛋白(例如膜和/或包膜蛋白)已经用第二种黄病毒(例如日本脑炎(JE)和/或西尼罗(WN)病毒；也见下面)的那些替代。如下进一步所述，本发明的嵌合体的膜蛋白包含一或多个突变。也如下所述，其它黄病毒的结构蛋白如膜和/或包膜蛋白可用来替代在本发明嵌合病毒中的日本脑炎病毒或西尼罗病毒的那些。进一步地，本发明的膜蛋白突变也可用于完整的未嵌合的黄病毒(例如任何本文所列的那些)，不包括对结构蛋白的任何替代，和可选的一或多个另外的突变，如本文所述的那些。
可包含在本发明疫苗中的嵌合病毒的具体例子是人类的黄热疫苗株，YF 17D(例如YF 17D-204(YF-VAX_，Sanofi-Pasteur，Swiftwater，PA，USA；Stamaril_，Sanofi-Pasteur，Marcy-L’Etoile，France；ARILVAXTM，Chiron，Speke，Liverpool，UK；FLAVIMUN_，Bema Biotech，Bern，Switzerland)；YF 17D-204France(X15067，X15062)；YF17D-204，234 US(Rice等，Science 229726-733，1985))，其中所述膜和包膜蛋白已经被日本脑炎病毒的膜和包膜蛋白(包括M蛋白质突变，如M60中的替代，如本文所述)替代。在另一个例子中，YF 17D的膜和包膜蛋白被西尼罗病毒的那些替代(包括M蛋白突变，如M66中的替代，如本文所述)。
在其它例子中，另一个黄病毒，如登革病毒(1，2，3或4血清型)、圣·路易脑炎病毒、Murray河谷脑炎病毒、黄热病毒，包括YF 17D株，或任何其它黄病毒，可提供在这个嵌合病毒中的膜和/或包膜蛋白。其它根据本发明可被减毒的黄病毒，无论作为完整的未-嵌合病毒还是作为嵌合体中膜和/或包膜蛋白的来源，都包括任何其它蚊媒(mosquito-borne)的黄病毒，如Kunjin，Rocio脑炎和巴西(Ilheus)病毒；蜱媒黄病毒，如欧洲中部脑炎(CentralEuropean encephalitis)，西伯利亚脑炎(Siberian encephalitis)，俄罗斯春夏型脑炎(Russian Spring-Summer encephalitis)，夸塞纳森林病(Kyasanur ForestDisease)，鄂木斯克(Omsk)出血热，跳跃病(Louping ill)，Powassan，Negishi，Absettarov，Hansalova，Apoi，和Hypr病毒；以及来自丙型肝炎病毒属(Hepacivirus genus)(例如丙型肝炎病毒)的病毒。其它黄热病毒株，例如YF 17DD(GenBank保藏号U 17066)，YF 17D-213(GenBank保藏号U17067；dos Santos等，Virus Res.3535-41，1995)，和Galler等，Vaccines16(9/10)1024-1028，1998所述的黄热病毒17DD株也可用作根据本发明异源结构蛋白可插入的骨架病毒(backbone virus)。
每种上面所列的病毒都有感染内脏器官的一些倾向性。这些病毒的趋内脏现象可造成有活力的内脏器官的机能障碍，如在YF疫苗-相关性的不利疾病事件中观察的那样，只是很不频繁。病毒在这些器官中的复制也可造成病毒血症，并因此对侵入中枢神经系统起作用。因此，根据本发明通过诱变来降低这些病毒的趋内脏现象，能降低病毒导致不利的趋内脏疾病和/或侵入脑并导致脑炎的能力。
本发明的突变对病毒产生有利作用，包括例如，减毒作用、稳定性和/或复制增加。所述突变存在于膜蛋白，例如在膜蛋白的跨膜区或胞外结构域中。例如，突变可以在膜蛋白的第60位或66位氨基酸和/或在预测的跨膜区的其它氨基酸中(例如在40-75位氨基酸的任何一或多个)，或在M蛋白质的N-末端胞外结构域(例如M-5)。作为一个具体例子，膜蛋白的第60位氨基酸(在野生型日本脑炎病毒中的精氨酸)可以被另一种氨基酸如半胱氨酸替代。在ChimeriVaxTM-JE病毒的M-60位置从精氨酸到半胱氨酸的替代显著地降低了临床试验中病毒在人类中的病毒血症(趋内脏现象)，在临床试验中检验了带和不带M-60突变的疫苗变体(表11A和11B)。除了半胱氨酸，其它氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸等可以替代在膜蛋白第60位的野生型氨基酸。在另一个例子中，膜蛋白的第66位氨基酸(在野生型西尼罗病毒中的亮氨酸)可以被另一种氨基酸如脯氨酸替代。除了脯氨酸，其它疏水氨基酸如异亮氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸、或小氨基酸如丙氨酸或甘氨酸，可以替代在膜蛋白第66位的野生型氨基酸。如本文所述，这些突变也可存在于其它黄病毒的对应氨基酸中。
在膜蛋白序列可以进行的替代的其它例子，在第61，62，63，和/或64位的氨基酸可以被在第60位的突变、在第66位的突变、和/或其它突变以单独或彼此组合的方式来替代。在西尼罗病毒膜蛋白序列中的这些位置的替代例子包括在61位的缬氨酸到丙氨酸，在62位的缬氨酸到谷氨酸或甲硫氨酸，在63位的苯丙氨酸到丝氨酸，和在64位的缬氨酸到异亮氨酸。如本文所述，这些突变也可存在于其它黄病毒的对应氨基酸中。
在JE病毒膜蛋白序列的这些位置或其周围的替代例子包括，剩下的20种氨基酸的任一种，预料到会获得对于趋内脏现象和/或在制备中疫苗病毒在细胞培养物中的复制/稳定性的理想效果。在嵌合的或非嵌合的黄病毒中的其它例子包括，在M蛋白质N-末端胞外结构域内由蛋白质的第1-～40位残基中的单独或组合的任何氨基酸替代，以及引入M蛋白质的胞外结构域和/或跨膜结构域的多种大小的缺失(例如1，2，3，4，5，等个氨基酸长)。
除了一或多个上述的膜蛋白突变，本发明的病毒也可包含一或多个其它突变。例如，对于西尼罗病毒，这种其它突变可以在西尼罗病毒包膜蛋白的第107位(例如L到F)、316位(例如A到V)、或440位(例如K到R)(或其组合)的区域。因此所述突变可以，例如，在西尼罗包膜蛋白的第102-112、138(例如E到K)、176(例如Y到V)、177(例如T到A)、244(例如E到G)、264(例如Q到H)、280(例如K到M)、311-321、和/或435-445位氨基酸的一或多个中。一个具体的例子是，用西尼罗病毒株NY99-火烈鸟(flamingo)382-99的序列(GenBank登录号AF196835)作为参照，在第107位的赖氨酸可以被替换为苯丙氨酸，在第316位的丙氨酸可以被替换为缬氨酸，和/或在第440位的赖氨酸可以被替换为精氨酸。可突变的氨基酸的其它组合的例子包括如下176、177、和280；176、177、244、264、和280；以及138、176、177、和280。进一步地，如本文所述，这些突变也可以存在于其它黄病毒的对应氨基酸上。
ChimeriVaxTM-JE疫苗已经包含所有上述的SA14-14-2具体突变，因为它包含了SA14-14-2-特异性JE包膜。也可基于对E蛋白质的结构/功能的了解来选择并引入在E蛋白质中的其它氨基酸的改变以进行另外的减毒(例如如下所述)。如本文所述，这些突变也可以存在于其它黄病毒的对应氨基酸中。
除了上述的氨基酸，可以用其它氨基酸，如会产生上述的那些保守改变的氨基酸，来作替代。保守替代通常包括在如下组内的替代甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、和亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸和酪氨酸。
本发明的病毒(例如日本脑炎和西尼罗病毒，以及包含来自这些或其它黄病毒的膜和包膜蛋白的嵌合黄病毒)除了上面讨论的突变(例如膜蛋白突变)，也可包含在包膜蛋白的铰链区或疏水袋中的一或多个突变，因为这些突变已经显示导致趋内脏现象减少(Monath等，J.Virol.761932-1943，2002；WO 03/103571 A2；WO 05/082020；Guirakhoo等，J.Virol.78(18)9998-10008，2004)。包膜蛋白的多肽链折叠成三个独特的结构域中心结构域(结构域I)，二聚化结构域(结构域II)，和免疫球蛋白样调控结构域(结构域III)。所述铰链区存在于结构域I和II之间，并在暴露于酸性pH时包膜蛋白三聚体形成的构象改变(因此命名为“铰链”)，所述三聚体在通过受体介导的胞吞作用摄入病毒后参与病毒和内体(endosomal)膜的融合。在构象改变之前，蛋白质以二聚体形式存在。
大量包膜氨基酸存在于铰链区中，包括例如，黄热病毒的第48-61，127-131，和196-283位氨基酸(Rey等，Nature 375291-298，1995)。可以根据本发明来突变任何这些氨基酸，或紧邻的氨基酸(和在其它黄病毒包膜蛋白中的对应氨基酸)，并检测减毒作用。特别感兴趣的是在铰链区疏水袋内的氨基酸。作为一个具体的例子，在包含插入黄热病毒载体内的登革1型包膜蛋白序列的嵌合黄病毒内，替代铰链区疏水袋内的包膜蛋白的第204位氨基酸(K到R)，已经显示产生了减毒作用(Guirakhoo等，J.Virol.789998-10008，2004)。此替代会使包膜蛋白的结构改变，从而破坏在野生型蛋白质的一个和另一个包膜单体之间的分子间氢键，并用单体内的新的分子内相互作用来替代。此观察结果提出一种意见，此替代所产生的减毒作用是由于使融合前构象中的蛋白质结构发生改变的这些新的相互作用，这很可能是通过改变使病毒膜与宿主细胞融合所需的pH阈值，并为设计进一步的减毒突变体提供基础，在所述突变体中其它替代可用于提高在疏水袋中的分子内相互作用，导致减毒。可以在疏水袋内进行的、并包含在本发明病毒内的这些突变/替代的例子，包括在E202K、E204K、E252V、E253L、E257E、E258G、和E261H中的替代(和在其它黄病毒中的对应替代)。可以基于对同源蛋白质结构的了解，来设计并掺入在JE和WN病毒的E蛋白质的对应区中的任何氨基酸改变。
E基因包含功能性功能域，在其中的氨基酸改变可能会影响功能从而降低毒力，如Hurrelbrink和McMinn所述(Adv.Virus Dis.601-42，2003)。其中可以插入突变的E蛋白质功能区与本申请所述的膜缺失/突变一起，可以得到适当减毒的疫苗，该疫苗包含a)在结构域III外表面上的公知受体结合区，b)结构域I和II之间的分子铰链区，该分子铰链区决定了内体中E蛋白质的酸性依赖性构象改变并降低了病毒内化的有效性；c)prM和E蛋白质的界面，即在内体中暴露于低pH后从二聚体重排为三聚体之后，与prM交界的E蛋白质的区；d)结构域II的融合结构域的顶端，其涉及到在内化过程中与内体的膜的融合；和e)茎-锚定区，它也在酸性诱导的融合过程中在涉及E蛋白质的构象改变中起作用。
可以与一或多个膜蛋白突变一起本发明病毒中的其它减毒突变，包括在黄热病毒骨架的3’未翻译区中的突变。图1A显示了黄热病毒疫苗株YF 17D的3’UTR的组构，这是所有ChimeriVaxTM病毒共同具有的。它从3’末端起顺序包含了(i) 3’-末端茎-和-环结构，已经假设该结构起负链RNA合成启动子的作用并且在所有黄病毒都是保守的，(ii)两个保守的序列元件CS1和CS2，这两个元件与所有蚊媒的黄病毒共享高度的核苷酸序列同源性，和(iii)西非(West African)黄热病毒株包括YF17D疫苗病毒所特有的、位于3’UTR的上游部分的重复序列元件(RS)的三个拷贝(Chambers等，Annu.Rev.Microbiol.44649-688，1990)。3’UTR也包含多个茎环-结构，如在RS元件下游的非保守区的那些，见图1B所示。
在本发明病毒中包含的3’UTR突变通常是短的减毒型缺失，例如不足30个核苷酸(例如1，2，3，等和最多29(例如2-25，3-20，4-15，5-10，或6-8个核苷酸长)；美国专利申请60/674,546和60/674,415)。在一些例子中，设计短的3’UTR缺失来使3’UTR中一或多个茎结构的二级结构不稳定。除了缺失，这些结构中的突变也包含同样导致茎结构不稳定化的替代。在某些例子中，经过突变的茎环-结构存在于3’UTR的非保守区中或在能够耐受这些突变的保守区中(例如在CS2中)。例如，使茎不稳定的突变可以存在于图1B所示的任何一或多个预测的茎结构中，图1B显示了这些缺失的四个例子(dA，dB，dC，和dD)。因此，除了这些具体的例子外，在黄热病毒中的3’UTR突变的其它例子包括包含例如如下茎序列的1-2、3-8、4-7或5-6个核苷酸的突变，这些突变在图1B中从5’到3’显示为TGGAG，CTCCA，GACAG，TTGTC，AGTTT，GGCTG，CAGCC，AACCTGG，TTCTGGG，CTACCACC，GGTGGTAG，GGGGTCT， AGACCCT，AGTGG，和TTGACG。如本文所述，这些突变也可存在于其它黄病毒的对应氨基酸上。
