专利名称：重组微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及可有效用于蛋白质或多肽生产的微生物，和该蛋白质或多肽的生产方法。
背景技术：
利用微生物进行有用物质的工业生产，以酒精饮料，豆酱、酱油等食品类为代表，涵盖氨基酸、有机酸、核酸相关物质、抗生物质、糖质、脂质、蛋白质等多个种类，且其用途也扩展到食品、医药，洗剂、化妆品等日用品，或各种化工品原料的范围广泛的多个领域。
在这种利用微生物进行有用物质的工业生产中，提高其生产率是重要课题之一，其方案为采用突变等遗传学方法进行生产菌的培育。尤其是最近，随着微生物遗传学、生物技术学的发展，使用基因重组技术等，以更高的效率进行生产菌的育种，用于基因重组的宿主微生物的开发也得到发展。例如，开发出枯草杆菌(Bacillus subtilis)MarburgNo.168系统株等作为宿主微生物被认为安全优质的微生物株进一步施加改良的株。
但是，微生物原本就有用于应对自然界中的环境变化的各种各样的基因组，在使用受限的生产培养基的蛋白质等的工业生产中，处于未必高效的状态。尤其是微生物具有分解蛋白质而作为氮源和碳源利用的多种蛋白质分解酶，它们将目标蛋白质等分解，对外来蛋白质等的生产造成极大障碍。
很早以前就有试图通过使这类蛋白分解酶(蛋白酶、肽酶)的基因缺失，避免生产的目标蛋白质分解的技术，尤其是枯草杆菌，已知有报告例(参照非专利文献4)记载了以编码主要的细胞外碱性蛋白酶AprE、或中性蛋白酶NprE的基因、或这两类基因的缺失(参照非专利文献1、2、3)为代表的共计8类(参照后述表1)的细胞外或细胞壁结合型蛋白酶、肽酶的基因，其基因缺失微生物，以及这8类的蛋白酶、肽酶的基因全部缺失的枯草杆株。然而，通过本发明人等的分析，确认了这8类蛋白质分解酶基因缺失的微生物株在培养液中也具备蛋白质分解酶的活性，并认识到这会引起目标蛋白质的分解。因此，有采用特定的作为原因的蛋白质分解酶及其基因的需求。
有报告(参照非专利文献5)表明，枯草杆菌的aprX基因编码推定菌体内的丝氨酸蛋白酶AprX，但对该AprX存在于培养基中，分泌生产有效酶、蛋白质时，将该酶、蛋白质分解，导致其收量降低的内容完全没有说明。
专利文献1日本专利第288909号公报专利文献2日本专利第3210315号公报专利文献3日本特表2001-527401号公报非专利文献1J.Bacteriol.，158，411，(1984)非专利文献2J.Bacteriol.，160，15，(1984)非专利文献3J.Bacteriol.，160，442，(1984)非专利文献4Appl.Environ.Microbiol.，68，3261，(2002)非专利文献5Microbiology，145，3121-3127，(1999)发明内容本发明涉及使用已经使枯草杆菌的aprX基因或与该基因相当的基因缺失或失活的微生物作为宿主，并向其中导入有编码异种蛋白质或多肽的基因的重组微生物。
本发明还提供使用该重组微生物的蛋白质或多肽的制造方法。
图1为利用SOE-PCR进行基因缺失导入用的DNA片段的调制，以及使用该DNA片段使靶基因缺失(与耐药性基因取代)的方法的示意图。
图2为利用SOE-PCR进行基因缺失用的DNA片段的调制，使用该DNA片段的基因缺失导入用质粒的构建，以及使用该质粒的靶基因的缺失方法的示意图。
图3为采用蛋白酶酶谱对aprX缺失株和蛋白酶基因9重缺失株(Kao9株)，以及作为对照的枯草杆菌的野生型168株和蛋白酶基因8重缺失株(Kao8株)的培养上清组分的蛋白酶活性进行研究的结果。
图4为使用抗PreS2抗体，采用免疫印迹(Western Blot)法对蛋白酶基因9重缺失株(Kao9株)，以及作为对照的蛋白酶基因8重缺失株(Kao8株)的淀粉酶-PreS2融合蛋白质的生产量进行研究的结果。
图5为使用抗PreS2抗体，采用免疫印迹法对蛋白酶基因3重缺失株(Kao3株)，以及作为对照的枯草杆菌的野生型168株的淀粉酶-PreS2融合蛋白质的生产量进行研究的结果。
具体实施例方式
本发明提供一种重组微生物，特别是制造通过降低蛋白质分解酶的生产量，可提高蛋白质或多肽的生产率的宿主微生物，向该宿主微生物导入编码蛋白质或多肽的基因得到的重组微生物，并且提供使用该重组微生物的蛋白质或多肽的制造方法。
本发明人等在研究了使用微生物生产有效蛋白质或多肽时起到不必要或有害作用的蛋白质分解酶之后发现，枯草杆菌的推定菌体内丝氨酸蛋白酶AprX存在于培养基中，在分泌生产有效酶、蛋白质时，将该酶、蛋白质分解，降低了其收量。而且发现，将枯草杆菌的aprX基因缺失或失活的微生物株用作宿主微生物，可大幅度避免外来的有效酶和蛋白质的分解，可高效生产酶和蛋白质。
使用本发明的重组微生物，就可以避免目标蛋白质和多肽的分解，高效大量地生产目标蛋白质和多肽。
在本发明中，氨基酸序列和碱基序列的同一性按照Lipman-Pearson法(Science，227，1435，(1985))计算。更具体而言，使用遗传信息处理软件Genetyx-Win(Software开发)的同源性分析(Search homology)程序，以Unit size to compare(ktup)为2进行分析，计算而得。
用于构建本发明微生物的宿主微生物(下文也称为“亲本微生物”)优选为具有枯草杆菌的aprX基因(Nature，390，249-256，(1997)，及JAFANJapan Functional Analysis Network forBacillus subtilis(BSORF DB，http://bacillus.genome.ad.jp/，2003年6月17日更新)中的基因编号BG12567)或与该基因相当的基因的微生物，且其既可以是野生型宿主微生物，也可以是实施了变异的宿主微生物。具体可举出枯草杆菌等芽孢杆菌属(Bacillus)细菌、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)细菌、或酵母等，其中优选为芽孢杆菌属细菌。另外，为明确所有基因组信息，确立遗传工程、基因工程技术，以及因具有在蛋白质和菌体外分泌生产的能力，特别优选为枯草杆菌。
本发明中作为缺失或失活对象的基因，为报告表明编码枯草杆菌的推定菌体内丝氨酸蛋白酶AprX的aprX基因(Microbiology，145，3121，(1999))，基因编号BG12567(Nature，390，249-256，(1997)及JAFANJapan Functional Analysis Network forBacillus subtilis(BSORF DB，http://bacillus.genome.ad.jp/，2003年6月17日更新)、或与该基因相当的基因。
与aprX基因相当的基因可举出具有与枯草杆菌的aprX基因相同功能的，或碱基序列具有与aprX基因70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、特别优选为98％以上的同一性的，来自其它微生物，优选为来自芽孢杆菌属细菌的基因，具体可举出耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)的BH1930基因(aprX基因)、Oceanobacillus iheyensis的OB2375基因等。
在本发明中，也可通过在上述基因内插入其它DNA片段或向该基因转录、翻译起始控制区域施加变异等方法使靶基因失活达到本发明的目的，更优选为使靶基因物理性缺失的方法。
另外，缺失或失活的基因除了aprX基因或与aprX基因相当的基因之外，还可组合编码已知向细胞外分泌或与细胞表层结合的其它蛋白酶类的1个以上的基因缺失。且在本发明的微生物的构建时，还可组合细胞内的蛋白酶或蛋白酶之外的基因组的缺失或失活，有望在提高生产率方面有更大的效果。表1记载了枯草杆菌的aprX基因或与该aprX基因相当的基因以外的编码在细胞外分泌或与细胞表层结合的蛋白酶的基因，可以期待通过与aprX基因与aprX基因相当的基因组合，使其缺欠或失活的效果的基因。在此情况下，除aprX基因之外，优选使选自aprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr和wprA各个基因或与该基因相当的9种基因中的1种以上的基因的缺失或失活。且更优选使除aprX基因之外，分别编码作为主要的细胞外碱性蛋白酶的AprE和中性蛋白酶NprE的aprE和nprE基因，或与该基因相当的3种基因的缺失或失活，特别优选使除aprX基因之外，aprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr、wprA各个基因的全部或相当于该基因的9种基因全部缺失或失活。
表1
基因组的缺失或失活的顺序，除按照计划使aprX基因或与aprX基因相当的基因，以及表1所示的蛋白酶基因缺失或失活的方法之外，还可以在随机地使基因缺失或失活变异之后，通过适当的方法，对蛋白质生产率进行评价和对基因进行分析，这也能够使靶基因组缺失或失活。
靶基因的缺失或失活可采用例如同源重组方法。即，采用PCR等方法，构建利用碱基取代或碱基插入等导入失活变异的靶基因，或包括靶基因的外侧区域但不包括靶基因的直链状DNA片段等，将其导入亲本微生物细胞内，在亲本微生物基因组的靶基因变异部位的外侧两处区域，或在靶基因外侧两处区域引起两次交叉的同源重组，就可以与使基因组上的靶基因缺失或失活的基因片段进行取代。或者，将含有一部分靶基因的DNA片段克隆在适当的质粒上得到的环状重组质粒导入亲本微生物细胞内，利用靶基因的一部分区域中的同源重组，分割亲本微生物基因组上的靶基因，也可以实现失活。
尤其是在用于构建本发明微生物的亲本微生物采用枯草杆菌的情况下，已有几个报告(Mol.Gen.Genet.，223，268(1990)等)举例说明了利用同源重组，使靶基因缺失或失活的方法，通过反复使用该方法，可得到本发明的宿主微生物。
另外，针对随机基因的缺失或失活，还可采用随机克隆的DNA片段，引发与上述方法同样的同源重组的方法，或向亲本微生物照射γ射线等进行实施。
下面更具体地说明了采用利用SOE(重叠延伸拼接法splicing byoverlap extension)-PCR法(Gene，77，61，(1989))调制的缺失导入用DNA片段的二重交叉法的缺失方法，但本发明的基因缺失方法不限于下述方法。
本发明所使用的缺失导入用DNA片段为，在与缺失对象基因的上游相邻的约0.2～3kb片段，和与下游相邻的同样约0.2～3kb的片段之间，插入了耐药性标记基因片段的片段。首先，利用第一次的PCR，调制缺失对象基因的上游片段和下游片段，以及耐药性标记基因片段三种片段，此时使用例如，设计成上游片段的下游末端附加耐药性标记基因的上游侧10～30碱基对序列，而下游片段的上游末端附加耐药性标记基因的下游侧10～30碱基对序列的引物(图1)。
然后，以第一次调制的三种PCR片段为模版，使用上游片段的上游侧引物与下游片段的下游侧引物，进行第二次的PCR，由此得到在附加于上游片段的下游末端和下游片段的上游末端的耐药性标记基因中，与耐药性标记基因片段发生退火，PCR放大，结果，就可得到在上游侧片段与下游侧片段之间插入了耐药性标记基因的DNA片段(图1)。
在耐药性标记基因使用耐大观霉素基因的情况下，采用例如与表2所示的引物组适当的模版DNA，使用Pyrobest DNA聚合酶(宝酒制造)等普通PCR用酶试剂盒等，按照已出版书籍(PCR Protocols.CurrentMethods and Applications，Edited by B.A.White，Humana Press，pp251(1993)，Gene，77，61，(1989)等)所示的常规条件，实施SOE-PCR，得到各基因缺失导入用DNA片段。
当采用感受态细胞(Competent Cell)转化法(J.Bacteriol.93，1925(1967))等将如上所述得到的缺失导入用DNA片段引入细胞内，则在具有同一性的缺失对象基因的上游和下游的相同区域，在细胞内产生基因重组，可通过耐药性标记的选择，分离靶基因取代为耐药性基因的细胞(图1)。即，在导入使用表2所示引物组调制的缺失导入用DNA片段的情况下，可利用以基因组为模版的PCR等方法，确认含有大观霉素的琼脂培养基上繁殖的菌落分离，目标基因缺失，取代为耐大观霉素基因。
另外，作为本发明中的含有aprX基因或与aprX基因相当的基因的蛋白酶基因的缺失方法，也可采用使用插入有通过SOE-PCR法调制的缺失导入用DNA片段的缺失导入用质粒的2阶段的一重交叉法。以下，针对该方法进行说明。
本发明中使用的缺失导入用DNA片段为，在与缺失对象基因的上游相邻的约0.2～3kb片段，和与下游相邻的同样约0.2～3kb的片段结合的DNA片段。还可使用该DNA片段的下游或上游与耐氯霉素基因等耐药性标记基因片段连接的DNA片段。首先，利用第一次的PCR，调制缺失对象基因的上游片段和下游片段，和根据需要调制的耐药性标记基因片段三种片段，此时，使用附加有作为连接对象的DNA片段末端10～30碱基对序列的引物。例如，在上游片段、下游片段和耐药性标记基因片段连接的情况下，也可以使用设计成使上游片段的下游末端附加有下游片断的上游侧10～30碱基对序列、或使下游片断的下游末端附加有耐药性标记基因片段的上游侧10～30碱基对序列的引物(图2)。
