专利名称：检测猪日本脑炎抗体的重组e蛋白elisa试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明检测猪日本脑炎抗体的重组E蛋白ELISA试剂盒，属于生物技术领域。用于猪日本脑炎抗体的抗体检测，以此对抗体水平及疫情的分布与流行情况进行监测。
二
背景技术：
猪日本脑炎(Japanese encephalitis)是由日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的侵害中枢神经系统的，经蚊子传播的急性人畜共患传染病，它主要引起妊娠母猪发生流产和死胎，公猪发生睾丸炎，育肥猪持续高热，新生仔猪脑炎，本病不但对养猪业造成了巨大的经济损失，而且在世界许多国家广泛存在，严重威胁着人类的健康。近年来，随着全球气候变暖，日本脑炎流行范围有不断扩大的趋势。在动物中，猪对JEV感染最为普遍，血清学检测猪抗体阳性率在90％以上。
猪日本脑炎自出现至今，关于本病诊断方法与的研究成果不断涌现，但是传统的检测方法多为全病毒操作，存在感染人和散毒的危险。JEV通常只在仓鼠肾原代细胞上产生病变，而在许多常用的传代细胞上不产生病变，这给病毒的增殖带来了困难，而且全病毒抗原的制备过程繁琐，缺少标准化，从而使其推广和应用受到限制。
E蛋白是JEV病毒粒子表面最重要的结构蛋白，其表面的抗原决定簇与保护性免疫、血凝反应和血清特异性、膜融合、病毒的毒力、宿主范围、组织嗜性有关。现有技术中本发明课题组已经以E基因为目标片段进行扩增，构建了重组质粒pET-E，将其在大肠杆菌BL21(DE3)中进行高效表达(相关内容已发表于中国人兽共患病杂志2003年第五期)。但是还没有利用表达产物建立检测猪日本脑炎的ELISA试剂盒及其检测方法的技术。
三
发明内容
技术问题本发明的目的在于提供一种检测猪日本脑炎抗体的重组E蛋白ELISA试剂盒，用于猪日本脑炎的抗体检测，该试剂盒具有高度的特异性、敏感性，可大量生产，大大降低了检测成本，检检测成本低廉，适于推广。对本病的抗体水平检测、流行病学调查、类症鉴别及采取有效防制措施方面提供重要方法。
技术方案1、检测猪日本脑炎抗体的重组E蛋白ELISA试剂盒，包括以下组分1)ELISA板条以在原核细胞中的高效表达的重组E蛋白作为包被抗原，每一试剂盒装有2块经质量体积比为1％的BSA(牛血清白蛋白)封闭的板条，以包装袋密封冻干保存于-20℃保存；2)洗涤液含0.05％Tween-20的20×pH7.4PBS溶液；3)血清稀释液1％(M/V)BSA(牛血清白蛋白)100mL；4)显色底物已加入H2O2的OPD(邻苯二胺)溶液100mL；5)终止液2M H2SO4溶液100mL；6)猪日本脑炎病毒(JEV)阳性血清5mL；7)猪日本脑炎病毒(JEV)阴性学清5mL；8)辣根过氧化物酶标记的羊抗猪酶标二抗5mL。
2、上述重组E蛋白ELISA试剂盒用于检测猪日本脑炎抗体，主要操作步骤如下1)加入血清样品用血清稀释液1％(M/V)BSA将被检血清作1∶100倍稀释后，按酶标板样品添加模式于每孔中加入100μL，共加两孔，于37℃下作用60min后弃去反应孔中的液体；将每个孔用约300μL的洗涤液充分清洗3次，每次持续3min，在每次洗涤后将反应孔中的液体除去，最后一次除去洗涤液后，除去残留的液体；2)加入羊抗猪酶标二抗每孔加入100μL酶标二抗，37℃作用45min，洗涤3次，每次3min；3)加入显色底物每孔中加入100μL已加入H2O2的OPD溶液，37℃下作用15min；4)终止反应向每孔中加入100μL 2M H2SO4溶液终止反应；5)用酶标仪测定OD值在490nm波长下测定各孔吸光度OD值，随后判定结果；6)结果判定已知阳性血清OD490/已知阴性血清OD490＞2.1且检测样品OD490＞0.4，即可判为阳性。
四有益效果
1特异性高本发明应用重组E蛋白作为包被抗原，在材料选择上具有新意。猪在受到JEV感染后，最先产生的抗体是针对病毒的囊膜蛋白，且此抗体可在猪体内持续存在12个月以上。通过Western-blot试验，证实重组囊膜蛋白(重组E蛋白)具有良好的反应原性，保证了检测试剂盒的高度特异性。