除了使茎不稳定的突变，3’UTR中的其它短缺失可以和一或多种膜(和可能的其它)突变一起包含在本发明病毒中。例如，可以使用之前描述的Δ30突变(Men等，J.Virol.703930-3937，1996；美国专利6,184,024 B1)或在此序列中的多个突变。因此，例如，本发明包含在此区域内的1，2，3，等并且最多29(例如1-25，2-20，3-15，4-14，5-13，6-12，7-11，8-10，或9)个核苷酸长的任何可行的缺失。作为具体的例子，本发明病毒可包含缺失d7，其中YF17D的此区域中的如下核苷酸缺失核苷酸345-351(AAGACGG；从3’UTR的第一个核苷酸开始编号，在病毒ORF的UGA终止密码子之后；图1A)。本发明也包含包括从此序列3’或5’末端起缺失例如1，2，3，4，或5个另外的核苷酸的突变。在其它例子中，本发明包括在保守序列CS1和CS2中的短缺失。这些突变可以包括缺失这些序列的例如1-29，2-25，3-20，4-15，5-10，或6-8个核苷酸。作为两个具体的例子，从YF17D-特异性3’UTR的CS2缺失核苷酸360-364(GGTTA；CS2d5；图1A)和/或核苷酸360-375(GGTTAGAGGAGACCCT；CS2d16；图1A)。也可使用包括从此序列3’或5’末端起缺失例如1，2，3，4，或5个另外的核苷酸的突变。对于其它黄病毒的3’UTR，可以基于3’UTR’s的二级结构作类似的突变。已经公布了对其它黄病毒例如登革，Kunjin和TBE(见例如Proutski等，Virus Res.64107-123，1999)和HCV(见例如Kolykhalov等，J.Virol.703363-3371，1996)的3′UTR的二级结构的预测。进一步的，从GenBank可以得到代表了所有四个主要血清复合物(YF，JE，登革，和TBE)的很多黄病毒株的多个3′UTR核苷酸序列。可以通过病毒测序来确定其他株的序列。用标准软件(例如mfold或RNAfold程序)可以简单地预测这些序列的二级结构，从而揭示可进行诱变的潜在茎-环结构。
应注意到黄病毒包括YF 17D病毒的3’UTR的真实二级结构是未知的，因为现在没有方法可以通过试验来证实它们在完整病毒背景中的存在，因此已经公布的预测，例如由Proutski及合作工人(图1B)对YF 17D所作的预测可能是不正确的。在相对长的RNA分子中可以预测形成很多可选择的结构(Zuker等，N.A.R.192707-2714，2001)，并且在病毒生活周期的不同阶段可以形成不同的结构(正或负链)并起作用。真实的结构可以受到各种假结(pseudoknot)的形成(Olsthoom等，RNA 71370-1377，2001)和远程(longrange)RNA相互作用(例如RNA环化和其它相互作用(Alvarez等，J.Virol.796631-6643，2005))，以及可能的宿主与病毒蛋白质的RNA相互作用的影响。为使理论上的计算机预测的公布结果的解释复杂化，通常使用手工操作，如部分序列的最初折叠，随后使最初预测的结构进入较长RNA序列的结构中，在最初折叠步骤中的N’s人工应用，和对优选结构元件的主观选择(例如Mutebi等，J.Virol.789652-9665，2004)。因此，我们用常用的Zuker’s预测算法来折叠YF 17D的3’UTR RNA序列。图1C显示了预测的最佳结构，它与图1B所示的Proutsky预测不同。重要的是图1A和1B中的小缺失dA，dB，dC，dD，d7，和d14通常使预测的天然YF 17D的最佳(图1C)和亚最佳(suboptimal)结构不稳定。图1D显示了一个这样改变的(对于dC突变体)最佳结构的例子。与此相对，CS2d5和CS2d16缺失(图1A和1B)不会明显改变最佳的天然结构，表明借助于改变CS2自身而不是3’UTR结构的序列或可选择的通过改变一些亚最佳结构，这些缺失可能使病毒减毒(在ChimeriVaxTM-WN的仓鼠模型中显示出减毒作用)。因此，即使一些缺失是基于Proutski结构预测设计的(图1B)，它们的真实作用可能是由于使图1B中的不同结构元件而不是预测的茎-环不稳定。
本发明病毒包含的与膜蛋白(以及可能的其它)突变一起的其它突变是在衣壳蛋白内的短缺失突变(例如1，2，3，或4个氨基酸的突变)。假设参照YF 17D病毒衣壳蛋白，这种突变的例子包括影响蛋白质螺旋I的可行的缺失(见图2A)。这样的突变的具体例子是突变C2，其包含螺旋I中氨基酸PSR的缺失(图2A)。可以检测在此区域中的其它短突变(以及在其它黄病毒序列中的对应突变)的可行性(viability)和减毒作用，并且也可将其在本发明中使用。已经公开了其它黄病毒例如TBE，WN，Kunjin，JE，和登革病毒的衣壳蛋白序列(例如Pletnev等，Virology 174250-263，1990)。
如下是嵌合黄病毒的具体例子，它们根据布达佩斯条约的条款保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)Manassas，Virginia，U.S.A，并给予1998年1月6日的保藏日期，它们可用于制备本发明的病毒嵌合的黄热17D/2型登革病毒(YF/DEN-2；ATCC登录号ATCC VR-2593)和嵌合的黄热17D/日本脑炎SA14-14-2病毒(YF/JE A1.3；ATCC登录号ATCC VR-2594)。在本发明中可用的制备嵌合病毒的细节披露在例如，美国专利6,696,281 B1；国际申请PCT/US98/03894(WO 98/37911)和PCT/US00/32821(WO 01/39802)；和Chambers等，J.Virol.733095-3101，1999以及下文中。通过包括将本文所述的一或多个突变引入要插入序列(例如日本脑炎病毒或西尼罗病毒的膜蛋白或其它序列)的步骤来改进这些方法用于本发明。可用于制备本发明病毒的方法也披露在PCT/US03/01319(WO 03/060088 A2；也见下)中。
可以用标准方法如定点诱变来对本发明的病毒作突变。在本发明病毒中存在的突变类型的一个例子是替代，但也可使用其它类型的突变如缺失和插入。另外，如上所述，突变可以单独存在或在一或多个其它突变范围内存在，无论是在膜蛋白自身内还是在例如3’UTR、衣壳、或包膜的序列的任意组合中。
本发明的病毒(包括嵌合体)可以用本领域的标准方法来制备。例如，对应于病毒基因组的RNA分子可以被引入原代细胞(primary cell)、鸡胚胎、或二倍体细胞系，然后可以从其(或其上清)纯化后代病毒。可以用于制备所述病毒的其它方法使用了异倍体细胞，如非洲绿猴肾细胞(Yasumura等，NihonRinsho 211201-1215，1963)。在此种方法中，将对应于病毒基因组的核酸分子(例如RNA分子)引入异倍体细胞，从已经培养了所述细胞的培养基中收获病毒，并且用核酸酶(例如降解DNA和RNA的内切核酸酶如BenzonaseTM；美国专利5,173,418)处理收获的病毒。在BenzonaseTM的情况下，可以用15单位/mL，并且将经调节的培养基在2-8℃冷冻约16小时或更长时间来消化核酸。然后浓缩(例如通过使用分子量阈值为例如500 kDa(例如Pellicon-2Mini unltrafilter cassette)的滤器作超滤)用核酸酶处理的病毒，用无酚红或FBS的MEME透析滤过(diafiltered)，通过加入乳糖来配制，并且过滤到无菌容器中。在WO 03/060088A2中披露了这种方法的细节。进一步地，如下所述，用于本发明病毒的增殖的细胞可以在无血清培养基中生长。
本发明的病毒可作为初次预防性药剂(primary prophylactic agent)施用给处于感染风险的那些患者，或者可用作再次的(secondary)药剂用于治疗受感染的患者。因为病毒是减毒的，它们特别适于施用给“有风险的个体”如年老者、儿童或HIV感染者。所述疫苗也可用于兽医范围，例如对马进行抗西尼罗病毒感染的疫苗接种，或对家养宠物(例如猫、狗和禽类(birds))、牲畜(例如绵羊、牛、猪、禽类和山羊)、和有价值的动物如稀有鸟类进行疫苗接种。进一步地，本发明的疫苗可包含病毒如嵌合病毒，所述病毒包含具体的突变(例如M5，M60，和/或M66突变)并与缺乏这种突变的病毒混合。
可用本领域的标准方法配制本发明的病毒。用于疫苗配制的多种可药用的溶液是公知的，本领域技术人员可以容易地将它们适用于本发明中(见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(18thedition)，ed.A.Gennaro，1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA)。在两个具体例子中，在含7.5％乳糖和2.5％人血清清蛋白的极限必需培养基Earle’s Salt(MEME)中或含10％山梨醇的MEME中配制病毒。然而，可以在生理可接受的溶液如无菌生理盐水或无菌缓冲盐水中简单地稀释病毒。在另一个例子中，例如可以与黄热17D疫苗相同的方式，将病毒被给药和配制为例如被感染的鸡胚胎组织的澄清悬液，或从用嵌合的黄热病毒感染的细胞培养物收获的液体。
可以用本领域公知的方法施用本发明的疫苗，并且本领域技术人员可以容易地确定待施用疫苗的合适量。通过考虑因素如例如待施用病毒的受试者的大小和总体健康，可以确定待施用病毒的合适量。例如，可以将本发明的病毒配制为将要通过例如经肌肉内、皮下或皮内途径施用的、在0.1到1.0ml的剂量体积中包含102到108、例如103到107或104到106个感染单位(例如形成-蚀斑的单位或组织培养物感染剂量)的无菌水溶液。另外，因为黄病毒可能经粘膜途径如口服途径来感染人宿主(Gresikova等，“Tick-borneEncephalitis，”In The Arboviruses，Ecology and Epidemiology，Monath(ed.)，CRC Press，Boca Raton，Florida，1988，Volume IV， 177-203)，也可以通过粘膜(例如口服)途径施用病毒。进一步地，本发明的疫苗可以以单一剂量施用，或可选地，施用可涉及使用致敏剂量随后是本领域技术人员确定的合适的在例如2-6个月后施用的一或多个加强剂量。
可选择地，在施用本发明的病毒中可以使用本领域技术人员已知的佐剂。可以用来提高病毒免疫原性的佐剂包括，例如脂质体配制剂、合成佐剂如(例如QS21)、胞壁酰二肽、单磷脂(monophosphoryl lipid)A、或polyphosphazine。尽管这些佐剂通常用于提高对灭活疫苗的免疫应答，它们也可与活疫苗一起使用。在经粘膜途径传递的病毒的情况下，可用例如，口服型或粘膜型佐剂如大肠杆菌(E.coli)的热不稳定毒素(LT)或LT的突变衍生物作为佐剂。另外，可将编码具有佐剂活性的细胞因子的基因插入病毒。因此，编码细胞因子(如GM-CSF，IL-2，IL-12，IL-13，或IL-5)的基因可与外源抗原基因一起插入来制备疫苗，所述疫苗会提高免疫应答或调控更具体针对细胞、体液或粘膜应答的免疫。可以在本发明中可选择应用的其它佐剂包括toll-样受体(TLR)调控物。
在登革病毒和/或包含登革病毒的膜和包膜蛋白的嵌合黄病毒的情况下，针对它们的最佳免疫接种可以涉及诱导对抗所有四种登革血清型的免疫，本发明的病毒可以用于四价疫苗的配制中。如本文所述，在这些四价配制剂中使用的任何或所有病毒可以包含降低趋内脏现象的一或多个突变。可以在配制中的任何时间点混合病毒来形成四价制品，或可以连续地施用所述病毒。在四价疫苗的情况下，可以使用等量的每种病毒。可选择的，在所施用的疫苗中每种不同病毒的量可以变化(WO 03/101397 A2)。
本发明也包含对应于本文所述的本发明病毒基因组的核酸分子(例如RNA或DNA(例如cDNA)分子)或其互补物。例如，在本发明病毒的制备方法中可以使用这些核酸分子。在这些方法中，对应于病毒基因组的核酸分子被引入可产生并复制病毒的细胞(例如原代细胞、鸡胚胎、二倍体细胞系、或异倍体细胞系(例如非洲绿猴肾细胞))中，然后可从其(或其上清)纯化后代病毒。如本领域已知，这些方法进一步包含病毒的纯化步骤。