然后，将第一次调制的各PCR片段混合，制成模版，在作为靶的连接片段中，使用分别形成最上游侧和最下游侧的一对引物，进行第二次的PCR，可调制目的的缺失导入用DNA片段。具体而言，例如，在上游片段、下游片段和耐药性标记基因片段连接的情况下，使用上游片段的上游侧引物和耐药性标记基因片段的下游侧引物，进行第二次PCR，在与上游片段的下游末端附加的下游片断相同的序列中，或与耐药性标记基因片段相同的序列中，产生退火，PCR增幅的结果，得到上游侧片段、下游侧片段和耐药性标记基因片段连接的缺失导入用DNA片段(图2)。
另外，通过将按照上述方法等得到的缺失导入用DNA片段插入使用通常的限制酶和DNA连接酶在宿主菌内没有放大的质粒DNA，或温度感受性质粒等可轻易除去的质粒DNA中，构建缺失导入用质粒。宿主菌内没有放大的质粒DNA例子可以举出，在例如以枯草杆菌为宿主的情况下，为pUC18、pUC118、pBR322等，但也并不限于此。
然后，按照感受态细胞转化法(J.Bacteriol.93，1925(1967))等实施缺失导入用质粒的宿主菌的转化，利用插入有质粒的上游片段或下游片段与基因组上相同区域间的1重交叉的同源重组，得到缺失导入用质粒融合在宿主菌基因组DNA内的转化体(图2)。转化体的选择利用缺失导入用质粒的耐氯霉素基因等的标记基因的耐药性作为指标进行即可。
在如上所述得到的转化体的基因组上，在aprX基因或与aprX基因相当的基因等应缺失基因的上游区域及下游区域的序列中，来自宿主菌基因组和来自缺失导入用质粒的序列重复存在。在该上游区域或下游区域中，在与获得转化体时同源重组区域不同的区域，引发基因组内同源重组，与来自含有耐药性标记基因的缺失导入用质粒的区域一起，产生aprX基因或与aprX基因相当的基因等应缺失靶基因的缺失(图2)。引发基因组内同源重组的方法可举出例如感受态细胞衍生方法(J.Bacteriol.93，1925(1967))，仅用普通的培养基，在培养中，也可以自然引发同源重组。符合目标的引起基因组内同源重组的株，同时发生耐药性标记基因缺失，失去了耐药性，因此可从药剂感受性株中选择。可从这些株中提取基因组DNA，利用PCR法等，确认靶基因的缺失。
发明人认为，在选择目标缺失株时，基因组内的同源重组在10-4左右的稍低频率下产生，因此不易直接从耐药性选择感受性变化的株。因此，为高效取得靶缺失株，优选实施提高药剂感受性株的存活比例等工作。药剂感受性株的浓缩方法可举出，例如利用氨苄西林等青霉素系抗生物质对繁殖细胞有杀菌的作用，另一方面，对非繁殖细胞不发生作用的浓缩法(Methods in Molecular Genetics，Cold Spring HarborLabs，(1970))等。在利用氨苄西林等进行浓缩的情况下，需要将例如具有耐氯霉素等对宿主细胞具有制菌作用的药剂的基因用作缺失导入用质粒的耐药性标记基因。在该含有适量制菌作用的药剂的适当的培养基中，可繁殖保持该耐药性基因的耐性株，该耐药性基因缺失的感受株既不繁殖，也不死亡。在该条件下，当添加适当浓度的氨苄西林等青霉素系抗生物质进行培养时，一方面，预计使其繁殖的耐性株死亡，而另一方面，感受性株未受到氨苄西林等的作用，结果，就提高了感受性株的存活比例。将实施了如上所述浓缩操作的培养液涂敷在适当的琼脂培养基上，进行培养，用复制法等确认出现的菌落是否存在对标记药剂的耐药性，就可选择高效的感受株。
通过将编码靶蛋白质或多肽的基因导入含有1个以上按照如上所述的方法构建的枯草杆菌的aprX基因或与该基因相当的基因的使蛋白酶基因缺失或失活的宿主微生物变异株，就可得到本发明的重组微生物。
使用本发明的微生物生产的目标蛋白质或多肽可举出例如洗剂、食品、纤维、饲料、化工品、医疗、诊断等各种产业用酶、生理活性因子等蛋白质和多肽。另外，根据产业用酶的功能，包括氧化还原酶(Oxidoreductase)、转移酶(Transferase)、水解酶(Hydrolase)、裂合酶(Lyase)、异构酶(Isomerase)、合成酶(Ligase/Synthetase)等，优选为纤维素酶、α-淀粉酶、蛋白酶等水解酶的基因。具体可举出属于多糖水解酶的分类(Biochem.J.，280，309(1991))中族一5的纤维素酶。其中，可举出来自微生物的，尤其是芽孢杆菌属的细菌的纤维素酶。更具体例可举出来自由序列号2或4所示的氨基酸序列构成的芽孢杆菌属细菌的碱性纤维素酶，具有该氨基酸序列中的1个或多个氨基酸缺失、取代或附加的氨基酸序列的线性纤维素酶，另外，还可举出具有与该氨基酸序列70％、优选为80％、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、特别优选为98％以上的同一性的氨基酸序列的纤维素酶。
此外，α-淀粉酶的具体例可举出来自微生物的α-淀粉酶，特别优选为来自芽孢杆菌属的液化型淀粉酶。更具体例可举出来自具有由序列号61所示的氨基酸序列构成的芽孢杆菌属的碱性淀粉酶，具有与该氨基酸序列70％、优选为80％、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、特别优选为98％以上的同一性的氨基酸序列构成的淀粉酶。另外，氨基酸序列的同一性按照Lipman-Pearson法(Science，227，1435，(1985))计算。而蛋白酶的具体例可举出来自微生物的，尤其是来自芽孢杆菌属细菌的丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶等。
另外，按照本发明生产的蛋白质可举出来自人类等高等生物的生理活性蛋白质、酶等。优选例可举出干扰素α、干扰素β、生长激素、唾液腺淀粉酶等。另外，构成生理活性蛋白质等的一部分结构域等也可以表达，例如，可举出人类C型肝炎病毒抗体的抗原识别结构域PreS2等。
另外，靶蛋白质或多肽基因优选为，按照适当的形态，连接选自其上游的有关该基因的转录、翻译、分泌的控制区域，即，选自包含启动字和转录起始点的转录起始控制区域、包含核糖体连接部位和起始密码子的翻译起始控制区域和分泌信号肽区域中的一个以上的区域。特别是优选由转录起始控制区域、翻译起始控制区域和分泌信号区域构成的3个区域连接。更优选分泌信号肽区域为来自芽孢杆菌属细菌的纤维素酶基因，转录起始控制区域和翻译起始控制区域为该纤维素酶基因的上游0.6～1kb区域，按照适当的形态，与靶蛋白质或多肽基因连接。例如，日本特开2000-210081号公报、日本特开平4-190793号公报等所述的芽孢杆菌属细菌，即来自KSM-S237株(2003年4月14日， 日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏编号FERM BP-7875)、KSM-64株(2003年4月14日， 日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏编号FERM BP-2886)的纤维素酶基因的转录起始控制区域、翻译起始控制区域和分泌信号肽区域与靶蛋白质或多肽的结构基因按照适当形态连接。更具体而言，优选为由序列号1所示的碱基序列的碱基编号1～659的碱基序列，由序列号3所示的碱基序列构成的纤维素酶基因的碱基编号1～696的碱基序列，或相对于该碱基序列具有70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、特别优选为98％以上的同一性的碱基序列构成的DNA片段，或由上述任意碱基序列的一部分缺失的碱基序列构成的DNA片段，与靶蛋白质或多肽的结构基因适当连接。另外，其中，尽管由上述碱基序列的一部分缺失的碱基序列构成的DNA片段意为，上述碱基序列的一部分缺失，但仍保持着基因的转录、翻译、分泌相关功能的DNA片段。
通过将含有上述靶蛋白质或多肽基因的DNA片断与适当的质粒载体连接的重组质粒利用普通的转化法导入宿主微生物细胞中，就可得到本发明的重组微生物。并且，使用该DNA片段与宿主微生物基因组适合的相同区域连接的DNA片段，直接导入宿主微生物基因组，也可以得到本发明的重组微生物。
本发明的使用重组微生物的靶蛋白质或多肽的生产可通过将该株在含有同化性碳源、氮源、其它必需组分的培养基中接种，用通常的微生物培养法进行培养，在培养完毕后，采集、精制蛋白质或多肽而进行。对培养基的成分、组成等没有特别限定，优选使用含有麦芽糖或麦芽低聚糖作为碳源的培养基，这样可达到更好的结果。
综上，可使用使表1所示的任意枯草杆菌的基因，或选自与该基因相当的基因的1个以上的基因的缺失或失活的宿主微生物变异株，以及使用该变异株构建重组微生物，使用上述原料时，可高效生产有用的蛋白质或多肽。
实施例在下述实施例中，具体说明包括枯草杆菌的aprX基因(BG12567)的共计9种蛋白水解酶基因缺失的微生物的构建，以及将该微生物用作宿主的纤维素酶生产或人体B型肝炎病毒抗体的抗原识别结构域PreS2的生产。并具体说明除编码主要的两种细胞外蛋白酶的aprE基因(BG10190)和nprE基因(BG10448)之外，还包括aprX基因(BG12567)的合计三种蛋白酶基因缺失的微生物的构建、以及将该微生物用作宿主的人体B型肝炎病毒抗体的抗原识别结构域PreS2的生产。
表2-1
表2-2
表3
实施例1epr基因缺失用质粒的构筑以从枯草杆菌168株中提取出的基因组DNA为模版，使用表2所示的eprfw1和eprUpr，以及eprDNf和eprrv-rep各引物组，分别调制基因组上与epr基因的上游相邻的0.6kb片段(A)和与下游相邻的0.5kb片段(B)。并调制来自其它质粒pC194(J.Bacteriol.150(2)，815(1982))的耐氯霉素基因的上游与来自质粒pUB110(Plasmid 15，93(1986))的repU基因的启动子区域连接的1.2kb片段(C)。然后，将得到的(A)、(B)、(C)三片段混合，作为模版，使用表2的引物eprfw2和Cmrv2，进行SOE-PCR，按照(A)(B)(C)的顺序将这样的3个片段连接，得到2.2kb的DNA片段(参照图2)。对该DNA片段的末端进行平滑化和5′-磷酸化处理，插入质粒pUC118(Methods Enzymol.153，3(1987))的Smal限制酶部位，构建epr基因缺失用质粒pUC118-CmrΔepr。并且，上述1.2kb片段(C)如下进行调制将使用repUfw和repUr-Cm的引物对(表2)和作为模版的质粒pUB110调制的含有repU基因启动子区域的0.4kb片段(D)，和使用CmUf-rep和Cmrv1的引物对(表2)和作为模版的质粒pC194调制的含有耐氯霉素基因的0.8kb片段(E)混合，作为模版，使用表2所示的引物repUfw和Cmrv1，进行SOE-PCR而调制。
实施例2使用缺失用质粒的epr基因缺失株的构建采用感受态细胞转化法(J.Bacteriol.93，1925(1967))，将实施例1中构建的epr基因缺失用质粒pUC118-CmrΔepr导入枯草杆菌168株，取得在与epr基因上游区域、或下游区域相当的区域之间利用1重交叉的同源重组而与基因组DNA融合的转化株，该转化株具有耐氯霉素基指标。将所得的转化株在LB培养基上接种，在37℃下培养两小时后，再次进行感受态细胞诱导操作，由此，诱导在基因组上重复存在的epr基因上有区域、或下游区域之间的基因内同源重组。如图2所示，在与质粒导入时不同的区域进行同源重组的情况下，伴随来自质粒的耐氯霉素基因和pUC118载体区域的脱落，epr基因缺失。接着，为了提高成为氯霉素感受性株的存在比例，以以下要领进行氨苄西林浓缩操作。在包括感受态细胞诱导后的培养液最终浓度5ppm的氯霉素和最终浓度为100ppm的氨苄西林钠的1mL的LB培养基中，接种使得在600nm中的浓度(OD600)为0.003。在37℃下培养5小时后，添加10μL的10,000ppm的氨苄西林钠水溶液，在进行3小时的培养。培养结束后，在2％的氯化钠水溶液中对菌体进行离心清洗，之后悬浊于1mL的2％的氯化钠水溶液，将100μL的悬浊液涂抹在LB琼脂培养基上。在37℃下进行约15小时的孵化，在培育的株中，选择伴随质粒区域的脱落形成氯霉素感受性的株。以选择的株的基因组DNA为模版，使用表2所示的引物eprfw2和eprrv-rep，进行PCR，进行epr基因缺失的确认，取得epr基因缺失株。
实施例3蛋白酶基因8重缺失株的构建对于epr基因缺失株，进行与与epr基因缺失同样的wprA基因缺失作为进一步的缺失。即，与实施例1同样，构建wprA基因缺失用质粒pUC118-CmrΔwprA，通过向基因组DNA导入构建的质粒以及此后的基因组内同源重组，取得由wprA基因的缺失得到的epr基因和wprA基因的双重缺失株。此后，反复实施同样的操作，依次使mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、aprE各个基因缺失，最终构建8种蛋白酶基因缺失的蛋白酶8重缺失株，将其命名为Kao8株。实施各缺失时所用的引物序列如表2所示，且各引物与实施例1所示的epr基因缺失中使用的引物的对应关系如表3所示。