2检测试剂盒可大量生产目前，在检测猪日本脑炎抗体方面，应用较为广泛的是以全病毒作为抗原建立的间接血凝与血凝抑制方法和乳胶凝集方法，由于病毒需由细胞培养物中大量增殖，而真正意义上的纯化病毒很难获得。本发明使用的包被抗原为猪日本脑炎病毒(JEV)E基因的原核表达产物，其优点在于重组E蛋白易于稳定、大量获得(用薄层扫描法测得重组E蛋白的含量占总表达产物的42％)，纯化方法易于实现(应用His-bind亲和层析柱纯化)，重组E蛋白的包被浓度易于确定和控制，为检测试剂盒的大量生产提供有力保证。
3检测成本低廉，适于推广本发明与现有方法相比，在保证特异性、敏感性的前提下，与LAT试剂盒的检测符合率为94.2％，与HIA检测的符合率为90.8％。本发明的检测费用在10-15元左右，大大降低了检测成本，有着良好的应用前景。
具体实施例方式
本发明所使用的包被抗原—重组E蛋白，为按照《中国人兽共患病杂志》2003年第五期发表论文“流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2株E蛋白基因在原核细胞中的高效表达及其表达产物的抗原性分析”中的方法获得的重组E蛋白。
以重组E蛋白为包被抗原的间接ELISA方法通过以下步骤实现1检测猪日本脑炎抗体的重组E蛋白ELISA反应条件的确定1.1方阵试验采用棋盘法测定。取96孔ELISA板，将提纯的E蛋白用pH9.6的CBS自左向右依次做1∶10、1∶20至1∶10240稀释，每孔100μL，后于4℃过夜。次日取出后洗涤三次，每次持续3分钟。后用1％BSA于37℃下封闭3h后洗涤同前。将阴、阳性血清也按同样的稀释倍数稀释，自上而下分别加入以上的反应孔中，每孔100μL，于37℃放置60min，取出后洗涤同前。接着每孔中加入100μL稀释至工作浓度的羊抗猪酶标二抗，于37℃作用60min，随后洗涤同前。继而向每孔中加入100μL OPD(已加入H2O2)，于37℃作用15min，最后加入100μL 2M H2SO4终止反应。在酶标仪上检测OD值。取阳性血清OD值1.0、阴性血清OD值0.2(OPD为底物)所在孔的抗原浓度和血清稀释液作为最佳抗原工作浓度和血清稀释度。确定最佳抗原工作浓度为25μg/ml，而血清最佳稀释倍数为1∶100。
1.2抗原最佳包被时间的测定将按最佳抗原浓度包被好的ELISA反应板分别在37℃及4℃过夜。于次日取出包被好的反应板，用已知的阴、阳性血清按前面述及的相关步骤操作，其它条件相同。每份血清重复五孔，观察OD490值变化及P/N变化情况。结果显示不论是在37℃还是在4℃完成包被，对ELISA结果都不会有明显影响。
1.3封闭液的选择分别用2％脱脂乳、1％BSA、1.5％明胶和5％犊牛血清(FCS)作为封闭液，于室温封闭2h，在其它条件及操作方法相同的情况下，对已知的阴、阳性血清进行ELISA检测，每种封闭液稀释的血清重复五孔，通过OD490值评价其封闭效果。通过试验确定1％BSA作为封闭液。
1.4封闭条件的确定在其它条件相同的情况下，用选定的封闭液分别在37℃及室温封闭1h、2h、3h、4h，后应用已知的阴、阳性血清进行检测，对封闭时间及温度进行确定。结果表明在37℃封闭1h就可以达到良好的效果。
1.5血清稀释液的选择分别以PBST、1％BSA、3％犊牛血清、6％犊牛血清作为稀释液稀释已知的阴、阳性血清，每一浓度稀释液重复五孔，在其它条件相同的情况下，进行ELISA测定，计算各组P/N值，以该值最大且阴性血清OD值较低来选择血清稀释液。确定的血清稀释液为1％BSA。
1.6血清作用时间的确定用选定的血清稀释液将已知的阴、阳性血清做1∶100稀释至最佳稀释倍数后，分别于室温及37℃下作用15min、30min、45min、60min，在其它条件及操作方法相同的情况下，进行ELISA检测，取P/N最大且阴性血清本底较低的一组确定为最佳作用时间。最终确定血清作用时间为室温及37℃，45min。