如上所述，制备在本发明可用的嵌合病毒的细节披露在例如，美国专利6,696,281 B1；国际申请PCT/US98/03894(WO 98/37911)和PCT/US00/32821(WO 01/39802)；和Chambers等，J.Virol.733095-3101，1999中。如下提供了构建包含日本脑炎病毒(或西尼罗病毒)的前体-膜(pre-membrane)和包膜蛋白、以及黄热病毒的衣壳和非结构蛋白的嵌合黄病毒的细节。本领域技术人员可以容易地对这些方法作改变来用于构建包含上述突变的嵌合体以及包含其它前体-膜和包膜序列的嵌合体。
简言之，YF/JE嵌合体的衍生化可以涉及如下内容。YF基因组序列在两个质粒(YF5′3′IV和YFM5.2)中复制，所述质粒编码YF序列的核苷酸1-2,276和8,279-10,861(YF5′3′IV)和1,373-8,704(YFM5.2)(Rice等，The NewBiologist 1285-296，1989)。通过连接从这些质粒衍生的适当限制片段来产生全长的cDNA模板。然后用从prM蛋白质的起始(478位核苷酸，128位氨基酸)到E/NS1切割位点(2,452位核苷酸，817位氨基酸)的对应JE序列替代在YF5′3′IV和YFM5.2质粒内的YF序列。
从JE SA14-14-2株制备真正的JE结构蛋白基因的克隆，JE SA14-14-2株是JE的活的减毒疫苗株；它可以从疾病控制中心(the Centers for DiseaseControl)，Fort Collins，Colorado和耶鲁虫媒病毒研究组(the Yale ArbovirusResearch Unit)，Yale University，New Haven，Connecticut得到，这两个机构是在美国由世界卫生组织-指定的虫媒病毒参考中心(Reference Centers))。获得在PDK-5传代水平的JE SA14-14-2病毒并在LLC-MK2细胞中传代来获得足够量的用于cDNA克隆的病毒。所用的策略涉及克隆在NheI位点(JE的1,125位核苷酸)重叠的两个片段中的结构区，然后可将其用于体外连接。
从被感染的LLC-MK2细胞的单层细胞提取RNA，并且用逆转录酶和含嵌套式XbaI和NarI限制位点的负义(negative sense)引物(JE核苷酸序列2,456-71)进行负义cDNA的第一链(first strand)合成，这两个位点分别用于首先克隆到pBluescript II KS(+)中和随后克隆入YFM5.2(NarI)中。在第一链cDNA合成后，用相同负义引物和正义引物(JE核苷酸序列1,108-1,130)进行JE序列的核苷酸1,108-2,471的PCR扩增，所述正义引物含有分别用于克隆到pBluescript中和YFM5.2(NarI)中的嵌套式XbaI和NsiI限制位点。通过限制酶消化和核苷酸测序来确认JE序列。通过使用对应于JE的1,116到1,130位核苷酸的负义引物和对应于JE的1到18位核苷酸的正义引物作负链JEcDNA的PCR扩增，来衍生JE核苷酸序列的1到1,130位核苷酸，这两种引物都含有EcoRI限制位点。将PCR片段克隆到pBluescript中，通过核苷酸测序确认JE序列。总而言之，这表明克隆了JE序列的1-2,471位核苷酸(1-792位氨基酸)。
为了在YF E/NS1切割位点插入JE包膜蛋白的C末端，通过对在E/NS1切割位点(YF的2,447-2,452位核苷酸，816-817位氨基酸)的信号肽酶序列作寡核苷酸定点诱变，将独特的NarI限制位点引入YFM5.2质粒来产生YFM5.2(NarI)。检测自掺入此改变的模板衍生的转录物的感染性，并产生了类似于亲本模板的特异性感染性(约100个蚀斑-形成单位/250纳克转录物)。用独特的NsiI和NarI限制位点，将JE序列的1,108到2,471位核苷酸从多个独立的PCR-衍生的pBluescript/JE克隆亚克隆到YFM5.2(NarI)中。通过PCR扩增衍生含与JE prM-E区邻接的YF 5′未翻译区(1-118位核苷酸)的YF5′3′IV/JE克隆。
为衍生出含YF衣壳和JE prM的接头的序列，用跨越此区的负义嵌合引物与对应于YF5′3′IV的6,625-6,639位核苷酸的正义引物来制备PCR片段，然后用该PCR片段作负义PCR引物，与正义引物联合扩增JE序列(在pBluescript载体中反向编码)的第477位核苷酸(prM蛋白质的N-末端)到在第1,125位核苷酸上的NheI位点，该正义引物互补于EcoRI位点上游的pBluescript载体序列。用NotI和EcoRI限制位点将所得的PCR片段插入YF5′3′IV质粒。此构建体包含在YF 5′-未翻译区之前的SP6启动子，之后是序列YF(C)JE(prM-E)，并包含体外连接所需的NheI位点(JE的1,125位核苷酸)。
为了使用JE包膜序列内的NheI位点作为5′体外连接位点，去除YFM5.2质粒中的多余NheI位点(5,459位核苷酸)。这通过YF序列在5,461位核苷酸(T C；丙氨酸，1820位氨基酸)的沉默突变来实现。将此位点通过与合适的限制片段连接来掺入YFM5.2，并通过与编码嵌合的YF/JE序列的NsiI/NarI片段交换来引入YFM5.2(NarI)/JE。
为产生用于体外连接的独特3′限制位点，改造在AatII位点下游的BspEI位点，其通常用于产生来自YF5′3′IV和YFM5.2的全长模板。(多重AatII位点存在于JE结构序列中，排除了此位点用于体外连接的用途)。通过YF的8，581位核苷酸(A C；丝氨酸，2,860位氨基酸)的沉默突变来产生BspEI位点，并通过与合适的限制片段交换来引入YFM5.2。此独特位点通过XbaI/SphI片段的交换来掺入YFM5.2/JE，并通过将合适限制片段作三个-片段的(three-piece)连接来掺入YF5′3′IV/JE(prM-E)质粒，所述限制片段来自这些亲本质粒和来自YFM5.2的衍生物(BspEI)，所述衍生物缺失在1到6,912位核苷酸的EcoRI位点之间的YF序列。
来自JE Nakayama株的克隆(已经在表达实验中深入表征了其诱导保护性免疫的能力)的cDNA(见例如McIda等，Virology 158348-360，1987；JENakayama株得自疾病控制中心，Fort Collins，Colorado，和耶鲁虫媒病毒研究组，Yale University， New Haven，Connecticut)，也用于嵌合黄病毒的构建。用现有的限制位点(HindIII到PvuII和BpmI到MunI)将Nakayama cDNA插入YF/JE嵌合质粒，来替代在两个质粒系统中的完整prM-E区，但只完整保留了一个氨基酸，在49位的丝氨酸，其用来利用用于体外连接的NheI位点。
产生全长cDNA模板的方法基本如Rice等，(The New Biologist 1285-96，1989)所述。在嵌合模板的情况，用NheI/BspEI消化质粒YF5′3′IV/JE(prM-E)和YFM5.2/JE，并用300纳克纯化片段在T4 DNA连接酶存在时进行体外连接。用XhoI将连接产物线性化以允许失控(run-off)转录。用50纳克的纯化模板来合成SP6转录物，通过掺入3H-UTP来定量，并用非变性的琼脂糖凝胶电泳来证明RNA的完整性。使用此方法的产量在每个反应5到10微克RNA的范围，其大多以全长转录物存在。如Rice等，所述(见上文)在阳离子脂质体存在时进行YF 17D的RNA转录物的转染，来制备嵌合病毒。
在嵌合黄病毒包含西尼罗病毒和黄热病毒序列的情况下，也可使用上述的双-质粒系统。在一个例子中，从WNV火烈鸟分离物383-99，序列GenBank登录号AF196835，克隆所用的西尼罗(WN)病毒prM和E基因。通过RT-PCR(XL-PCR Kit，Perkin Elmer)获得病毒prME cDNA。用Pwo聚合酶(Roche)通过重叠-延伸PCR将WN prM基因的5’末端精确克隆到YF 17D衣壳基因的3’末端。也通过重叠-延伸PCR将E基因的3’末端精确克隆到YF NS1编码序列的5’末端。将沉默突变引入prM和E的序列，产生独特的限制位点Bsp EI和Eag I。将这些酶消化两个质粒所产生的DNA片段经过凝胶纯化及体外连接来制备全长嵌合的cDNA。将cDNA用Xho I线性化来利于通过SP6聚合酶(Epicentre)作体外转录。将RNA产物引入允许病毒RNA翻译和病毒复制的真核生物细胞系。对于YF/JE嵌合体，如上所述，可将本发明的突变用标准方法引入如上所述的YF/WN嵌合体。
其它黄病毒嵌合体可用类似策略，用天然的或改造的限制位点，和例如表14所示的寡核苷酸引物来改造。
本发明部分基于在下述实施例所描述的试验结果。
实施例实施例1ChimeriVaxTM-WN试验结果背景和概述嵌合的黄热-西尼罗(YE-WN)病毒ChimeriVaxTM-WN是通过将WN病毒(NY99)的前体-膜(prM)和包膜(E)基因插入YF17D骨架来制备的。在于无血清条件下的非洲绿猴肾细胞(第5代传代物，P5)中制备此病毒，评估它在临床前模型中的安全性、免疫原性和有效性，并已经在人的I期研究中进行了试验。疫苗病毒(P5)的另外的减毒是由在E蛋白质中的三个SA14-14-2-特异性突变(残基107，316，和440)决定的。在通过IC途径接种的小鼠和猴和经过单次接种受到保护的小鼠、仓鼠和猴中试验时，该疫苗病毒的神经毒力比YF-VAX_弱(Arroyo等，J.Virol.7812497-12507，2004；Tesh等，Emer.Infect.Dis.81392-1397，2002)。该疫苗病毒含有混合种群(population)的病毒(显示出小的(S)和大的(L)蚀斑表型)，它们在M蛋白质第66位(M66)上有单个氨基酸残基差异。此突变不影响此病毒对8日龄乳鼠的神经毒力(Arroyo等，J.Virol.7812497-12507，2004)。在本发明中，我们描述了M66突变降低宿主中的病毒血症因此可用于提高现有疫苗(ChimeriVaxTM-WN02，P5，亲本和突变体病毒的混合种群)或大蚀斑变体(非突变体的)病毒的安全性的发现。
在于无血清条件下的非洲绿猴肾细胞中产生的P5 ChimeriVaxTM-西尼罗疫苗病毒的共有序列中，观察到T和C(CTA/CCA)的核苷酸异质性(～50％)。此突变会导致在膜(M)蛋白质的第66位残基(本文命名为M66突变)含有氨基酸脯氨酸(突变体)或亮氨酸(亲本野生型)的病毒的存在。在附带的序列附录中提供了ChimeriVaxTMWN02和ChimeriVaxTMWN02 M66变体的序列，其中也包含了这些蛋白质的氨基酸序列的比对。
西尼罗病毒的M蛋白质含75个氨基酸。通过将此蛋白质序列提交到http://www.predictprotein.org网站，来预测此蛋白质的结构并将其与JE SA14(AAA67174)、Kunjin(AAP78942)、MVE(CAA27184)、SLE MSI(AAP44973)、和SLE CORAN (AAP44972)的M蛋白质结构作比较。在所有预测的结构中，M蛋白质的开始40个氨基酸(SLTVQTHGESTLANKKGAWMDSTKATRYLVKTESW ILRN)被预测为非膜区，而剩余的35个氨基酸(40-75)(PGYALVAAVIGWMLGSNTMQRVVFVVLLLLVAPAYS)被预测为在病毒膜区内。另外，在开始40个氨基酸残基内有9-10个带电荷的氨基酸(3-4个酸性的，E或D)和6个碱性的(R或K)，而在所有本文所述的5种黄病毒(WNV，SLE，MVE，JE，和Kunjin)只有第60位残基的一个带电荷的氨基酸(碱性的)。因此，在病毒的生物学中M60残基可能通过在其邻近氨基酸内的相互作用而起关键作用。
P5疫苗病毒的蚀斑形态学显示出L和S蚀斑大小表型的混合种群。对P2，P3，P4，和P5病毒测序表明，突变最开始出现在P4(占总体种群的10％)并在P5达到～50％。对疫苗病毒的S和L蚀斑分离物的测序显示，突变造成了蚀斑大小从L到S的改变。S和L病毒变体(制备为研究病毒)在它们对8日龄乳鼠的神经毒力方面无显著不同(p＝＜0.0001)。