实施例4aprX基因缺失株的构建(耐大观霉素基因的取代)根据使用按照SOE(splicing by overlap extension)-PCR(Gene，77，61，(1989))调制的缺失导入用DNA片段的二重交叉法，构建aprX基因缺失株。首先，使用表2所示的aprX+5F和aprX+563R，以及aprX+775F和aprX+1320R的各引物组，以由枯草杆菌168株提取的基因组DNA为模版，分别调制含有aprX基因上游的5′末端侧的558bp片段(F)和3′末端侧545bp片段(G)。另一方面，由质粒pDG1727(Gene，167，335，(1995))的BamHI和XhoI限制酶切断点，切出耐大观霉素性基因区域，在pBluescript II SK(+)(Stratagene)上插入BamHI和XhoI限制酶切断点，构建pBlueSPR。以PBlueSPR的DNA为模版，使用PB-M13-20、PB-M13Rev(表1)的引物组，扩大耐大观霉素性基因的区域(H)。然后，以(F)、(G)和(H)的DNA片段为模版，使用aprX+5F、aprX+1320R引物组，按照SOE-PCR法，调制按照(E)、(H)、(G)顺序连接的DNA片段。使用调制的DNA片段，进行按照感受态细胞转化法的枯草杆菌168株的转化，将在含有大观霉素(100μg/mL)的LB琼脂培养基上繁殖的菌落作为转化体分离。提取所得的转化体的基因组，确认由PCR使aprX基因缺失，取代为耐大观霉素基因。如上所述，构建枯草杆菌的aprX基因缺失株，命名为ΔaprX(Sp)株。
实施例5包括aprX基因缺失的蛋白酶基因9重缺失株的构建使用按照实施例4所示的(E)(H)(G)顺序连接的DNA片段，按照感受态细胞转化法进行蛋白酶基因8重缺失株(实施例3，Kao8株)的转化，将在含有大观霉素(100μg/mL)的LB琼脂培养基上繁殖的菌落作为转化体分离。提取所得的转化体的基因组，确认由PCR使aprX基因缺失，取代为耐大观霉素基因。如上所述，施加枯草杆菌的aprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr和wprA的8基因的多重缺失，构建aprX基因缺失的株，将其命名为Kao9株。
实施例6包括aprX基因缺失的蛋白酶基因9重缺失株的蛋白酶酶谱分析将实施例1～5所得的各基因缺失株和作为对照的枯草杆菌168株培养100小时后，以10,000rpm的转速，对培养液实施5分钟的离心处理，将其上清溶解形成1×样品缓冲液(62.5mM Tris-HCl(pH6.8)，5％2-巯基乙醇，2％SDS，5％蔗糖，0.002％BPB(Bromophenolblue))，形成蛋白酶酶谱的样品。在避免样品煮沸，实施含有0.1％明胶的12％SDS-PAGE之后，在Renaturaion buffer(2.5％Triton X-100)中，在室温下振荡30分钟，再于Zymogram Developing buffer(50mMTris-HCl(pH8.5)、200mM NaCl、5mM CaCl2、0.02％Brij35)下，在室温下振荡30分钟。在再次替换为Zymogram Developing buffer之后，在37℃下，进行12小时孵化后，用CBB(对考马斯亮蓝染色液)对凝胶染色。按照上述方法对蛋白酶进行酶谱分析(图3)。结果可知，即使在8重缺失株(Kao8株)中，也可以检测出蛋白酶活性带，aprX基因缺失株中，本带消失，Kao8株中残留的蛋白酶活性为AprX。另外，含有aprX基因的蛋白酶基因9重缺失株(Kao9株)未检测出蛋白酶活性带。
实施例7碱性纤维素酶的生产用原生质体转化法，将来自芽孢杆菌(Bacillus sp.)KSM-S237株的碱性纤维素酶基因(日本特开2000-210081号公报，序列号1)片段(3.1kb)插入穿梭载体pHY300PLK的BamHI限制酶切断点的重组质粒pHY-S237，导入实施例1～5中得到的各基因缺失株和作为对照的枯草杆菌1 68株。在5mL的LB培养基中，以一夜的时间，在30℃下，对如上所述得到的株进行振荡培养，再将该培养液0.03mL在30mL的2×L-麦芽糖培养基(2％胰胨，1％酵母提取液，1％NaCl，7.5％麦芽糖，7.5ppm硫酸锰4-5水合物，15ppm四环素)中接种，在30℃下，进行4天的振荡培养。培养之后，测量采用离心分离除去了菌体的培养液上清的碱性纤维素酶的活性，求得通过培养在菌体外分泌生产的碱性纤维素酶量。结果如表4所示，无论是在使用aprX基因缺失株ΔaprX(Sp)株的情况下，还是在使用蛋白酶基因多重缺失株(Kao9株)的情况下，与对照的168型(野生型)的情况相比，都可实现碱性纤维素酶的高分泌生产。
表4
实施例8利用Kao8株和Kao9株的人体B型肝炎病毒抗原识别PreS2结构域的生产利用通常的感受态细胞转化法，将在编码来自枯草杆菌的淀粉酶基因的N末侧522氨基酸的区域的下游插入了连接人体B型肝炎病毒抗原认识PreS2结构域片段的DNA片段(165bp)的重组质粒pTUBE52-preS2(Appl.Microbiol.Biotechnol.，40，341(1993))导入实施例3和5所得Kao8株和Kao9株。在一夜内，在30℃下，对所得转化株进行振荡培养，再将该培养液0.03mL在30mL的2×L一麦芽糖培养基(2％胰胨，1％酵母提取液，1％NaCl，7.5％麦芽糖，7.5ppm硫酸锰4-5水合物，15ppm四环素)中接种，在30℃下，进行100小时的振荡培养。培养之后，采用使用抗PreS2抗体(株式会社特殊免疫研究所)的免疫印迹分析(Western Blot)，求取采用离心分离除去了菌体的培养液上清中的淀粉酶-PreS2蛋白质量。首先，将培养上清溶解形成1×样品缓冲液(62.5mM Tris-HCl(pH6.8)，5％2-巯基乙醇，2％SDS，5％蔗糖，0.002％BPB(Bromophenol blue))，进行10％SDS-PAGE之后，在PVDF(polyvinyl difluoridine membraneImmobilon；0.45μm pore size；Millipore)上形成印迹。一次抗体使用抗preS2抗体(Hyb-5520株式会社特殊免疫研究所)。二次抗体使用过氧化物酶标记抗鼠IgG抗体(Amersham Pharmacia biotech)。并利用ECL Plus Western blotting reagent pack(RPN2124；AmershamPharmacia biotech)检测。结果，如图4所示，蛋白酶基因9重缺失株(Kao9株)与8重缺失株(Kao8株)相比，可检测出明显强效的淀粉酶-PreS2带，确认因aprX的缺失大幅度提高了淀粉酶-PreS2的生产率。
实施例9aprE、nprE、aprX三基因缺失的株的构建进行除主要的两个编码细胞外蛋白酶的aprE基因和nprE基因之外，还包括aprX基因的共计3种蛋白酶缺失的微生物的构建。与实施例1和2同样，构建aprE基因缺失用质粒pUC118-CmrΔaprE，利用向枯草杆菌168株基因组DNA导入构建的质粒，和随后的基因组内同源重组带来的aprE基因的缺失，得到aprE基因的单独缺失株。然后，与实施例3同样，构建aprE、nprE和aprX基因缺失的蛋白酶基因3重缺失株，命名为Kao3株。另外，在构建Kao3株种中，使aprX基因缺失时所用的引物与其它蛋白酶基因缺失时所用的引物的对应关系如表3所示。
实施例10利用Kao3株的人体B型肝炎病毒抗原识别PreS2结构域的生产与实施例8同样，采用通常的感受态细胞转化法，将淀粉酶-PreS2生产用质粒pRUBE52-preS2导入实施例9所得的Kao3株以及用作对照的枯草杆菌168株。在一夜中，在30℃下，对所得的转化株进行振荡培养，并将该培养液0.03mL在30rnL的2×L-麦芽糖培养基(2％胰胨，1％酵母提取液，1％NaCl，7.5％麦芽糖，7.5ppm硫酸锰4-5水合物，15ppm四环素)中接种，在30℃下，进行25小时的振荡培养。培养之后，采用使用抗PreS2抗体(株式会社特殊免疫研究所)的免疫印迹分析，求取采用离心分离除去了菌体的培养液上清中的淀粉酶-PreS2蛋白质量。如图5所示，在对照的168株(野生株)的情况下没有确认的淀粉酶-PreS2带在蛋白酶基因3重缺失株中被检测出来，确认提高了淀粉酶-PreS2的生产率。
序列表<110>花王株式会社国立大学法人信州大学<120>重组微生物<130>KS0868<150>JP 2004-368166<151>2004-12-20<160>61<170>PatentIn Ver.3.1<210>1<211>3150<212>DNA<213>芽孢杆菌KSM-S237<220>
<221>CDS<222>(573)..(3044)<223>
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<221>mat_peptide<222>(660)..()<223>
<400>1gatttgccga tgcaacaggc ttatatttag aggaaatttc tttttaaatt gaatacggaa 60taaaatcagg taaacaggtc ctgattttat ttttttgagt tttttagaga actgaagatt 120gaaataaaag tagaagacaa aggacataag aaaattgcat tagttttaat tatagaaaac 180
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ggg tac gct aca aac cct gag tta atc aaa caa aga gtg att gat gga 977Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Leu Ile Lys Gln Arg Val Ile Asp Gly95 100 105att gag tta gcg att gaa aat gac atg tat gtt att gtt gac tgg cat 1025Ile Glu Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met Tyr Val Ile Val Asp Trp His110 115 120gtt cat gcg cca ggt gat cct aga gat cct gtt tat gca ggt gct aaa 1073Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp Pro Val Tyr Ala Gly Ala Lys125 130 135gat ttc ttt aga gaa att gca gct tta tac cct aat aat cca cac att 1121Asp Phe Phe Arg Glu Ile Ala Ala Leu Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile140 145 150att tat gag tta gcg aat gag ccg agt agt aat aat aat ggt gga gca 1169Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala155 160165 170ggg att ccg aat aac gaa gaa ggt tgg aaa gcg gta aaa gaa tat gct 1217Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp Lys Ala Val Lys Glu Tyr Ala175 180 185gat cca att gta gaa atg tta cgt aaa agc ggt aat gca gat gac aac 1265Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Lys Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn190 195 200att atc att gtt ggt agt cca aac tgg agt cag cgt ccg gac tta gca 1313Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala205 210 215gct gat aat cca att gat gat cac cat aca atg tat act gtt cacttc 1361Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His Thr Met Tyr Thr Val His Phe220 225 230tac act ggt tca cat gct gct tca act gaa agc tat ccg tct gaa act 1409Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr Glu Ser Tyr Pro Ser Glu Thr235 240 245 250cct aac tct gaa aga gga aac gta atg agt aac act cgt tat gcg tta 1457Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu255 260 265