1.7酶标二抗作用时间的选择将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪酶标二抗(晶美公司)用选定的血清稀释液稀释后于37℃及室温下分别作用10min、15min、20min、25min、30min、60min，用已知的阴、阳性血清进行ELISA检测，观察OD值及P/N变化。确定羊抗猪酶标二抗作用时间为37℃，60min。
1.8底物及终止液的选择在其他条件相同的情况下，于室温下及37℃下分别用TMB(OD630)、OPD(OD490)作为底物，检测已知的阴、阳性血清，分别加入2MH2SO4、2N HCL、0.12％HF作为终止液，于终止后30min内每隔10min在酶标仪上读值，计算其P/N比值，选择合适的底物。确定OPD为显色底物，终止液为2M H2SO4。
1.9底物作用时间的选择采用已知的阴、阳性血清，应用选定的底物，分别于室温及37℃作用10min、15min、20min、25min、30min后，用确定的终止液终止反应，于终止后30min内在酶标仪上读值，以确定底物作用的时间及作用温度。最后确定底物OPD的作用时间为37℃，10min。
1.10判定标准的确定以200份经NTA检测试剂盒检测的血清，按照优化的条件进行ELISA检测，检测结果在计算机上用Excell软件进行分析，确定cut-off值，以此作为依据确定判定标准。在490nm波长下测定各孔吸光度(OD值)，随后判定结果P(OD490)/N(OD490)＞2.1且S(OD490)＞0.4，即可判为阳性。
(注S为检测样品；N为已知阴性血清)1.11重组E蛋白ELISA操作程序的确定按以上各项所确定的优化条件进行操作，即得到本方法的最佳操作程序取出已包被并封闭好的ELISA板条，用样品稀释液将被检血清作1∶100稀释，加入样品孔中，37℃作用45min，弃去反应孔中的液体；将每个孔用约300μL的洗涤液充分清洗3次，在每次洗涤后将反应孔中的液体除去；最后一次除去洗涤液后，在吸水纸上拍打，除去残留的液体；每孔加入100μL酶标二抗，37℃作用60min，洗涤3次。每孔中加入100μLOPD底物溶液，37℃避光作用10min；向每孔中加入100μL的2M H2SO4，终止反应。用酶标仪在490nm波长下测定各孔吸光度A值，读值计算并判定结果。
实施例一、检测猪日本脑炎抗体的重组E蛋白ELISA试剂盒，包括以下组分1)ELISA板条以纯化的重组E蛋白作为包被抗原，每一试剂盒装有2块经1％(M/V)BSA(牛血清白蛋白)封闭的板条，以包装袋密封冻干保存于-20℃保存；2)洗涤液20倍浓度的pH7.4PBS溶液(含0.05％Tween-20)；3)血清稀释液1％(M/V)BSA(牛血清白蛋白)100mL；4)显色底物已加入H2O2的OPD(邻苯二胺)溶液100mL；5)终止液2M H2SO4溶液100mL；6)JEV阳性血清5mL；7)JEV阴性学清5mL；8)羊抗猪酶标二抗5mL。
二、重组E蛋白ELISA试剂盒用于检测猪日本脑炎抗体，主要操作方法如下1加入血清样品如表1所示，用样品稀释液(1％BSA)将被检血清作1∶100倍稀释后，于每孔中加入100μL，共加两孔。于37℃下作用60min后弃去反应孔中的液体；将每个孔用约300μL的洗涤液充分清洗3次，每次持续3min。在每次洗涤后将反应孔中的液体除去；最后一次除去洗涤液后，在吸水纸上拍打，除去残留的液体。
2加入辣根过氧化物酶标记的羊抗猪酶标二抗(购自晶美生物技术有限公司)每孔加入100μL酶标二抗，37℃作用45min，洗涤3次。
3加入显色底物每孔中加入100μL已加入H2O2的OPD(邻苯二胺)溶液，37℃下作用10min。
4终止反应向每孔中加入100μL终止液(2M H2SO4溶液)终止反应。
5用酶标仪测定OD值在490nm波长下测定各孔吸光度(OD值)；
6结果判定P(OD490)/N(OD490)＞2.1且S(OD490)＞0.4，即可判为阳性。
(注S为检测样品；N为已知阴性血清)表1 酶标板样品添加模式