自ChimeriVaxTM-WN02(p5)，在“洁净实验室条件(clean laboratorycondition)”通过3轮直接的蚀斑到蚀斑纯化和2轮病毒扩增，在非洲绿猴肾细胞中制备L和S病毒的Pre-Master Seed(PMS，P10)原种。对P10 S和L病毒的测序显示在M66残基的单个氨基酸差异(S病毒在M66残基含脯氨酸，而L病毒在此位点含亮氨酸)。M66突变在大规模制备条件下似乎是稳定的。当通过皮下接种将S蚀斑病毒(P10，PMS)接种到仓鼠中时，它诱导了与疫苗病毒(P5)或L蚀斑病毒变体(P10，PMS)相比很低水平的病毒血症。在接种了ChimeriVaxTM-WN P5病毒(含～50∶50的S和L蚀斑变体)的猴和人的血清中，大部分病毒是L蚀斑大小的表型。另外，显示S蚀斑在人肝癌细胞系中生长到比L蚀斑低的滴度。此数据表明S蚀斑病毒(带有M66突变的ChimeriVaxTM-WN02)可能在人类中诱导比ChimeriVaxTM-WN02(无M66突变)低的水平的病毒血症，因此可成为针对“有风险个体”(如老年人、儿童或HIV感染者)合适的(安全的)WN疫苗候选物。通过测序个别蚀斑发现在M区内的其它突变，这些个别蚀斑分离自来自P10到P12或接种了ChimeriVaxTM-WN02疫苗(例如M60，M61，和M63)的猴子的PMS S蚀斑的大规模制备传代物(例如M62，M63和M64)。这些突变可以用于本发明病毒的构建中。
在非洲绿猴肾细胞中S和L蚀斑病毒的PMS的制备使ChimeriVaxTM-WN02疫苗材料(P5)在无血清非洲绿猴肾细胞中生长；挑取10个鉴定为“小的”(S)蚀斑和10个鉴定为“大的”(L)蚀斑。然后在无血清非洲绿猴肾细胞上传代每个分离物，并从每个分离物挑取一个蚀斑。再重复此过程一次，总共三轮蚀斑纯化。在含无血清非洲绿猴肾细胞的T25cm2烧瓶中扩增经过蚀斑纯化的分离物(P8)(并在无血清(SF)培养基中生长)，然后收获并储存在-80℃。测序分离物以发现无假性(spurious)突变的PMS候选物。鉴定两个分离物为无表达(非沉默)突变一个分离物被确认为小蚀斑(M66脯氨酸)(表1)而另一个包含wt序列(M66亮氨酸)(表2)。然后让这两个分离物在大烧瓶中生长，等量分份(aliquote)，并作为LP和SP PMS(P10)病毒提交到QC目录(inventory)。
大规模制备的SP病毒的遗传稳定性为确定S蚀斑表型在大规模制备过程中是否稳定，通过在生物反应器中感染非洲绿猴肾细胞并在无血清条件下令其生长来产生P12病毒，从而传代小蚀斑PMS病毒两次。收获P12病毒并在6-孔板中形成蚀斑(plaque)。大部分蚀斑是小尺寸的。挑取现存的二十个最大的蚀斑，在O-Vero上扩增(一次传代)，并经Titan One-Tube RT-PCR试剂盒(Roche)转录/扩增prME区。测序含M区的cDNA片段，并用WN特异性单克隆抗体经免疫染色确认分离物的形态学。在20个蚀斑中的十三个仅包含M66(导致SP形态学的遗传标记物)，并且5个分离物含有除M66之外的其它突变。分离物#4包含M63(LP表型)，而分离物#16包含wt和M66的混合种群。这些数据表明，尽管存在一些蚀斑显示出大尺寸的事实，它们还是包含M66突变并经扩增证明为S尺寸。20个中只有一个蚀斑(#4)显示为L尺寸，这明显是由于在M63从L到P的突变。蚀斑#16显示产生了大的和小的蚀斑尺寸病毒的混合种群，它们在M66位包含wt L和突变的P氨基酸(表3)。
ChimeriVaxTM-WN病毒变体在肝细胞中的生长用MOI 0.005的ChimeriVaxTM-WN01(野生型prME)、ChimeriVaxTM-WN02 P5(含在E107，E313，E316，E440，M66的混合L/P氨基酸的突变，混合的S和L蚀斑)、ChimeriVaxTM-WNLP(E107，E313，E316，和E440，WNL)、和ChimeriVaxTM-WN SP(E107，E313，E316，E440，和M66P，WNS)感染人肝癌细胞系HepG2和THLE-3细胞。每日收集上清并用标准的中性红双层琼脂糖覆盖(neutral red double agarose overlay)方法在O-非洲绿猴肾细胞上滴定。
在HepG2细胞中(图3)，观察到WN01(野生型prME)在第5天有最高的病毒生长(7×106PFU/ml)，随后是LP在第5天(2.7×106PFU/ml)。用YF-VAX_的情况中在第3天达到病毒峰值(1.17×106PFU/ml)，随后是WN02混合疫苗病毒在第4天达病毒峰值(6.4×105PFU/ml)。发现SP病毒生长最低(在第4天峰值滴度为6.1×105PFU/ml)，其包含在M66的单个氨基酸替代(L到P)。在THLE-3细胞中(图4)，观察到与HepG2细胞相同的模式，只是YF-VAX_的滴度稍高于LP病毒。再次见到WN01出现最高滴度(1.3×105PFU/ml，第4天)，随后是LP(5.7×104PFU/ml，第7天)，YF-VAX_(8.8×104PFU/ml，第4天)，和混合的P5病毒(1.8×104PFU/ml，第4天)。再次观察到SP病毒出现最低滴度(9.2×103PFU/ml，第4天)。
每天记录每种病毒对致细胞病变效应(CPE)的诱导(表4)。在第5天首次观察到WN 01和LP病毒的CPE，并且在2天后完成(100％)，而SP或混合的蚀斑群在较早的时间点(第3天)诱导CPE，并且比WN01或LP早1天(第6天)完全破坏细胞单层。在第3天首次观察到YF-VAX_的CPE诱导，并且在接种后第6天完全破坏单层细胞。在HepG2细胞中的CPE诱导可能是由于M蛋白质的凋亡活性，如野生型登革病毒所示(catteau等，J.Gen.Virol.842781-2793，2003)。这些数据显示SP病毒变体生长到比混合的或LP病毒低的滴度，这表明M66突变可能会降低病毒对人的肝趋性。
在用混合的(SP和LP病毒)P5疫苗病毒接种猴之后不能检测到ChimeriVaxTM-WN，SP病毒给总共8只缺乏对黄病毒如WN，JE，和YF病毒的可检测抗体的首次实验食蟹猴( cynomolgus monkeys)(通过蚀斑减少中和试验(PRNT)测定)通过皮下途径接种ChimeriVaxTM-WN02(P5)(n＝4)或YF-VAX_(n＝4)。此试验目的是评估ChimeriVaxTM-WN02疫苗在3日观察期内的病毒血症、生物分布和可能的毒性。对于ChimeriVaxTM-WN02和YF-VAX_，接种剂量分别为～1.25×105PFU/0.5mL和5.5×104PFU/mL。每日给动物放血并在接种后第4天处死。通过在非洲绿猴肾细胞上的标准蚀斑试验利用血来测定病毒血症水平，而收集到的组织要么速冻作病毒分析要么保存作组织病理评价。
评估从第1天(接种前)到第4天(安乐死(euthanization)前)收集到的猴血清的病毒血症。通过用琼脂糖双层覆盖物和中性红染色(来分离并测序各个蚀斑)或通过甲基纤维素覆盖物和结晶紫染色(来测定病毒血症水平)，如Monath等，J.Virol.74(4)1742-1751，2000所述来进行试验。在接种了ChimeriVaxTM-WN02的猴中病毒血症的量级(magnitude)和持续时间高于YF-VAX_的所述情况(表5)。对于YF-VAX_而言，病毒血症的最高滴度为200PFU/mL(动物MF21157，第4天)。对于ChimeriVaxTM-WN P5病毒而言，病毒血症的最高滴度为1000PFU/mL(动物MF21191F，第4天)。接种了ChimeriVaxTM-WN02病毒的所有动物(4/4)在接种后3天都是有病毒血症的，而只有2/4接种了YF-VAX_的动物变成有病毒血症的(仅有2天)(表5)。
因为接种了ChimeriVaxTM-WN02病毒的动物已经接受了SP和LP病毒的混合物，需要从血清中分离多种SP和LP病毒来鉴定导致高水平病毒血症的病毒变体(S或L)。将在接种后第2天到第4天获得的所有4只猴子的血清稀释到1∶2和1∶10，并用于接种到已种了非洲绿猴肾细胞的6-孔板的一式两份的孔中。在加入含中性红的第二层琼脂糖覆盖物后，挑取各个蚀斑(4个S的和3个L的蚀斑)，直接测序来鉴定M66突变体病毒的存在(表6)。这些分离的蚀斑无一含有M66突变(L到P替代)，这表明M66突变体病毒不会导致在这些动物中所检测的高水平病毒血症。有趣的是，在M区观察到3个其它突变(M60，M61，和M63)。这些病毒变体可能已经少量存在于ChimeriVaxTM-WN02疫苗病毒中(不能通过共有测序来检测)，或者它们通过LP病毒变体基因组内的突变而在(猴)体内产生。
在接种了ChimeriVaxTM-WN SP (PMS，P10)、LP (PMS，P10)、或混合(P5，SP，和LP)病毒的仓鼠中的病毒血症和中和型抗体应答在整个试验中，在BL2下的显微分离器(microseparator)中饲养(maintained)此试验中所用的动物并根据IACUC批准的动物规程来处置它们。用三株ChimeriVaxTM-WN02病毒(SP，PMS，P10；LP，PMS，P10，和混合SP和LP疫苗病毒，P5)来感染来自Harlan Sprague-Dawley的7周龄雌性Golden Syrian仓鼠(金仓鼠(Mesocricetus auratus))，将每种病毒经皮下途径注射到一组15只仓鼠的腹股沟区。感染剂量为105pfu，接种体积为100μl。给另外一组5只动物类似地注射100μl的病毒稀释物作为假性(sham)对照。在病毒感染当天(第0天)和直到感染后5天的随后的每一天，通过对除假性对照组之外的所有动物进行眶后采血来收集血样。在采血并接种前通过吸入异氟烷来麻醉动物。通过将0.1mL的1∶10稀释的血清样品在于12孔板中生长的非洲绿猴肾细胞培养物的一式双份孔中直接进行蚀斑形成，来测定被试样品中的病毒浓度(图5)。
如图5所示，在从LP病毒感染的仓鼠收集的血清样品中观察到较高水平(平均为pfu的3个log值(3 logs of pfu on average))的峰值病毒血症，而在SP病毒接种的仓鼠的血样中可见很低水平(＜10pfu)的病毒血症。当接种物中SP病毒的比率上升时(对于混合的蚀斑病毒达到50％)，峰值病毒血症滴度降低到LP病毒诱导的病毒血症水平的大约一半。另外地，感染后病毒血症峰值时间延迟了至少1到4天。
这些数据表明，从相同亲本病毒ChimeriVaxTM-WN02分离的LP和SP变体有不同的生物性质。LP病毒与SP病毒相比在仓鼠中以较快速度增殖到较高水平。另外，将SP病毒与LP(P5病毒)混合明显抵消了LP病毒的一些性质。这显示于仓鼠感染试验中，其中病毒在血中的存在降到较低水平，在混合病毒感染的仓鼠中的病毒复制动力学下降。总而言之，在SP变体病毒中存在的M66突变(L到P)显著降低了仓鼠中的病毒血症。
实施例2ChimeriVaxTM-JE和ChimeriVaxTM-DEN1-4背景和概述在下面描述的试验中，我们用在无血清(SF)培养基中生长的非洲绿猴肾细胞制备并定性了新的ChimeriVaxTM-JE种病毒(seed virus)，来消除对于疫苗可能被牛传播性脑病(bovine transmissible encephalopathy)的朊病毒因子(agent)污染的任何顾虑。在于SF培养物中增殖的过程中，未克隆的病毒累积了在含血清培养基中之前没有见到的突变，这些突变显示出对SF生长条件的适应性，即病毒复制速度提高。这些突变出现在E或M蛋白质(E-107的F到L或M-60的R到C突变)中，并提示M蛋白质在病毒复制过程中的功能性意义，这在病毒于SF条件下生长的过程中变得明显(见实施例1所示的M-蛋白质的60位氨基酸R(ChimeriVaxTM-WN)。定义了在M蛋白质中的突变(ChimeriVaxTM-JE中的M60，M5)或在E蛋白质中的突变(ChimeriVaxTM-JE中的E-107，ChimeriVaxTM-DEN1和-DEN3中的E202/204，和ChimeriVaxTM-DEN2中的E251)对于疫苗的生物性质的作用。所有这些嵌合病毒都已经在临床试验中经过了检测。
材料和方法细胞和培养基原来自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)得到非洲绿猴肾细胞(ATCC；Manassas，VA；CCL 81；非洲绿猴肾细胞)。这些细胞适合于在SF培养基中生长，并且从Baxter(Orth，Austria)获得第133代传代物，然后通过接种到烧瓶来直接使用或在136代传代物从细胞库开始接种。在所有的实验中，非洲绿猴肾细胞的传代水平不超过第149代。在7.5％CO2、36℃的条件使细胞和病毒生长。在SF条件增殖细胞。