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Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Ser Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp280 285 290Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp295 300 305Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr310 315 320Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Asn Leu Asp Pro Gly Pro325 330 335Asp His Val Trp Ala Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val340 345 350 355Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys360 365 370Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe375 380 385Gly Val Asn Ser Asp Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ile Ala Val Asp Asn390 395 400Glu Asn Asn Thr Leu Lys Val Ser Gly Leu Asp Val Ser Asn Asp Val405 410 415Ser Asp Gly Asn Phe Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asn Gly Trp420 425 430 435Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val440 445 450
Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ala Ile Ala Ala Ile Pro Gln Ser455 460 465Ser Lys Ser Gly Trp Ala Asn Pro Glu Arg Ala Val Arg Val Asn Ala470 475 480Glu Asp Phe Val Gln Gln Thr Asp Gly Lys Tyr Lys Ala Gly Leu Thr485 490 495Ile Thr Gly Glu Asp Ala Pro Asn Leu Lys Asn Ile Ala Phe His Glu500 505 510 515Glu Asp Asn Asn Met Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Asp Ala520 525 530Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val535 540 545Glu Ile Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser550 555 560Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser565 570 575Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala580 585 590 595Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp600 605 610Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly615 620 625
Glu Asn Asp Tyr Val Ala Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala630 635 640Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn645 650 655Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu660 665 670 675Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys680 685 690Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg695 700 705Asn Met Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg710 715 720Val Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro725 730 735Val Glu Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp740 745 750 755Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys760 765 770Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala775 780 785Val Lys Asn Glu Ala Lys Lys Lys790 795
<210>3<211>3332<212>DNA<213>芽孢杆菌KSM-64<220>
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<221>sig_peptide<222>(610)..(696)<223>
<220>
<221>mat_peptide<222>(697)..()<223>
<400>3agtacttacc attttagagt caaaagatag aagccaagca ggatttgccg atgcaaccgg60cttatattta gagggaattt ctttttaaat tgaatacgga ataaaatcag gtaaacaggt 120cctgatttta tttttttgaa tttttttgag aactaaagat tgaaatagaa gtagaagaca 180acggacataa gaaaattgta ttagttttaa ttatagaaaa cgcttttcta taattattta 240tacctagaac gaaaatactg tttcgaaagc ggtttactat aaaaccttat attccggctc 300tttttttaaa cagggggtga aaattcactc tagtattcta atttcaacat gctataataa 360atttgtaaga cgcaatatac atcttttttt tatgatattt gtaagcggtt aaccttgtgc 420tatatgccga tttaggaagg gggtagattg agtcaagtag tcataattta gataacttat 480aagttgttga gaagcaggag agaatctggg ttactcacaa gttttttaaa acattatcga 540aagcactttc ggttatgctt atgaatttag ctatttgatt caattacttt aataatttta 600ggaggtaat atg atg tta aga aag aaa aca aag cag ttg att tct tcc att 651
Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile-25 -20ctt att tta gtt tta ctt cta tct tta ttt ccg aca gct ctt gca gca 699Leu Ile Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Thr Ala Leu Ala Ala-15 -10 -5 -1 1gaa gga aac act cgt gaa gac aat ttt aaa cat tta tta ggt aat gac 747Glu Gly Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn Asp5 10 15aat gtt aaa cgc cct tct gag gct ggc gca tta caa tta caa gaa gtc 795Asn Val Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val20 25 30gat gga caa atg aca tta gta gat caa cat gga gaa aaa att caa tta 843Asp Gly Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu35 40 45cgt gga atg agt aca cac gga tta caa tgg ttt cct gag atc ttg aat 891Arg Gly Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn50 55 60 65gat aac gca tac aaa gct ctt gct aac gat tgg gaa tca aat atg att 939Asp Asn Ala Tyr Lys Ala Leu Ala Asn Asp Trp Glu Ser Asn Met Ile70 75 80cgt cta gct atg tat gtc ggt gaa aat ggc tat gct tca aat cca gag 987Arg Leu Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Ser Asn Pro Glu85 90 95tta att aaa agc aga gtc att aaa gga ata gat ctt gct att gaa aat1035Leu Ile Lys Ser Arg Val Ile Lys Gly Ile Asp Leu Ala Ile Glu Asn100 105 110gac atg tat gtc atc gtt gat tgg cat gta cat gca cct ggt gat cct1083Asp Met Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro115 120 125aga gat ccc gtt tac gct gga gca gaa gat ttc ttt aga gat att gca1131Arg Asp Pro Val Tyr Ala Gly Ala Glu Asp Phe Phe Arg Asp Ile Ala130 135 140 145gca tta tat cct aac aat cca cac att att tat gag tta gcg aat gag1179