注P已知阳性血清；N已知阴性血清S1，S2，S3，S4，S5，S6等表示加各被检样品1、特异性试验1.1交叉试验 在同一条件下用本实验室保存的JEV阴、阳性血清及猪细小病毒病阳性血清、猪圆环病毒病阳性血清、猪繁殖与呼吸障碍综合征阳性血清、猪瘟阳性血清、猪布鲁氏菌病阳性血清进行ELISA检测，每份血清重复检测4孔。通过OD值来判定阴阳性结果，以此来判定是否存在交叉反应。检测结果显示JEV阳性血清发生阳性结果，而其它均为阴性结果。
2、重复性试验2.1批内重复 用同一批制备的重组E蛋白包被板条，取已知的阴阳性血清各一份，另外取三份待检血清，在其它条件不变的情况下，应用本方法进行检测，每份样品重复四孔，根据OD值判定批内重复性。
2.2批间重复 取不同时间制备并纯化的重组E蛋白(处理方法同前所述)，用pH9.6的CBS稀释至最佳包被浓度，经包被、封闭(同前所述)后对已知的阴阳性血清及另外三份待检血清进行检测，每份血清检测4孔，重复检测五次。根据OD值判定不同时间制备的抗原建立的ELISA的可重复性。试验结果显示本发明具有良好的重复性。
3、包被抗原保存期的确定 纯化的重组E蛋白以最佳工作浓度包被并经封闭后，用包装袋封好，置于4℃保存，以后每隔1月取出用已知阴阳性血清按所建立的方法进行检测。共检测8次。结果显示包被的重组E蛋白保存8个月仍可用于检测。
4、重组E蛋白ELISA田间试验的应用从江苏、山东、浙江、安徽等地采集和收集血清样品3226份，采用本发明方法检测JEV抗体，结合样品背景进行结果分析，并对其中的300份血清分别应用本发明方法及间接血凝与血凝抑制(HIA)和乳胶凝集试剂盒(LAT)进行检测，检测结果分别见表2、表3。结果显示二者的检出符合率为96.3％和97.6％。
表2重组E蛋白-ELISA的检测应用
表3重组E蛋白—ELISA、LAT、HIA试剂盒检测结果
注检出符合率＝(共同阳性样品数+共同阴性样品数)÷总样品数×100％
权利要求
1.检测猪日本脑炎抗体的重组E蛋白ELISA试剂盒，包括以下组分1)ELISA板条以重组E蛋白作为包被抗原，每一试剂盒装有2块经质量体积比为1％的BSA(牛血清白蛋白)封闭的板条，以包装袋密封冻干保存于-20℃保存；2)洗涤液20倍浓度的pH7.4PBS溶液；3)血清稀释液1％BSA100mL；4)显色底物已加入H2O2的OPD(邻苯二胺)溶液100mL；5)终止液2M H2SO4溶液100mL；6)猪日本脑炎病毒(JEV)阳性血清5mL；7)猪日本脑炎病毒(JEV)阴性学清5mL；8)辣根过氧化物酶标记的羊抗猪酶标二抗5mL。
2.权利要求1所述用于检测猪日本脑炎抗体的重组E蛋白ELISA试剂盒，操作步骤如下1)加入血清样品用血清稀释液1％BSA将被检血清作1∶100倍稀释后，按酶标板样品添加模式于每孔中加入100μL，共加两孔，于37℃下作用60min后弃去反应孔中的液体；将每个孔用约300μL的洗涤液充分清洗3次，每次持续3min，在每次洗涤后将反应孔中的液体除去，最后一次除去洗涤液后，除去残留的液体；2)加入羊抗猪酶标二抗每孔加入100μL酶标二抗，37℃作用45min，洗涤3次；3)加入显色底物每孔中加入100μL已加入H2O2的OPD溶液，37℃下作用15min；4)终止反应向每孔中加入100μL 2M H2SO4溶液终止液终止反应；5)用酶标仪测定OD值在490nm波长下测定各孔吸光度OD值；6)结果判定检测样品已知阳性血清OD490/已知阴性血清OD630＞2.1且代检样品OD490＞0.4，即可判为阳性。
全文摘要
本发明检测猪日本脑炎抗体的重组E蛋白ELISA试剂盒，属于生物技术领域。试剂盒包括以重组E蛋白作为包被抗原的ELISA板条，PBS溶液，血清稀释液，显色底物，终止液，JEV阳性血清，JEV阴性血清等。方法经特异性、敏感性、重复性等指标的检验后，将其用于血清样品的检测。本发明的优势体现在有良好的特异性、可大量生产以及检测成本低廉，大大降低了检测成本，有着良好的应用前景。
文档编号G01N21/25GK1766620SQ20051009477
公开日2006年5月3日 申请日期2005年10月13日 优先权日2005年10月13日
发明者陈溥言, 郑其升, 曹瑞兵, 周斌, 杨耀武 申请人:南京农业大学