ChimeriVaxTM-JE变体通过用体外RNA转录物(储存在-80℃)电穿孔SF非洲绿猴肾细胞来启动(initiate)病毒(P1代)，该体外RNA转录物与以前用于制备在临床前和临床试验中受检测的非-SF ChimeriVaxTM-JE疫苗候选物相同(Monath等，Vaccine201004-1018，2002)，其制备如前所述(Chambers等，J.Virol.733095-3101，1999)。通常在MOI为0.001pfu/细胞时作扩增传代，并在感染后3-4天收集病毒收获物(当CPE为～10％)，通过慢速离心来使其澄清，补充10％的山梨醇，并储藏在-80℃。在γ-照射的FBS(HyClone；使用FBS是因为在用SF培养基制备的琼脂中细胞未形成蚀斑)存在时，通过用标准的琼脂-中性红覆盖物方法作三次连续的蚀斑纯化，随后在SF条件扩增，从而在Baxter非洲绿猴肾细胞中制备克隆的变体。用单层甲基纤维素覆盖物方法，进行测定指定标本中的病毒滴度的蚀斑试验，并在感染后第5天通过结晶紫来目测蚀斑。
ChimeriVaxTM-DEN病毒通过用从病毒cDNA制备的RNA转录物电穿孔非洲绿猴肾细胞，来制备ChimeriVaxTM-DEN1-4疫苗病毒。对子代病毒进行三轮蚀斑纯化来产生第7代(P7)的Pre-Master Seed(PMS)病毒。用美国现行的食品良好制造规范(Good Manufacturing Practices，cGMP)再进行三次传代，来制备成批疫苗(vaccine lot)(P10病毒)。在于非洲绿猴肾细胞中多次传代后，在嵌合体E基因中显示出一些突变(Guirakhoo等，J.Virol.784761-4775，2004)。这些突变中的一种(ChimeriVaxTM-DEN1中的E 204)显著降低了病毒在非人的灵长类动物中的趋内脏现象(Guirakhoo等，J.Virol.789998-10008，2004)。
共有测序如上所述进行指定病毒样品的共有测序(Pugachev等，Vaccine20996-999，2003)。简而言之，用Titan One-Tube RT-PCR试剂盒(Roche)，将用TRIZOL LS试剂(Life Technologies-Gibco BRL)提取的病毒体RNA在～2-3kb长的5个重叠的cDNA扩增子中扩增。用正向的和反向的JE-和YF-特异性寡核苷酸引物的汇集物(collection)以及CEQ Dye Terminator CycleSequencing试剂盒(Beckman)来测序扩增子。用CEQ2000XL自动测序仪(Beckman Coulter)解析(resolve)测序反应产物。用Sequencher 4.1.4(GeneCodes)软件比对并分析数据。当在反映正链和负链测序反应的所有色谱图(chromatogram)中观察到异质性信号时，记录核苷酸异质性。对于一些病毒，五个cDNA扩增子中只有第一个(Fragment I)经测序显示包括结构基因。
在乳鼠中的神经毒力对小鼠的饲养和护理符合美国国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)对实验室动物的人道使用的指南。从Taconic Farms(Germantown，NY)购买怀孕的杂交繁殖的(outbred)ICR雌鼠。养育新生小鼠并在接种前6天混合成新组。通过脑内(IC)途径给分组的8日龄乳鼠接种0.02ml的指定病毒样品。在MEM-10％FBS中对用于接种的病毒进行1∶10连续稀释。反向滴定未稀释的接种物并计算每份稀释物的精确剂量。记录21天中的死亡率。YF17D对照病毒是从购买的疫苗小瓶重建的YF-VAX_(Aventis Pasteur，Swiftwater，PA)。
在猴中的安全性和有效性试验试验1.根据在食蟹猴中的GLP标准，研究新克隆C(M-60)ChimeriVaxTM-JE Vaccine Master Viral Bank(MVB；P11)和Production ViralBank(PVB；P12)原种与YF-VAX_对照(YF 17D疫苗病毒)相比的神经毒力/毒性分布图。将三十三只(33)首次用于实验的(experimentally- )、黄病毒-血清反应阴性的食蟹猴(用HAI试验确定)分配到表9所示的处理组。所有猴子都在第1天通过单次IC注射给予剂量，观察30天，然后安乐死并尸检。评价猴的临床指征(每日两次)，和摄食(每日)、体重(每周)、和临床病理指数(pathology indices)的改变。根据国际卫生组织(World Health Organization，WHO)对黄热疫苗的要求(WHO，Technical Report Series，No.872，1998)，根据临床计分系统来评临床得分。在第1天接种前和在第3、5、7、15和31天收集血样作临床病理分析(血清化学和血液学参数)。在第1天(给予剂量前(pre-dose))和第2-11天收集其它血样作定量病毒血症测定，以及在第1天(给予剂量前)和第31天收集其它血样作中和抗体滴度分析。在第31天作完整的尸检并收集组织来储藏。制备组织作肝、脾、心、肾和肾上腺的组织病理。根据Levenbook等(J.Biol.Stand.15305，1987)所述的方法来进行脑和脊髓的组织病理，并引入WHO对黄热疫苗的要求(WHO，1998)。
试验2.进行此试验来比较在将ChimeriVaxTM-JE疫苗[原来未克隆的疫苗P5，之前它在有FBS(BB-IND#9167，Serial#000)存在时于LS5非洲绿猴肾细胞中制备，它除了在E蛋白质疏水尾部的E491的L到F改变之外不含突变]和新的克隆C(M-60突变体)ChimeriVaxTM-JE纯化的成批疫苗制品(P13)根据GLP标准单次皮下(SC)施用到食蟹猴后，在30天的时间段中的病毒血症、免疫应答和安全性。将十八只(18)首次用于实验的、黄病毒-血清反应阴性的(通过HAI试验测定)食蟹猴如表10所示分配为处理组。给所有猴在第1天在一只臂的单个位置经SC注射给予一次剂量。评价猴的毒性临床指征(每日两次)、体重(每周)、和血清化学、血液学和凝血参数(coagulation parameter)改变。在第1天(接种前)和在第4、7、15和31天收集血样作血清化学、血液学和凝血参数分析。在第1天(接种前)和第2-11天收集其它血样作定量病毒血症分析，并在第1天(接种前)和在第31天收集其它血样作日本脑炎病毒-特异性血清抗体滴度分析。
病毒灭活的pH阈值(间接融合试验)将黄病毒暴露于低pH(细胞膜不存在时)的结果之一是对E蛋白质的不可逆构象改变和病毒灭活(失去潜能)的诱导。在细胞膜存在时，这些构象改变是病毒膜和那些细胞膜融合所必需的，导致病毒基因组释放到宿主细胞中。蚊媒病毒如WN、DEN、YF和JE融合的pH阈值可通过用蚊细胞系C6/36的内源性融合(fusion from within，FFWI)来测量(Guirakhoo等，Virology169(1)90-99，1989)。然而，所有我们的ChimeriVaxTM病毒都显示不出任何FFWI，这可能是由于缺乏这些病毒在蚊和蚊细胞系内的充分生长所致(Johnson等，Am.J.Trop.Med.Hyg.70(1)89-97，2004)。因此，我们尝试在这里命名为“间接融合试验”的试验中，测量在暴露于不同pH水平后病毒效力的丧失。此试验间接测定了病毒膜与那些细胞膜出现融合时的pH阈值。
在pH 7.0、6.8、6.6、6.4、6.2、6.0、5.8、5.6、5.4和5.0，用补充了2mML-谷氨酰胺、2.7％碳酸氢钠、10％HI FBS和1％抗生素/抗真菌溶液[(100U/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素，0.25μg/ml Amphotericin(Sigma)]并用MES(Sigma)调节到合适pH的1X MEM进行融合。将等量分份的每种病毒以1×104蚀斑形成单位(PFU)/ml在每个pH培养基中稀释(10-1稀释度)。在暴露于每个pH值10分钟之后，将50％热灭活的(HI)FBS加到每个小瓶中并用碳酸氢钠中和每份溶液的pH。用体积100μl的每个pH值的每种病毒感染非洲绿猴肾细胞单层(以9×105细胞/孔的密度接种，在6-孔板中)来测定其滴度。进行一式双份的感染，以产生50 PFU/孔；每个板保留两个未感染细胞的孔并用作阴性对照。取pH 7.0和6.8的样品作为参照物。用标准蚀斑试验分析滴度。在此试验中，用病毒的连续稀释物(10-1到10-6)感染非洲绿猴肾细胞的一式双份的孔。在感染后，用补充了2mM L-谷氨酰胺、2.7％碳酸氢钠、5％HI FBS、1％抗生素/抗真菌溶液[100U/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素，0.25μg/mlAmphotericin(Sigma)]、和44％的0.6％琼脂糖(Sigma)的1X MEM(Sigma)覆盖非洲绿猴肾单层细胞。在37℃，5％CO2温育细胞4天，然后用含1X MEM的第二层覆盖物覆盖，所述1X MEM中补充了2mM L-谷氨酰胺、2.6％碳酸氢钠、2％HI FBS、1％抗生素/抗真菌溶液、44％的0.6％琼脂糖、和3％中性红溶液(Neutral red solution)(Sigma)。在加入第二种覆盖物后24小时计数蚀斑，来测定用每毫升的蚀斑形成单位(PFU)定义的病毒滴度。
根据Vlaycheva等(J.Virol.766172-6184，2002)的病毒穿透入试验为证明M-60突变(和E-107突变)利于穿透入SF非洲绿猴肾细胞，用在SF培养基中适当稀释的克隆A，C，和I病毒感染SF非洲绿猴肾细胞5，10、20或60分钟，然后用0.1M甘氨酸，0.1M NaCl，pH 3.0处理3分钟来灭活胞外病毒。用PBS洗涤孔两次，然后用甲基纤维素覆盖单细胞层，之后用结晶紫在第5天染色蚀斑。穿透有效性用在甘氨酸处理后观察到的蚀斑数占用PBS而不是甘氨酸处理的对照感染孔的百分比来显示。
ChimeriVaxTM-JE的临床试验进行临床研究(规程H-040-003)。施用给健康成年雄性和雌性受试者的疫苗在M60(精氨酸)有天然序列。健康成年受试者/组接受了ChimeriVaxTM-JE疫苗的分级剂量的皮下剂量，包括多个对照组在内。每个剂量组试验11到33个受试者。通过在非洲绿猴肾细胞单层细胞中的蚀斑试验每日测定病毒血症。相同的实验和实验室测定了在两个实验中的病毒血症水平。
安全性评价包括对负面事件(adverse event)、体温、身体检查和实验室试验(包括病毒血症水平的测定)的记录。在大部分接受ChimeriVaxTM-JE的受试者中可见病毒血症。
在健康成年雄性和雌性受试者中进行第二项研究(规程H-040-007)，其中每组31或32名受试者接受含M60半胱氨酸突变的ChimeriVaxTM-JE的分级皮下剂量(3，4，或5log10PFU)。剂量范围与在前面研究中接受了2.8，3.8，和4.8log10PFU的受试者的剂量范围类似。
结果在未克隆的SF ChimeriVaxTM-JE病毒中的适应性突变，和克隆的变体的制品在此研究中制备的病毒样品的图如图6所示。在SF培养物中通过用体外RNA转录本转染细胞然后作另外的扩增传代来得到原来未克隆的2代传代物(P2)样品(Pre-Master Seed候选物；PMS)，所述体外RNA转录本已经用于在含FBS的培养基中制备疫苗以便用于之前的研究(Monath等，Vaccine201004-1018，2002)。测序此病毒的全基因组，并显示不含任何可检测的突变(表7)(注意共有测序方法不检测少数亚种群(minor subpopulation)；突变的检出限为～10％)。在T25烧瓶中进行从此P2病毒到P10水平的小规模传代，来分析其在SF培养物中延长繁殖时的遗传稳定性(g.s.)(图6；g.s.传代物)。g.s.P5和g.s.P10传代物的全基因组序列在935位核苷酸有从C到T的一个核苷酸改变，导致在M-60残基从R到C的氨基酸替代(表7)。此突变在g.s.P4传代物而不是g.s.P3首先被检测为异质性。