Ala Leu Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu150 155 160cca agt agt aac aat aat ggt gga gct ggg att cca aat aat gaa gaa1227Pro Ser Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu165 170 175ggt tgg aat gcg gta aaa gaa tac gct gat cca att gta gaa atg tta1275Gly Trp Asn Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu180 185 190cgt gat agc ggg aac gca gat gac aat att atc att gtg ggt agt cca1323Arg Asp Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro195 200 205aac tgg agt cag cgt cct gac tta gca gct gat aat cca att gat gat1371Asn Trp Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp210 215 220 225cac cat aca atg tat act gtt cac ttc tac act ggt tca cat gct gct1419His His Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala230 235 240tca act gaa agc tat ccg cct gaa act cct aac tct gaa aga gga aac1467Ser Thr Glu Ser Tyr Pro Pro Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn245 250 255gta atg agt aac act cgt tat gcg tta gaa aac gga gta gca gta ttt1515Val Met Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe260 265 270gca aca gag tgg gga act agc caa gca aat gga gat ggt ggt cct tac1563Ala Thr Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Asn Gly Asp Gly Gly Pro Tyr275 280 285ttt gat gaa gca gat gta tgg att gag ttt tta aat gaa aac aac att1611Phe Asp Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile290 295 300 305agc tgg gct aac tgg tct tta acg aat aaa aat gaa gta tct ggt gca1659Ser Trp Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala310 315 320ttt aca cca ttc gag tta ggt aag tct aac gca aca agt ctt gac cca1707
Phe Thr Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Ser Leu Asp Pro325 330 335ggg cca gac caa gta tgg gta cca gaa gag tta agt ctt tct gga gaa 1755Gly Pro Asp Gln Val Trp Val Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu340 345 350tat gta cgt gct cgt att aaa ggt gtg aac tat gag cca atc gac cgt 1803Tyr Val Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg355 360 365aca aaa tac acg aaa gta ctt tgg gac ttt aat gat gga acg aag caa 1851Thr Lys Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln370 375 380 385gga ttt gga gtg aat gga gat tct cca gtt gaa gat gta gtt att gag 1899Gly Phe Gly Val Asn Gly Asp Ser Pro Val Glu Asp Val Val Ile Glu390 395 400aat gaa gcg ggc gct tta aaa ctt tca gga tta gat gca agt aat gat 1947Asn Glu Ala Gly Ala Leu Lys Leu Ser Gly Leu Asp Ala Ser Asn Asp405 410 415gtt tct gaa ggt aat tac tgg gct aat gct cgt ctt tct gcc gac ggt 1995Val Ser Glu Gly Asn Tyr Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asp Gly420 425 430tgg gga aaa agt gtt gat att tta ggt gct gaa aaa ctt act atg gat 2043Trp Gly Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp435 440 445gtg att gtt gat gag ccg acc acg gta tca att gct gca att cca caa 2091Val Ile Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ser Ile Ala Ala Ile Pro Gln450 455 460 465ggg cca tca gcc aat tgg gtt aat cca aat cgt gca att aag gtt gag 2139Gly Pro Ser Ala Asn Trp Val Asn Pro Asn Arg Ala Ile Lys Val Glu470 475 480cca act aat ttc gta ccg tta gga gat aag ttt aaa gcg gaa tta act 2187Pro Thr Asn Phe Val Pro Leu Gly Asp Lys Phe Lys Ala Glu Leu Thr485 490 495ata act tca gct gac tct cca tcg tta gaa gct att gcg atg cat gct 2235
Ile Thr Ser Ala Asp Ser Pro Ser Leu Glu Ala Ile Ala Met His Ala500 505 510gaa aat aac aac atc aac aac atc att ctt ttt gta gga act gaa ggt2283Glu Asn Asn Asn Ile Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Glu Gly515 520 525gct gat gtt atc tat tta gat aac att aaa gta att gga aca gaa gtt2331Ala Asp Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val530 535 540 545gaa att cca gtt gtt cat gat cca aaa gga gaa gct gtt ctt cct tct2379Glu Ile Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser550 555 560gtt ttt gaa gac ggt aca cgt caa ggt tgg gac tgg gct gga gag tct2427Val Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser565 570 575ggt gtg aaa aca gct tta aca att gaa gaa gca aac ggt tct aac gcg2475Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala580 585 590tta tca tgg gaa ttt gga tac cca gaa gta aaa cct agt gat aac tgg2523Leu Ser Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp595 600 605gca aca gct cca cgt tta gat ttc tgg aaa tct gac ttg gtt cgc ggt2571Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly610 615 620 625gaa aat gat tat gta act ttt gat ttc tat cta gat cca gtt cgt gca2619Glu Asn Asp Tyr Val Thr Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala630 635640aca gaa ggc gca atg aat atc aat tta gta ttc cag cca cct act aac2667Thr Glu Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn645 650 655ggg tat tgg gta caa gca cca aaa acg tat acg att aac ttt gat gaa2715Gly Tyr Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu660 665 670tta gag gaa gcg aat caa gta aat ggt tta tat cac tat gaa gtg aaa2763
Leu Glu Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys675 680 685att aac gta aga gat att aca aac att caa gat gac acg tta cta cgt 2811Ile Asn Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg690 695 700 705aac atg atg atc att ttt gca gat gta gaa agt gac ttt gca ggg aga 2859Asn Met Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg710 715 720gtc ttt gta gat aat gtt cgt ttt gag ggg gct gct act act gag ccg 2907Val Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro725 730 735gtt gaa cca gag cca gtt gat cct ggc gaa gag acg ccg cct gtc gat 2955Val Glu Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp740 745 750gag aag gaa gcg aaa aaa gaa caa aaa gaa gca gag aaa gaa gag aaa 3003Glu Lys Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys755 760 765gaa gca gta aaa gaa gaa aag aaa gaa gct aaa gaa gaa aag aaa gca 3051Glu Ala Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala770 775 780 785atc aaa aat gag gct acg aaa aaa taatctaata aactagttat agggttatct3105Ile Lys Asn Glu Ala Thr Lys Lys790aaaggtctga tgcagatctt ttagataacc tttttttgca taactggaca tagaatggtt 3165attaaagaaa gcaaggtgtt tatacgatat taaaaaggta gcgattttaa attgaaacct 3225ttaataatgt cttgtgatag aatgatgaag taatttaaga gggggaaacg aagtgaaaac 3285ggaaatttct agtagaagaa aaacagacca agaaatactg caagctt 3332<210>4<211>822<212>PRT<213>芽孢杆菌KSM-64
