专利名称：一种酵母来源重组蛋白发酵液的双水相固液分离方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及微生物发酵液的固液分离技术，特别 涉及酵母来源重组蛋白发酵液的固液分离技术。
背景技术：
酵母细胞作为重组蛋白质的生产工厂已广泛用于重组蛋白质特别是结构复
杂、使用量大的重组蛋白质的生产，如重组人血清白蛋白(微生物学通报，2003， 30(5): 128-132)及其融合蛋白(专利CN200610049070.1)、转铁蛋白(生物 化学与生物物理进展，2005， 32(7): 625-629)、乳铁蛋白(中国乳品工业，2005， 33(5): 4-7)、工业用酶等。而固液分离技术成为用酵母生产重组蛋白质工业化 的瓶颈之一。酵母来源的重组蛋白质发酵液的固液分离技术，传统的方法主要 包括离心技术、板框过滤技术和膜分离技术。虽然上述分离技术均能在一定程 度上达到分离目标产物的目的，但也都存在着诸多的缺点。例如，离心技术， 包括利用叠片式离心机和连续流离心机等，均存在动力成本高、难以处理大量 的高密度、高粘度的料液等缺点。板框过滤技术存在人力投入大，批次重复性 差，产品收率低，染菌料液处理难，不同料液澄清度的一致性差等缺点(中国 生物工程杂志，2004， 24(4): 81 85)。同时，在过滤操作中因细胞会黏附在滤 布上而降低过滤操作的流速，需进行后续的滤布及滤饼清洗，不易封闭操作(化 学设备与防腐蚀，2001， 3， 1~7)，从而导致产品收率低，并容易引进热原。
双水相萃取技术出现于20世纪60年代，它是基于两种聚合物或一种聚合物 与一种盐，如聚乙二醇/葡聚糖和聚乙二醇/无机盐，在一定浓度下的分子空间阻碍作用，而形成不互溶的两水相。该技术现已广泛应用于蛋白质、核酸和病毒 等生物产品的分离和纯化中。虽然它具有条件温和、容易放大、可连续操作的 优点，但存在水溶性高聚物黏度大，需要反萃取，后续分离歩骤繁琐，而且价格
昂贵的高聚物回收困难，分离成本高昂(食品工业科技，2007， 28， 235 238)。 近年来， 一种含有亲水性有机溶剂和无机盐的双水相体系己应用于金属络合物、 金属离子和中药有效成分的萃取(应用化学，2001， 1S(3):241 243;分析测试 学报，2002， 21(3):75 77;精细化工，2004， 21， 165~167;天然产物研究与开 发，2006， 18， 647~649)。本申请的部分发明人提交过两件中国发明专利申请
(CN101012151A和CN101012152A)，用这种双水相体系萃取发酵液中的1 ， 3-丙二醇和2， 3-丁二醇。但发酵的一标产物为结构稳定的低分子二元醇类化合 物，所用微生物为细菌，发酵液中菌体密度较低，菌体量一般为3.5~7.0%。另 外上述两个专利的目的是去除杂蛋白，而不是分离回收，此时大量蛋白和菌体 存在于萃取相和萃余相中间，无法将它们有效地分离。
酵母来源的重组蛋白质发酵液具有如下特点1)目标产物为生物大分子， 即分子量为数千至数万道尔顿的蛋白质，易变性，易降解；2)基因重组酵母菌 的结构、体积和密度等性质与细菌的区别很大；3)基因重组酵母菌生产目标蛋 白质时通常釆用高密度发酵的方法，菌体量一般达到发酵液体积的25%以上。 这使得按照已公开文献的技术进行该类重组蛋白质发酵液都存在很大的困难， 如离心技术难以处理大量的高含固量的料液，板框过滤技术易引进热原。因此， 对于酵母来源的重组蛋白质发酵液的固液分离，迫切需要一种工艺简单、分离 时间短、成本低、易于工业化放大的解决方案。