不管小规模遗传稳定性分析的结果，当在滚瓶中从未克隆的P2 PMS进行三次大规模SF传代物的制备以产生候选的未克隆主种子(Master Seed)(P3)和制备种子(Production Seed)(P4)，然后在100 L生物反应器中制备成批疫苗(P5)时，累积了不同的突变，以50∶50％异质性观察到，由于在核苷酸1301的T到C的改变而导致了在E-107残基的F到L的氨基酸改变(表7)。这是不可接受的突变，因为它是在关键的减毒残基的从SA14-14-2序列到野生型JE序列的回复突变(Arroyo等，J.Virol.75934-942，2001)，因此可能会减弱疫苗的安全性。
基于下面提到的考虑因素，然后通过蚀斑纯化产生克隆的PMS候选物，从而稳定SF疫苗并避免不需要的突变如E-107的累积。蚀斑纯化去除了在未克隆病毒中通过体外转录引入的随机突变，该随机突变的特征为RNA合成的保真度比用YF 17D特异性RNA聚合酶的病毒RNA合成的保真度低(Pugachev等，J.Virol.781032-1038，2004)。从未克隆的P2 PMS病毒开始，通过三次连续的蚀斑纯化随后两次在SF培养基中的扩增传代得到没有发生任何氨基酸替代的处于P7的生物克隆，克隆A病毒，它被命名为非-突变体P7克隆A PMS。其基因组在6952和7147位核苷酸包含两个沉默的核苷酸改变(表7)。这些改变是可接受的，因为它们不改变病毒蛋白质的氨基酸序列，并且位于高效病毒复制所需的顺式作用RNA元件之外。从P5g.s.病毒开始类似地制备含M-60突变的克隆C P10病毒(命名为M-60 P10克隆CPMS变体)(图6)。除了需要的M-60突变之外，它只在3616位核苷酸包含沉默的核苷酸改变(表7)。另外，后来也通过单次蚀斑纯化(选择大蚀斑)和在非洲绿猴肾细胞中的一次扩增传代，从未克隆的P5成批疫苗病毒分离了研究级别的克隆I和克隆E病毒。克隆I在E-107残基含有单个氨基酸改变，这是从氨基酸F到氨基酸L的向野生型的回复突变。因此，克隆I代表了E-107回复体的纯种群。克隆E在M蛋白质的N末端包含了单个氨基酸突变，在M-5残基从Q到P的氨基酸改变。
为确认克隆的PMS变体的遗传稳定性，在SF培养物中进行相当大规模的g.s.传代物模拟制备(图6)(在T-225烧瓶中制备命名为S的连续传代物，而在5或15L的生物反应器中制备命名为F的传代物，其中非洲绿猴肾细胞生长在Cytodex I微载体珠子上)。对于两种候选物的SSS和SSF样品(分别通过三次静态(static)传代，或两次静态的和一次发酵罐(Fermenter)的传代来获得)和M-60变体的FFF样品，进行仅prM-E区(cDNA的片段I)的测序。三份g.s.样品无一在病毒的prM或E蛋白质具有任何可检测的突变，除了在克隆C的M-60突变。没有E-107突变的任何痕迹(表7)。这表明通过蚀斑纯化实现了可接受水平的遗传稳定性。随后在制备新的Master(P11)和Production Virus(P12)Seeds和最终成批疫苗(P13)的过程中确认了M-60变体的高遗传稳定性，所述新的Master(P11)和Production Virus(P12)Seeds在细胞工厂中制备，而最终成批疫苗(P13)在50 L生物反应器中制备，它们都保留了M-60突变，但通过共有测序在它们的完整基因组中没有检测到其它改变。
M-60和E-107突变对于SF非洲绿猴肾细胞中的病毒生长的作用为比较非突变体、M-60突变体、和E-107突变体病毒在SF培养物中的生长动力学，在0.001pfu/ml的MOI(通过反向滴定确认)用未克隆的P2PMS、未克隆的P5g.s.样品(M-60突变体)、或未克隆的P5成批疫苗变体(含E-107突变)、以及也包含一定比例的E-107突变的未克隆的P3主种子和P4制备种子病毒来感染细胞。收获每日等量分份的含病毒培养基，并通过蚀斑试验来滴定。如图7所示，M-60病毒生长得比非突变体P2病毒迅速，并在感染后第3和第4天产生显著高(超过10倍)的滴度。与M-60突变相似，E-107突变也会增加病毒复制。因此，M-60和E-107突变明显赋予在SF培养物中的生长优势。为支持此结论，每日收集来自非突变体克隆A和M-60突变体克隆C病毒的S，SSS，和SSFg.s.传代物的样品(见图6)，并滴定分析生长动力学，结果是M-60突变体总是产生比非突变体高最多10倍的峰值滴度(接近8log10pfu/ml)。另外，此结论通过比较克隆A，C，和I病毒在小规模SF培养物中的生长曲线得以确认，因为克隆C(M-60)和I(E-107)总是生长到比克隆A(非突变体)高的滴度。
M-60和E-107突变对于ChimeriVaxTM-JE在乳鼠中的神经毒力的影响已经用小鼠神经毒力试验来确保ChimeriVaxTM疫苗候选物的神经毒力不超过YF 17D载体的情况。在IC接种后，YF 17D疫苗对于所有年龄的小鼠都是致命的。与此相比，ChimeriVaxTM疫苗是显著减毒的。因为成熟小鼠通常对检测神经毒力的细微差异不敏感，例如由于单个氨基酸改变导致的差异，使用存活分析的更敏感乳鼠模型可以用于此目的(Guirakhoo等，Virology 257363-372，1999；Guirakhoo等，Virology 298146-159，2002；Monath等，J.Virol.761932-1943，2002)。
给八日龄乳鼠IC接种克隆A P7病毒、克隆C P10病毒(M-60突变)、未克隆的P5成批疫苗(E-107突变)、以及之前制备的含FBS的对照ChimeriVaxTM-JE病毒(P5质控参照标准病毒(Quality Control ReferenceStandard virus)；无突变)、YF 17D阳性对照(YF-VAX_)的连续稀释物，或用稀释剂模拟接种。在21天阶段的死亡率、中值IC 50％致死剂量值(LD50)、和死亡小鼠平均存活时间(AST)见表8所示。如预期，YF-VAX_的神经毒力高。接种2.4log10PFU的此种病毒导致100％的死亡率和8.8天的短AST。P7非突变体和P10 M-60突变体克隆与原来的含FBS型的嵌合体一样是高度减毒的，它们的LD50值＞5log10PFU并且AST较长。因此，M-60突变不改变在此动物模型中疫苗的高度减毒的表型。未克隆的P5成批疫苗病毒比所述克隆的毒力明显要强，IC LD50为3.1 log10PFU，但它比YF-VAX_毒力低。后来，于GLP条件在此试验中检查克隆的M-60疫苗的制备用传代物(manufacturing passages)(主种子(Master Seed)，制备种子(Production Seed)，和成批疫苗)得到类似结果。这证实了通过蚀斑纯化获得的高遗传/表型稳定性和M-60突变的用途。
在非人灵长类动物中的安全性和有效性的分析试验1在此试验中，用YF-VAX_病毒作为对照，在IC施用给食蟹猴后比较克隆C(M-60突变体)、ChimeriVaxTM-JE Vaccine Master Viral Bank(MVB)和Production Viral Bank(PVB)的神经毒力(表9)。
没有观察到在摄食、体重、或血清化学方面疫苗-相关的临床指征或改变，并观察血液学参数。在1-3组的11只猴中分别有9只、4只和8只可见淋巴样增生(Lymphoid hyperplasia)，其表现为脾中淋巴结的体积和数目增加。尽管此发现是在食蟹猴中常见的背景(background)发现，这些猴的组发生率高于正常，并且认为这是继发于预期的由疫苗诱导的免疫应答。值得注意在ChimeriVaxTM-JE处理组和YF-VAX_对照参照组出现了类似的改变。[所有三组中的一些猴出现了持续时间短的低水平接种后病毒血症，这在可接受范围内，并且所有动物对用于接种的病毒发生了血清转化(seroconverted)。在第31天，在LNI试验中YF-VAX_-处理过的猴的黄热病毒-特异性中和型抗体的滴度范围为从2.07到＞6.13，并且在PRNT50试验中YF-VAX_-处理过的猴都没有对JE病毒的交叉反应抗体。所有ChimeriVaxTM-JE MVB疫苗-处理过的猴都有≥320(从320到＞20480)的JE中和抗体滴度并且在LNI试验中无对YF病毒的交叉反应抗体。所有ChimeriVaxTM-JE PVB疫苗-处理过的猴都有≥160(从160到＞20480)的JE中和型抗体滴度并且无对YF病毒的交叉反应抗体。在可检测病毒血症的量级或持续时间和JE-中和型抗体滴度诱导的量级之间无可辨别的关系]。
在此试验中ChimeriVaxTM-JE MVB和PVB制品显示了最弱的神经毒力。在对于黄病毒疫苗的猴神经毒力试验中，最复杂的神经毒力测定是联合的组平均损害计分(combined group mean lesion score)，它代表了平均靶面积和平均分辨区计分的均值(average of the mean target area and mean discriminatorarea scores)。食蟹猴的靶区域是黑质(substantia nigra)和脊髓的颈部和腰部膨大，并且代表了所有黄病毒都会损伤的中枢神经系统(CNS)区域。分辨区域是苍白球(globus pallidus)、壳核(putamen)、丘脑前内侧核，和丘脑外侧核，并且代表了被具有不同毒力特性的YF 17D株(和据推测的其它黄病毒)选择性损害以及区分参照株和神经毒力增加的株的CNS区域。用ChimeriVaxTM-JE MVB和PVB制品处理的猴的联合的平均损害计分显著低于YF-VAX_参照对照组(p＜0.05)。用ChimeriVaxTM-JE MVB和PVB处理的两组猴的平均分辨中心计分(mean discriminator center score)也显著低于YF-VAX_参照对照组的情况(p＜0.05)(表9)。接受了ChimeriVaxTM-JE疫苗制品的两组猴的均值得分无统计学显著差异，并且两种制品在猴神经毒力试验中都显示了类似的低神经毒力。
因此，猴神经毒力试验的结果显示出新的(M60，克隆C)蚀斑-纯化的MVB和PVB有满意的安全性分布图。被试物品(test articles)不显示临床毒性，并且在神经病理性研究中的分辨和联合的损害计分显著低于参照对照(YF-VAX_)。通过定量病毒血症的测定，被试物品与参照对照(YF-VAX_)在趋内脏现象上并无不同。
试验2进行此试验是为了比较在食蟹猴中单次皮下(SC)施用后，原来未克隆的P5 ChimeriVaxTM-JE疫苗[之前在FBS存在时在非洲绿猴肾细胞中制备，除了在E蛋白质疏水尾部的E491的L到F改变外无突变，它在生物表型方面表现为无害突变，并且在临床试验中已经对它进行了试验(Monath等，J.Infect.Dis.1881213-1230，2003；Monath等，Vaccine 201004-1018，2002)]和新克隆C(M-60突变体)ChimeriVaxTM-JE纯化成批疫苗(P13)的病毒血症、免疫应答和安全性。在接种了初始未克隆的P5 ChimeriVaxTM-JE疫苗的5只血清反应阴性猴中，5只(100％)的血清中检测到ChimeriVaxTM-JE病毒。病毒血症的持续时间为2-5天，滴度从20到790 PFU/mL。平均峰值病毒血症(±SD)为244(±310)PFU/mL，并且发生病毒血症的平均天数为3.4(±1.34)(表10)。
在接种了新的纯化的P13 JE成批疫苗的4只血清反应阴性的猴子中，4只(100％)的血清中检测到ChimeriVaxTM-JE病毒。病毒血症的持续时间为2-5天，滴度从50到290PFU/mL。平均峰值病毒血症(±SD)为160(±123)PFU/mL，并且病毒血症的平均天数为3.75(±1.26)天(表10)。平均峰值病毒血症和病毒血症的天数在两个处理组中都没有显著差别(p-值分别为0.6290和0.7016；ANOVA)。
在用最初的未克隆的P5 ChimeriVaxTM-JE疫苗或纯化的P13 JE成批疫苗处理后，所有血清反应阴性的猴子都发生了血清转化(表10)。在第31天，在接种了未克隆的P5疫苗的5只猴中的5只(100％)的血清中，JE病毒中和型抗体的滴度的范围为从640到5120(几何均值滴度＝1689)。在接种了P13ChimeriVaxTM-JE纯化的成批疫苗的4只猴中的4只(100％)的血清中，JE病毒中和型抗体的滴度的范围为从320到2560(几何均值滴度＝761)。抗体滴度在处理组间无显著差别(p＝0.2986，ANOVA)。
因此，将新的M-60疫苗与原来未克隆的ChimeriVaxTM-JE疫苗(除E491外无突变)在安全性(病毒血症)和免疫原性上作比较。新疫苗的趋内脏现象稍弱(理想的特征)，但仍具有高度免疫原性。病毒血症和免疫原性的量级的差异是统计学上不显著的。