<400>4Met Met Leu Arg Lys Lys Thr Lys Gln Leu Ile Ser Ser Ile Leu Ile-25 -20 -15Leu Val Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Thr Ala Leu Ala Ala Glu Gly-10 -5 -1 1Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn Asp Asn Val5 10 15Lys Arg Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Gln Glu Val Asp Gly20 25 30 35Gln Met Thr Leu Val Asp Gln His Gly Glu Lys Ile Gln Leu Arg Gly40 45 50Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Pro Glu Ile Leu Asn Asp Asn55 60 65Ala Tyr Lys Ala Leu Ala Asn Asp Trp Glu Ser Asn Met Ile Arg Leu70 75 80Ala Met Tyr Val Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Ser Asn Pro Glu Leu Ile85 90 95Lys Ser Arg Val Ile Lys Gly Ile Asp Leu Ala Ile Glu Asn Asp Met100 105 110 115Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg Asp120 125 130Pro Val Tyr Ala Gly Ala Glu Asp Phe Phe Arg Asp Ile Ala Ala Leu
135 140 145Tyr Pro Asn Asn Pro His Ile Ile Tyr Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser150 155 160Ser Asn Asn Asn Gly Gly Ala Gly Ile Pro Asn Asn Glu Glu Gly Trp165 170 175Asn Ala Val Lys Glu Tyr Ala Asp Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Asp180 185 190 195Ser Gly Asn Ala Asp Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Ser Pro Asn Trp200 205 210Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ile Asp Asp His His215 220 225Thr Met Tyr Thr Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Ala Ala Ser Thr230 235240Glu Ser Tyr Pro Pro Glu Thr Pro Asn Ser Glu Arg Gly Asn Val Met245 250 255Ser Asn Thr Arg Tyr Ala Leu Glu Asn Gly Val Ala Val Phe Ala Thr260 265 270 275Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Asn Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp280 285 290Glu Ala Asp Val Trp Ile Glu Phe Leu Asn Glu Asn Asn Ile Ser Trp295 300 305Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Val Ser Gly Ala Phe Thr
310 315 320Pro Phe Glu Leu Gly Lys Ser Asn Ala Thr Ser Leu Asp Pro Gly Pro325 330 335Asp Gln Val Trp Val Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val340 345 350 355Arg Ala Arg Ile Lys Gly Val Asn Tyr Glu Pro Ile Asp Arg Thr Lys360 365 370Tyr Thr Lys Val Leu Trp Asp Phe Asn Asp Gly Thr Lys Gln Gly Phe375 380 385Gly Val Asn Gly Asp Ser Pro Val Glu Asp Val Val Ile Glu Asn Glu390 395 400Ala Gly Ala Leu Lys Leu Ser Gly Leu Asp Ala Ser Asn Asp Val Ser405 410 415Glu Gly Asn Tyr Trp Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Asp Gly Trp Gly420 425 430 435Lys Ser Val Asp Ile Leu Gly Ala Glu Lys Leu Thr Met Asp Val Ile440 445 450Val Asp Glu Pro Thr Thr Val Ser Ile Ala Ala Ile Pro Gln Gly Pro455 460 465Ser Ala Asn Trp Val Asn Pro Asn Arg Ala Ile Lys Val Glu Pro Thr470 475 480Asn Phe Val Pro Leu Gly Asp Lys Phe Lys Ala Glu Leu Thr Ile Thr
485 490 495Ser Ala Asp Ser Pro Ser Leu Glu Ala Ile Ala Met His Ala Glu Asn500 505 510 515Asn Asn Ile Asn Asn Ile Ile Leu Phe Val Gly Thr Glu Gly Ala Asp520 525 530Val Ile Tyr Leu Asp Asn Ile Lys Val Ile Gly Thr Glu Val Glu Ile535 540 545Pro Val Val His Asp Pro Lys Gly Glu Ala Val Leu Pro Ser Val Phe550 555 560Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp Asp Trp Ala Gly Glu Ser Gly Val565 570 575Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu Ala Asn Gly Ser Asn Ala Leu Ser580 585 590 595Trp Glu Phe Gly Tyr Pro Glu Val Lys Pro Ser Asp Asn Trp Ala Thr600 605 610Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys Ser Asp Leu Val Arg Gly Glu Asn615 620 625Asp Tyr Val Thr Phe Asp Phe Tyr Leu Asp Pro Val Arg Ala Thr Glu630 635 640Gly Ala Met Asn Ile Asn Leu Val Phe Gln Pro Pro Thr Asn Gly Tyr645 650 655Trp Val Gln Ala Pro Lys Thr Tyr Thr Ile Asn Phe Asp Glu Leu Glu
660 665 670 675Glu Ala Asn Gln Val Asn Gly Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys Ile Asn680 685 690Val Arg Asp Ile Thr Asn Ile Gln Asp Asp Thr Leu Leu Arg Asn Met695 700 705Met Ile Ile Phe Ala Asp Val Glu Ser Asp Phe Ala Gly Arg Val Phe710 715 720Val Asp Asn Val Arg Phe Glu Gly Ala Ala Thr Thr Glu Pro Val Glu725 730 735Pro Glu Pro Val Asp Pro Gly Glu Glu Thr Pro Pro Val Asp Glu Lys740 745 750 755Glu Ala Lys Lys Glu Gln Lys Glu Ala Glu Lys Glu Glu Lys Glu Ala760 765 770Val Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Lys Ala Ile Lys775 780 785Asn Glu Ala Thr Lys Lys790<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌epr的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>5
ctccggcaga aagggcat 18<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因epr的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸<400>6cgttcagccg tacaacaagt ttgcaagaca tg 32<210>7<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因epr的核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>7aacttgttgt acggctgaac gccgtcaaac c31<210>8<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>包含根据枯草杆菌基因epr的3’-侧区的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR反义引物的寡核苷酸<400>8ctgatctcga cttcgttcag acgggtcgta caatggctg 39<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>9gaacgaagtc gagatcag 18<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据质粒pC194的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸<400>10gctgtaatat aaaaaccttc t 21<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因epr的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>11cgacaccata gctttctg 18<210>12<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据质粒pC194的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸<400>12aactaacggg gcaggtta 18