M-5，M-60，和E-107突变对于病毒感染性的pH阈值的影响通过将JE病毒的SA14-14-2株的prM和E基因插入YF 17D病毒骨架来制备ChimeriVaxTM-JE疫苗。SA14-14-2病毒的包膜(在ChimeriVaxTM-JE中存在)有10个氨基酸与其亲本SA14病毒不同E107 L到F、E138E到K、E176 I到V、E177 T到A、E227 P到S、E244 E到G、E264 Q到H、E279 K到M、E315 A到V，和E439 K到R的改变(Guirakhoo等，Virology 257363-372，1999)。通过定点诱变显示，这些残基中的一些参与了ChimeriVaxTM-JE病毒得到减毒作用。选择ChimeriVaxTM-JE的突变体或回复体来鉴定是否突变已经改变了这些病毒的pH阈值。为测定M-60、E-107或M-5突变是否以pH-依赖性方式影响了病毒的感染性，如材料和方法部分所述进行感染性的pH阈值的标准试验。试验了如下病毒(1)ChimeriVaxTM-JE非突变体(在E蛋白质中含有所有10个SA14-14-2突变的克隆A，P7)；(2)ChimeriVaxTM-JE E107F到L的回复体(含9个E蛋白质突变的克隆I，P6)；(3)ChimeriVaxTM-JE M60R到C的突变体(含所有10个E蛋白质突变的克隆C，P10)，和(4)M-5 Q到P的突变体(含所有10个E蛋白质突变的克隆E，P6)(表12)。
用一系列降低的pH处理非突变体克隆A P7病毒，M-60突变体克隆CP10病毒，M-5突变体克隆E，和含E-107突变的未克隆的P5病毒，随后滴定残余的病毒感染性。三种病毒(克隆A对照病毒，克隆C M60突变体，和克隆I E-107突变体)在pH 6.0后感染性开始均一地下降，并在pH 5.8失去感染性(pH阈值5.9)，但M5突变体克隆E病毒除外。M-5突变体的pH阈值(pH 6.3)显著高于所有其它病毒(pH 5.9)(图8A)。这是M蛋白质的胞外结构域在黄病毒感染细胞的过程中起实质作用的第一个直接证据。因此，在吸收并内化病毒后由在内体中的低pH引发的融合中，M蛋白质的N-末端可能起作用，这种作用是先前认为仅由于包膜E蛋白质所致的作用。
ChimeriVaxTM-JE病毒的融合pH阈值为5.9，其低于对于其它野生型(wt)黄病毒描述的情况(Guirakhoo等，J.Gen.Virol.721323-1329，1991)，并且可能与该病毒的减毒作用有关。
这些数据证明，ChimeriVaxTM-JE的E区中的E-107突变不改变融合的pH阈值。通常，低pH阈值意味着E-蛋白质要出现的构象改变需要特定氨基酸的更多质子化，而该构象改变是从二聚体转变为三聚体必需的。可能一或多个SA14-14-2特异性突变(除E107突变之外，该突变位于保守的融合肽内)造成保留融合的低pH阈值(pH 5.9)，从而保留该病毒对于所述宿主的减毒表型。M-5突变明显能够将此阈值从5.9提高到6.3，这与wt黄病毒的阈值较接近(Guirakhoo等，Virology169(1)90-99，1989；Guirakhoo等，J.Gen.Virol.721323-1329，1991)。融合的pH阈值升高从理论上应该降低病毒的减毒表型，因为病毒能在较高pH融合，转变成融合活性状态所需的质子化较低。这显示是正确的，因为以1.4 log10PFU通过经大脑内途径接种到3-4日龄乳鼠的M5病毒的毒力显著强于以1.7log10PFU接种的对照病毒(无M5突变的ChimeriVaxTM-JE疫苗病毒)(p＝0.056)(图8B)。然而，在3-4日龄乳鼠中M5突变病毒(以1.4 log10PFU的剂量)的神经毒力仍明显低于YF-VAX_(以0.9 log10PFU的剂量)(图8C)，表明在疫苗病毒的包膜蛋白内的SA14-14-2突变仍提供此病毒的足够水平的减毒。
影响融合pH阈值的在其它嵌合体中的突变用每种ChimeriVaxTM-DEN疫苗病毒的两个组进行间接融合试验不含E蛋白质突变的ChimeriVaxTM-DEN1-4 P7和在E蛋白质中含有单个突变的ChimeriVaxTM-DEN1-4 P10，除ChimeriVaxTM-DEN4 P10之外。将病毒与不同pH的培养基在室温温育10分钟。用标准蚀斑试验，在将pH回复到中性pH后，测定滴度。如表13所示，ChimeriVaxTM-DEN2和DEN4病毒的P7和P10的病毒灭活(融合)阈值是类似的(pH 6.4)。与此相比，ChimeriVaxTM-DEN1 P10的pH阈值比ChimeriVaxTM-DEN1 P7病毒低0.4个单位(pH 6.0与pH 6.4)。对于ChimeriVaxTM-DEN3 P10病毒，pH阈值的差异不太大(pH 6.4与pH 6.2)。
对于ChimeriVaxTM-DEN病毒的所有P7在pH 6.2出现最大病毒灭活，只有ChimeriVaxTM-DEN4稍低(pH 6.0)。显示出ChimeriVaxTM-DEN1 P10需要显著较低的pH才能完全灭活(pH 5.6)。ChimeriVaxTM-DEN1和-DEN3病毒都在E-204含有从K到R的氨基酸替代(DEN3的E-蛋白质比其它3个血清型少2个氨基酸，因此此病毒中的E-202残基与DEN1中的E-204同源)。对于DEN3嵌合体而言，融合阈值的不太大的差异可能是由于在P10病毒原种中存在WT(K)和突变的R氨基酸(E204K/R)，如共同测序所显示(K∶R＝50∶50)(Pugachev等，J.Virol.781032-1038，2004)。尽管存在E251突变，因为用DEN2 P10嵌合体没有观察到病毒灭活的阈值有改变，可以得出结论在此残基的突变不参与病毒融合过程(图8D)。
为了确定在ChimeriVaxTM-DEN3的P10中存在K/R异质性是否会造成融合的pH阈值的不显著改变，用P7(无突变，E202K)、P10(50％突变，E202K/R)、和P15(完全突变，E202R)病毒进行间接融合测定。如图8E所示，ChimeriVaxTM-DEN3 P10灭活(融合)的pH阈值是在pH 6.2，介于ChimeriVaxTM-DEN3 P7(pH 6.4)和ChimeriVaxTM-DEN3 P15(pH 6.0)病毒的pH阈值之间。因为E202 K到R的突变是在这些嵌合体的E-蛋白质中检测到的唯一氨基酸替代，很有可能此突变造成P15病毒融合的pH阈值发生0.4 pH的偏移。
如上所述，在制备疫苗的细胞培养中出现的E204 K到R的突变，会使融合的pH阈值降低0.4个pH单位。E204 K到R的突变显示出产生了新的分子内H键和新的盐桥，这可能对于E二聚体的解离有显著影响。基于在存在去污剂n-辛基-β-D-葡糖苷时测定的DEN2 E-蛋白质胞外结构域(S1株)的残基394的原子坐标，给ChimeriVaxTM-DEN1(PMS，P7)E蛋白质的结构建模(modelling)(Modis等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1006986-6991，2003)。使204位的K残基变为R以模拟突变体病毒，并且重复建模来表示ChimeriVaxTM-DEN1(VL，P10)病毒的E-蛋白质结构(Guirakhoo等，J.Virol.789998-10008，2004)。在204位的K残基(204K)位于短环袢内，在已经显示影响神经毒力或融合的pH阈值的残基衬里(lined)的疏水袋内(Lee等，Virology 232281-290，1997；Lindenbach等，2001 Flaviviridaethe viruses andtheir replication.Fields Virology，eds.Knipe D.M.，and Howley P.M.[LippincottWilliams and Wilkins，Philadelphia]，1，991-1004；Monath等，J.Virol.761932-1943，2002)。在图8F中比较了疫苗病毒(204R)与PMS(204K)病毒的E-同型二聚体结构的同源性模型。E单体之一的204K和261H的侧链显示出分别与在相对单体上的252V和253L残基的骨架原子形成H键。在204位，预测在疫苗病毒(VL P10)的E蛋白质中的R会自身再定向(reorient)，从而会失去这些氢(H)键。然而，突变体R的侧链与261H和257E邻近，导致在204R和261H之间产生新的分子内H键，并可能在204R和257E之间产生新的盐桥。因为组氨酸的pk可能是大约6.0，稍微低于融合阈值(pH～6.4)，Guirakhoo等，(J.Virol.789998-10008，2004)原来假设在204R和261H之间预测的新H键以及在204R和257E之间的盐桥可能会影响融合的pH阈值。此理论显示出是正确的，因为本文描述的试验显示ChimeriVaxTM-DEN1的融合阈值是大约6.0，比它的P7病毒(pH 6.4)低0.4个pH单位。在残基204通过R引入的新的分子间键明显加强了E-二聚体的连接(association)，因此转变成低pH需要合适残基(例如H 261)的更多质子化。较低的融合阈值影响了病毒在猴子中的趋内脏现象并降低了对通过i.c.途径接种的乳鼠的神经毒力(Guirakhoo等，J.Virol.789998-10008，2004)。
在ChimeriVaxTM-DEN3 P10疫苗的E-蛋白质中的E202 K到R的替代与ChimeriVaxTM-DEN1 P10疫苗中的E204突变同源。与ChimeriVaxTM-DEN1P10一样，ChimeriVaxTM-DEN3 P10(在含K和R残基的残基202上是异质的)显示了比P7低的融合pH阈值(～0.2 pH单位)。当突变固定在ChimeriVaxTM-DEN3的P15时，融合的pH阈值进一步下降(0.4个pH单位，类似于ChimeriVaxTM-DEN1 P10)。此数据显示残基202/204可以是所有登革病毒中减毒的通用决定簇。现在，ChimeriVaxTM-DEN3和-DEN4的P10疫苗病毒不含有此突变，而且这两种病毒在接种了四价疫苗配制剂的猴子中都诱导了较高的病毒血症水平(Guirakhoo等，J.Virol.784761-4775，2004)。仍需观察在ChimeriVaxTM-DEN3或ChimeriVaxTM-DEN4中的K到R突变是否会降低它们在它们的宿主中的趋内脏现象。
之前有报道WT-JE融合的pH阈值为6.4(Guirakhoo等，J.Gen.Virol.721323-1329，1991)。本研究中，ChimeriVaxTM-JE的所有变体的pH阈值都是5.9。在这些实验中观察到的低pH阈值可能是由于在ChimeriVaxTM-JE包膜蛋白中存在10种减毒突变中的一或多个所致。此突变可能会加强E-蛋白质二聚体的连接，从而解离和转变为三聚体结构以及随后的融合需要较低的pH。这里的数据显示E107 F到L的突变(位于E-蛋白质的结构域II的cd-环袢内)和E279 M到K的突变(位于结构域II的疏水袋内)都不会造成pH阈值下降。可能在JE E蛋白质中的其它突变会影响融合的pH阈值。对十分类似JE E蛋白质的TBE病毒E蛋白质的晶体结构的分析，可有助于预测一经改变会改变融合的pH阈值的残基。基于此模型，可能是在残基E244 G和/或E264 H中的突变导致ChimeriVaxTM-JE病毒融合的pH阈值比WT JE低。
M-60和E-107突变对病毒穿透有效性的影响用Chambers的方法(Vlaycheva等，J.Virol.766172-6184，2002)来检测M-60(克隆C病毒)和E-107(克隆I病毒)突变对病毒穿透SF非洲绿猴肾细胞的影响。在此试验中，用适当稀释的病毒(达到在每个时间点产生～50个蚀斑/孔)感染SF非洲绿猴肾细胞5，10，20，或60分钟。通过加入酸性甘氨酸溶液(silution)来灭活未内化的病毒，而用PBS(中性pH)处理对照的平行孔。用PBS洗涤细胞并用甲基纤维素覆盖物覆盖，随后在第5天目测并计数蚀斑。穿透的有效性表示为在甘氨酸-处理过的孔中的蚀斑平均数占对照(PBS处理过的孔)中蚀斑数的百分比。初步穿透试验结果如图9A所示。重要的是在5和10分钟的时间点，此时更可能检测到突变对穿透的作用，发生穿透的克隆C和克隆I病毒的百分比非突变体克隆A病毒高。结果不是如标准偏差条所显示的那样是统计学显著性的，并且需要在其它重复试验中予以确证。然而，此实验提示M-60和E-107突变都可以提高ChimeriVaxTM-JE病毒与在SF条件生长的细胞的膜融合有效性。M-60和E-107残基对膜融合过程起作用的可能机制见图9B所示。M-60残基位于病毒膜中，而E-107残基插入细胞膜中，并且在E蛋白质发生低pH-依赖性重排后这两个膜被迫融合(根据我们的数据，M蛋白质的胞外结构域可对其予以促进)。在这两个残基中任一个的更合适的氨基酸可以促进膜的融合。