<210>13<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>包含根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pC194的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR反义引物的寡核苷酸<400>13agaatcaatc ccatggtctc acttttccac tttttgtctt g 41<210>14<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>包含根据质粒pC194的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>14gtgagaccat gggattgatt ctaatgaaga aagcagacaa g 41<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因wprA的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>15gggtaattta tctgataggg 20<210>16<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因wprA的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸<400>16cttttgcttc ccacaaccga gctgaatttt ctg 33<210>17<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因wprA的核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>17ctcggttgtg ggaagcaaaa gttgttgttg aaaa 34<210>18<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>包含根据枯草杆菌基因wprA的3’-侧区的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR反义引物的寡核苷酸<400>18ctgatctcga cttcgttcat cctcattgaa gacggcatc 39<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因wprA的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>19ggaacatata tgacacacct 20<210>20
<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因mpr的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>20tgtttggtgt tgagctgtt 19<210>21<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因mpr的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸<400>21ttcgtgtgaa tccattgttt tctgaatctt ggaa 34<210>22<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因mpr的核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>22gaaaacaatg gattcacacg aacggaggat cgt 33<210>23<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>包含根据枯草杆菌基因mpr的3’-侧区的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>23ctgatctcga cttcgttcct cgtaagaaaa aatacctatt tc 42<210>24<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因mpr的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>24ccttgcgaaa gatagggta 19<210>25<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因nprB的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>25tttttagcag tggtgctc 18<210>26<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因nprB的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸<400>26catacgcctt cagtaataga gatgtcttgg tc 32<210>27<211>32<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因nprB的核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>27ctctattact gaaggcgtat gaggctgtcg gc 32<210>28<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>包含根据枯草杆菌基因nprB的3’-侧区的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR反义引物的寡核苷酸<400>28ctgatctcga cttcgttctt ccaaatgcgc ttcattagga 40<210>29<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因nprB的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>29cttttgagcc cgttcctc 18<210>30<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因bpr的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>30tgagattgtg gtgacagtg 19
<210>31<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因bpr的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸<400>31ttaagttttc cgctgatgag tctgtttttc gtt 33<210>32<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因bpr的核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>32gactcatcag cggaaaactt aatatgaaca cagaa 35<210>33<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>包含根据枯草杆菌基因bpr的3’-侧区的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR反义引物的寡核苷酸<400>33ctgatctcga cttcgttcgt aatcatgaca ccgttttgaa c 41<210>34<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因bpr的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>34attgcaaccg gctttatcg 19<210>35<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因nprE的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>35ttttgaagac gttcggcga 19<210>36<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因nprE的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸<400>36attgtctgtt gctgaagcag cctggaatgc tgtt 34<210>37<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因nprE的核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>37caggctgctt cagcaacaga caatttctta ccta 34<210>38<211>38
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>包含根据枯草杆菌基因nprE的3’-侧区的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR反义引物的寡核苷酸<400>38ctgatctcga cttcgttccc tctcttaagt aagcgctg 38<210>39<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因nprE的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>39tctctttgtt gaaaaacgat a 21<210>40<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因vpr的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>40aaaaacatcc ctccgcttc 19<210>41<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因vpr的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸<400>41
tcttcggtca atacaagcag aaagcgaatg at 32<210>42<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因vpr的核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>42tctgcttgta ttgaccgaag aacctttcac tg 32<210>43<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>包含根据枯草杆菌基因vpr的3’-侧区的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR反义引物的寡核苷酸<400>43ctgatctcga cttcgttctg ctcggctcat ctggagaaa 39<210>44<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因vpr的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>44tttttggcag gcagcctt 18<210>45<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>根据枯草杆菌基因aprE的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>45ctgtttatta tgggccacga a 21<210>46<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因aprE的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸<400>46gatcagcttg gggttaatca acgtacaagc ag 32<210>47<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因aprE的核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸.