因为我们的数据首次发现M蛋白质的胞外结构域及其跨膜结构域都有功能性意义，现在认为完整的M蛋白质是为了开发新的活减毒疫苗而作诱变来使黄病毒减毒的有吸引力的靶标。例如，可以将随机或特定的(在蛋白质结构的进一步分析后)氨基酸改变、或长度渐增的例如1，2，3，4，5个氨基酸等等的缺失掺入整个蛋白质中，期待病毒的生物表型会改变，从而造成明显减毒。
临床试验的结果表11A和B中比较了从上述临床试验获得的具有精氨酸和半胱氨酸M60残基的ChimeriVaxTM-JE的病毒血症图谱。与29-50％接受了ChimeriVaxTM-JE M60半胱氨酸的受试者相比，在接受了ChimeriVaxTM-JEM60精氨酸的受试者中，67-100％的受试者在一或多天是有病毒血症的。接受了ChimeriVaxTM-JE M60精氨酸的受试者的平均最高病毒血症水平在13到40PFU/ml的范围，而在ChimeriVaxTM-JE M60半胱氨酸的情况下，平均最高病毒血症水平为3.5-6.3PFU/ml。在ChimeriVaxTM-JE M60精氨酸的情况下，病毒血症的持续时间明显更长。
这些数据证明，在含M60突变的疫苗的情况下，病毒血症的水平明显较低。病毒血症是疫苗病毒的趋内脏现象(毒力)的指标。伴有低病毒血症的疫苗被认为是较安全的，因为支持病毒复制并造成病毒血症的器官的细胞损害和功能障碍下降，病毒会穿过血脑屏障并侵入中枢神经系统的可能性也下降。在其它试验中，显示M60突变体和非突变体一样对人类是高免疫原性的。
表1. 小蚀斑(P10 PMS)(P/N IT-0116；L/N I020504A)(从p5 Run 1疫苗批(lot)纯化的蚀斑)的共有序列。
表2.大蚀斑PMS(P10，PMS)(P/N IT-0117；L/N I030804A)(源自p5 Run1疫苗批)的共有序列。
表3.在无血清条件下在非洲绿猴肾细胞中对S蚀斑PMS(p10)作另外2次传代后分离的大蚀斑的序列。
表4. 对于HepG2观察到的CPE。
表5.接种了ChimeriVaxTM-WN02疫苗或YF-VAX_的猴的病毒血症。
*病毒血症用pfu/mL表示**第1天研究的第1天，猴在研究第1天接种0 PFU/mL表示在检出限以下，理论的试验截留值(assay cutoff)＝10PFU/mL
表6.从蚀斑分离物直接获得的YF-WN嵌合体的M区序列，所述蚀斑分离物来自用WN02疫苗病毒接种的有病毒血症的猴。
表7.未克隆的和克隆的SF ChimeriVaxTM-JE样品(见表6)的核苷酸和氨基酸序列。
a从基因组的开始起b从指定蛋白质N-末端起表8.克隆A P7、克隆C P10、未克隆的P5、含FBS的标准品、和YF-VAX_病毒在8日龄乳鼠中的神经毒力。
表9.M-60(克隆C)主种子及制备种子与YF-VAX_对照相比对食蟹猴的神经毒力。
1PFU＝蚀斑-形成单位2第1、2和3组中分别有11只中的4只、11只中的2只和11只中的1只动物被排除在分数的计算之外，这是因为在第1天(接种前)在回顾性PRNT50试验中发现它们是JE-血清阳性的，PRNT50试验比用于预筛选的HAI试验更灵敏。
表10.食蟹猴的病毒血症和免疫原性的量级的比较，所述食蟹猴SC接种了在含FBS培养基中产生的原本未克隆的P5 ChimeriMaxTM-JE疫苗(除E491外不含突变)和新的克隆C P13纯化的成批疫苗(M-60突变体)。
1第1、2和3组中分别有6只中的2只、6只中的1只、6只中的2只动物被排除在值的计算之外，这是因为在第1天(接种前)在回顾性PRNT50试验中发现它们是JE-血清阳性的，PRNT50试验比用于预筛选的HAI试验更灵敏。
表11A.参与了试验H-040-003的受试者的病毒血症图谱，其中给所述受试者施用了带有M60精氨酸的ChimeriVaxTM-JE。黑体的剂量范围与另一试验(H-040-007)中给予的类似，在所述另一试验中施用了突变体M-60半胱氨酸疫苗。
表11B.参与了试验H-040-007的受试者的病毒血症图谱，其中给所述受试者施用了带有M60半胱氨酸的ChimeriVaxTM-JE。
表12.通过每种ChimeriVaxTM-JE疫苗的融合试验发现的融合pH阈值
表13.通过每对ChimeriVaxTM-DEN P7和P10的间接融合试验发现的融合pH阈值
表14YF/黄病毒嵌合物的改造
1，2这两列显示了用于产生与C/prM或E/NS1接合对应的嵌合YF/黄病毒引物的寡核苷酸。(见正文)。X＝YF衣壳的羧基末端编码序列。下划线区对应于紧邻NarI位点(反义-ccgcgg)上游的靶向异源序列。此位点允许将PCR产物插入产生全长cDNA模板所需的Yfm5.2(NarI)质粒。其它核苷酸对于异源病毒是特异的。寡核苷酸引物按5′到3′方向列举。
3，4列举了用于产生限制片段的独特限制位点，所述限制片段可以被分离并体外连接以产生全长的嵌合cDNA模板。因为一些序列不包含方便的位点，有时需要对合适位点作改造(注脚5)。
5括号中是必须在YF骨架或异源病毒中产生的限制性酶位点，从而允许高效的体外连接。必须去除不在括号中的位点。通过对各个克隆作cDNA沉默诱变来进行所有这些修饰。空白间隔表明不需要对cDNA克隆作修饰。
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### DNA StriderTM13f7###周四，2004年10月21日3:10:16PMWN02MProLxM66MProL＝>蛋白质比对蛋白质 序列75aaSLTVOTHGESTL...VVLLLLVAPAYS蛋白质 序列75aaSLTVOTHGESTL...VVPILLVAPAYSLayout StandardHethod Single BlockBlock Lengths 6-aaMiamatch penalty Smaller (1)Gap penaltyMedium(2)Weighting ELOSOM62· 20· 40 · 60 ·1 SLTVQTHGESTLANKKGAWMDSTKATRYLVKTESWILRNPGYALVAAVIGWMLGSNTMQRVVFVVLLLLVAPAYS 75SLTVQTHGESTLANKKGAWMDSTKATRYLVKTESWILRNPGYALVAAVIGWMLGSNTMQRVVFVV LLLVAPAYS1 SLTVQTHGESTLANKKGAWMDSTKATRYLVKTESWILRNPGYALVAAVIGWMLGSNTMQRVVFVVPLLLVAPAYS 75· 20 ·40 · 60· 同一性 98.7(74/75)
权利要求
1.重组黄病毒，其包含膜蛋白突变。
2.权利要求1的黄病毒，其中所述突变使该黄病毒减毒。
3.权利要求2的黄病毒，其中所述突变降低了该黄病毒的趋内脏现象/病毒血症。
4.权利要求1的黄病毒，其中所述突变使得相对于缺乏所述突变的对应黄病毒而言该黄病毒的稳定性提高。
5.权利要求1的黄病毒，其中所述突变使得相对于缺乏所述突变的对应黄病毒而言细胞内的病毒复制提高。
6.权利要求1的黄病毒，其中所述黄病毒是嵌合黄病毒。
7.权利要求6的黄病毒，其中所述嵌合黄病毒包含第一种黄病毒的衣壳和非结构蛋白质和第二种黄病毒的膜和/或包膜蛋白。
8.权利要求7的黄病毒，其中所述第一种黄病毒是黄热病毒。
9.权利要求8的黄病毒，其中所述黄热病毒是YF-17D。
10.权利要求7的黄病毒，其中所述第二种黄病毒是日本脑炎病毒。
11.权利要求7的黄病毒，其中所述第二种黄病毒是西尼罗病毒。
12.权利要求7的黄病毒，其中所述第二种黄病毒选自登革病毒、圣路易脑炎病毒、墨累山谷脑炎病毒、和蜱媒脑炎病毒组成的组。
13.权利要求12的黄病毒，其中所述登革病毒是1型登革、2型登革、3型登革或4型登革病毒。
14.权利要求1的黄病毒，其中所述突变在所述膜蛋白的跨膜结构域内。
15.权利要求14的黄病毒，其中所述突变是一或多个氨基酸的替代，所述氨基酸对应于日本脑炎病毒或西尼罗病毒的膜蛋白内膜螺旋的第40-75位氨基酸区域。
16.权利要求15的黄病毒，其中所述突变是对与日本脑炎病毒的膜蛋白的第60位氨基酸相对应的氨基酸的替代。
17.权利要求16的黄病毒，其中所述突变使在所述膜蛋白的第60位氨基酸的精氨酸被半胱氨酸替代。
18.权利要求15的黄病毒，其中所述突变是对与西尼罗病毒的膜蛋白的第66位氨基酸相对应的氨基酸的替代。
19.权利要求18的黄病毒，其中所述突变使在所述膜蛋白的第66位氨基酸的亮氨酸被脯氨酸替代。
20.权利要求15的黄病毒，其中所述突变在对应于日本脑炎病毒或西尼罗病毒的膜蛋白第60、61、62、63、64、65、或66位的一或多个氨基酸中。
21.权利要求1的黄病毒，其中所述突变在膜蛋白的胞外结构域内。
22.权利要求21的黄病毒，其中所述突变在选自由胞外结构域的第1-5位氨基酸组成的组的氨基酸中。
23.权利要求22的黄病毒，其中所述突变是在胞外结构域的第5位氨基酸的替代。
24.权利要求23的黄病毒，其中所述突变是用脯氨酸替代谷氨酰胺。
25.权利要求1的黄病毒，其中所述黄病毒包含一或多个包膜蛋白突变，所述突变在对应于下述西尼罗病毒包膜蛋白氨基酸的残基中，所述西尼罗病毒包膜蛋白氨基酸选自由第107、138、176、177、224、264、280、316、和440位氨基酸组成的组。
26.权利要求25的黄病毒，其中所述黄病毒包含包膜蛋白突变，所述突变在与西尼罗病毒包膜蛋白的第107，316，和440位氨基酸相对应的残基中。
27.权利要求25的黄病毒，其中所述黄病毒包含突变，所述突变在与西尼罗病毒膜蛋白的第66位和包膜蛋白的第107、316、和440位相对应的残基上。
28.权利要求1的黄病毒，其还包含在所述黄病毒包膜蛋白的铰链区的疏水袋中的突变。
29.权利要求28的黄病毒，其中所述突变存在于与1型登革病毒包膜蛋白的第204位氨基酸相对应的氨基酸上。
30.权利要求28的黄病毒，其中所述突变在一或多个铰链区氨基酸上，所述氨基酸对应于黄热病毒包膜蛋白的第48-61、127-131、和196-283位氨基酸。
31.权利要求1的黄病毒，其还包含在该黄病毒3’-未翻译区中的减毒型突变。
32.权利要求1的黄病毒，其还包含在该黄病毒衣壳蛋白中的减毒型突变。
33.疫苗组合物，其包含权利要求1的黄病毒和可药用载体或稀释剂。
34.诱导患者对黄病毒的免疫应答的方法，该方法包括给该患者施用权利要求33的疫苗组合物。
35.权利要求34的方法，其中所述患者尚未被黄病毒感染但有感染黄病毒的风险。
36.权利要求34的方法，其中所述患者被黄病毒感染。
37.制备包含重组黄病毒的疫苗的方法，该方法包括向该黄病毒的膜蛋白中引入突变。
38.权利要求37的方法，其中所述突变使该黄病毒相对于缺乏所述突变的对应黄病毒而言发生减毒。
39.权利要求37的方法，其中所述突变使得该黄病毒相对于缺乏所述突变的对应黄病毒而言其稳定性提高。
40.权利要求37的方法，其中所述突变使得该黄病毒相对于缺乏所述突变的对应黄病毒而言其复制增加。
41.权利要求37的方法，其中所述黄病毒是嵌合黄病毒。
42.核酸分子，其对应于权利要求1的黄病毒的基因组或其互补物。
43.制备权利要求1的黄病毒的方法，该方法包括将对应于该黄病毒基因组的核酸分子引入细胞并从该细胞或其上清中分离该细胞所产生的黄病毒。
44.权利要求43的方法，其中所述细胞是非洲绿猴肾细胞。
45.权利要求43的方法，其中所述细胞培养在无血清培养基中。
全文摘要
本申请提供了减毒黄病毒疫苗，如抗日本脑炎病毒和西尼罗病毒的疫苗，以及这些疫苗的制备和使用方法。
文档编号C12Q1/70GK101084010SQ200580043790
公开日2007年12月5日 申请日期2005年10月19日 优先权日2004年10月20日
发明者法沙德·吉拉克胡, 刘江建, 约翰·A·卡塔兰, 托马斯·P·莫纳思, 康斯坦廷·V·普加切夫 申请人:阿卡姆比斯股份有限公司