<400>47tgattaaccc caagctgatc cacaattttt tgc 33<210>48<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>包含根据枯草杆菌基因aprE的3’-侧区的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR反义引物的寡核苷酸<400>48ctgatctcga cttcgttctg attttccaaa cgagctttc 39
<210>49<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因aprE的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>49atgggccatt atgtcatgaa g 21<210>50<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因aprX的核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>50ttgggtactc tatggtac 18<210>51<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>包含根据枯草杆菌基因aprX的3’-侧区的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pBluescript II SK(+)的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR反义引物的寡核苷酸<400>51cactggccgt cgttttaccc atgaccatta tcatcg 36<210>52<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因aprX的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸<400>52catggtcata gctgtttcct tatgagcatg tcgctcg 37<210>53<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>作为PCR反义引物的寡核苷酸，其3’-位根据枯草杆菌基因aprX的3’-侧区的核苷酸序列设计，其5’-位根据质粒pBluescript II SK(+)的核苷酸序列设计的<400>53gggaacggaa ttttctgc 18<210>54<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据质粒pBl uescript II SK(+)的核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>54gtaaaacgac ggccagtg 18<210>55<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据质粒pBluescript II SK(+)的核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸<400>55ggaaacagct atgaccatg 19<210>56
<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因aprX的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>56ttctttatca tcctcatgg 19<210>57<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因aprX的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR反义引物的寡核苷酸<400>57tacaaatggt gaacgcagaa aattccgttc 30<210>58<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因aprX的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>58ttttctgcgt tcaccatttg taccatagag 30<210>59<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>包含根据枯草杆菌基因aprX的3’-侧区的核苷酸序列设计的3’-位和根据质粒pUB110的核苷酸序列设计的5’-位的作为PCR反义引物的寡核苷酸
<400>59ctgatctcga cttcgttcta acaacctcac ttggcaa 37<210>60<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据枯草杆菌基因aprX的5’-侧区核苷酸序列设计的作为PCR正义引物的寡核苷酸<400>60atagatcggc gcctgaaa 18<210>61<211>480<212>PRT<213>芽孢杆菌KSM-K38<400>61Asp Gly Leu Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Tyr Glu Trp His Leu Glu1 5 10 15Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asp Asp Ala Ala Ala Leu20 25 30Ser Asp Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly35 40 45Asn Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu50 55 60Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys65 70 75 80Ala Gln Leu Glu Arg Ala Ile Gly Ser Leu Lys Ser Asn Asp Ile Asn85 90 95
Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Met Gly Ala Asp Phe Thr100 105 110Glu Ala Val Gln Ala Val Gln Val Asn Pro Thr Asn Arg Trp Gln Asp115 120 125Ile Ser Gly Ala Tyr Thr Ile Asp Ala Trp Thr Gly Phe Asp Phe Ser130 135 140Gly Arg Asn Asn Ala Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Phe His Phe145 150 155160Asn Gly Val Asp Trp Asp Gln Arg Tyr Gln Glu Asn His Ile Phe Arg165 170 175Phe Ala Asn Thr Asn Trp Asn Trp Arg Val Asp Glu Glu Asn Gly Asn180 185 190Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Ile Asp Phe Ser His Pro Glu Val195 200 205Gln Asp Glu Leu Lys Asp Trp Gly Ser Trp Phe Thr Asp Glu Leu Asp210 215 220Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Lys His Ile Pro Phe Trp Tyr225 230 235 240Thr Ser Asp Trp Val Arg His Gln Arg Asn Glu Ala Asp Gln Asp Leu245 250 255Phe Val Val Gly Glu Tyr Trp Lys Asp Asp Val Gly Ala Leu Glu Phe260 265 270
Tyr Leu Asp Glu Met Asn Trp Glu Met Ser Leu Phe Asp Val Pro Leu275 280 285Asn Tyr Asn Phe Tyr Arg Ala Ser Gln Gln Gly Gly Ser Tyr Asp Met290 295 300Arg Asn Ile Leu Arg Gly Ser Leu Val Glu Ala His Pro Met His Ala305 310 315 320Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Glu Ser Leu Glu325 330 335Ser Trp Val Ala Asp Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Thr Ile Leu340 345 350Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Pro Asn Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly355 360 365Ile Pro Asn Asp Asn Ile Ser Ala Lys Lys Asp Met Ile Asp Glu Leu370 375 380Leu Asp Ala Arg Gln Asn Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr Phe385 390 395 400Asp His Trp Asp Val Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Ser Ser Ser Arg405 410 415Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asn Gly Pro Gly Gly Ser420 425 430Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Gln Thr Trp Thr Asp435 440 445
Leu Thr Gly Asn Asn Gly Ala Ser Val Thr Ile Asn Gly Asp Gly Trp450 455 460Gly Glu Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Tyr Val Asn Gln465 470 475 480
权利要求
1.一种重组微生物，其特征在于，使用已经使枯草杆菌的aprX基因或与该基因相当的基因缺失或失活的微生物作为宿主，向其中导入有编码异种蛋白质或多肽的基因。
2.如权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，还使用已经使不同于枯草杆菌的aprX基因或与该基因相当的基因的、编码蛋白酶的1种以上的基因缺失或失活的微生物作为宿主。
3.如权利要求2所述的重组微生物，其特征在于，所述不同于枯草杆菌的aprX基因或与该aprX基因相当的基因的编码蛋白酶的基因为选自枯草杆菌的aprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr和wprA的各个基因以及与该基因相当的基因。
4.如权利要求3所述的重组微生物，其特征在于，使用已经使枯草杆菌的aprX、aprE和nprE的各个基因全部或者与该基因相当的3种基因全部缺失或失活的微生物作为宿主。
5.如权利要求3所述的重组微生物，其特征在于，使用已经使枯草杆菌的aprX、aprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、和wprA的各个基因全部或者与该基因相当的9种基因全部缺失或失活的微生物作为宿主。
6.如权利要求1～5中任一项所述的微生物，其特征在于，微生物为枯草杆菌或其它芽孢杆菌属细菌。
7.如权利要求1～6中任一项所述的重组微生物，其特征在于，在编码异种蛋白质或多肽的基因的上游，连接有选自转录起始控制区域、翻译起始控制区域和分泌信号区域中的一个以上的区域。
8.如权利要求7所述的重组微生物，其特征在于，其为由转录起始控制区域、翻译起始控制区域和分泌信号区域构成的三个区域连接的重组微生物。
9.如权利要求7或8所述的重组微生物，其特征在于，分泌信号区域是来自芽孢杆菌属细菌的纤维素酶基因的区域，转录起始控制区域和翻译起始控制区域是来自该纤维素酶基因的上游0.6～1kb区域的区域。
10.如权利要求8所述的重组微生物，其特征在于，由转录起始控制区域、翻译起始控制区域和分泌信号区域构成的三个区域，是由序列号1表示的碱基序列构成的纤维素酶基因的碱基编号为1～659的碱基序列、由序列号3表示的碱基序列构成的纤维素酶基因的碱基编号为1～696的碱基序列、或者与该碱基序列的任一个具有70％以上同一性的碱基序列构成的DNA片段，或者由该碱基序列的一部分缺失的碱基序列构成的DNA片段。
11.一种蛋白质或多肽的制造方法，其特征在于，使用权利要求1～10中任一项所述的重组微生物。
全文摘要
本发明涉及可提高蛋白质和多肽的生产率的宿主微生物，向其中导入编码蛋白质和多肽的基因得到的重组微生物，使用该重组微生物的蛋白质和多肽的制造方法。本发明使用已经使枯草杆菌的aprX基因或与该基因相当的基因缺失或失活的微生物作为宿主，再导入有编码异种蛋白质或多肽的基因的重组微生物，以及使用该重组微生物的蛋白质和多肽的制造方法。
文档编号C12P21/02GK101084302SQ200580043868
公开日2007年12月5日 申请日期2005年12月20日 优先权日2004年12月20日
发明者儿玉武子, 远藤圭二, 尾崎克也, 关口顺一 申请人:花王株式会社, 国立大学法人信州大学