本发明的研究人员经过大量试验惊人地发现，通过调节无机盐、亲水性有 机物和发酵液的比例，调节体系的pH,控制操作温度能够形成双水相，达到酵
5母来源重组蛋白固液分离的目的。
发明内容
本发明的目的是解决酵母来源的重组蛋白质发酵液菌体去除困难、固液分 离成本高等问题，提供一种新型的酵母来源重组蛋白质发酵液的固液分离方法。 本发明是依据下述技术方案实现的
向酵母来源的重组蛋白质发酵液中添加可溶性无机盐和亲水性有机溶剂并 充分搅拌，通过调节盐、亲水性有机物和发酵液的比例，调节体系的pH,控制 操作温度形成双水相，上相即为富含重组蛋白质的萃取相，下相为含菌体的萃
余相。对于回收率小于80%的体系可以采用多级萃取的方式。在上述操作中， 加入的可溶性无机盐占体系的质量份数为5 35%，优选8 30%;加入亲水性有 机物占体系的质量份数为5~40%，优选8~35%。可溶性无机盐为磷酸盐、硫酸 盐、碳酸盐、卤化物或其混合物，优选磷酸氢二钾、磷酸钾、碳酸钠、碳酸钾、 氯化钠、硫酸铵，硫酸钠、硫酸钾或其混合物，混合物选自优选盐的两种或多 种，其中每种盐质量比为0.1%~99.9%;亲水性有机物为醇类、酮类或其混合物， 优选乙醇、甲醇、正丙醇、异丙醇、异丁醇、乙二醇或丙酮，混合物选自上述 优选亲水性有机物的两种或多种，每种亲水性有机物体积比为0.1%~99.9%。静 置的吋间为1 12小时，萃取操作一般在低于溶剂易挥发的温度下进行即可， 如0 4(TC，通常在4 37。C范围内操作，pH值范围在3-13之间。萃取相应用自 有专利申请技术(CN1854155A)或其他离子层析、疏水层析等蛋白纯化方法回 收重组蛋白后，采用蒸馏、减压蒸馏和/或精馏的方法进行有机溶剂回收，萃余 相通过加入酸调节pH，加入有机溶剂以及改变温度的方法使加入的盐析出而回 收，加入的酸选自无机酸或有机酸，优选磷酸、盐酸、硫酸和醋酸，pH调节范 围为1 9;加入的有机溶剂为醇类，酮类或腈类，优选乙醇，甲醇和丙酮，加入有机溶剂与萃余相之比为0.1 10: 1;温度调节范围为-4 30。C。重组蛋白质为分泌在酵母细胞外部的重组蛋白质，为重组白蛋白及其融合蛋白，重组转铁蛋白，重组乳铁蛋白和重组胶原蛋白及其融合蛋白。
本发明提出的亲水性有机溶剂和无机盐形成的双水相方法对酵母来源重组蛋白质具有很好的固液分离效果1)目标蛋白收率和菌体去除率高，目标蛋白
收率大于80%，菌体去除率大于99.9%。 2)本发明固液处理时间短，可以在12小时内完成大规模的酵母来源蛋白质的固液分离；3)本发明提供的有机溶剂和无机盐的回收方法简便易行，成本低。4)本方法提供的固液分离方法，实验参数从小规模到生产规模具有较好的一致性，只涉及容器的线性放大并和后续工艺能够很好地衔接。该方法克服了目前酵母来源的重组蛋白质发酵液固液分离工艺存在的诸多弊端，是一种分离效果好，分离时间短，成本低，适于工业生产的酵母来源重组蛋白质的固液分离方法。
具体实施例方式
下述实施例仅用于详细说明本发明的重组蛋白质发酵液的分离方法，不应理解为对本发明的限制。
实施例中发酵液中蛋白质浓度方法测定如下取少量一定体积的发酵液在10000g下离心20分钟，得到上清液和菌体，称取菌体重量，计量菌体的质量体积比浓度。菌体中加入0.5倍发酵液体积的50mM磷酸盐冲液(pH6.0)洗涤，10000g下离心20分钟得到洗涤液和菌体。测定上清液和洗涤液中蛋白含量，将上清液和洗涤液的蛋白量之和除以发酵液体积即为发酵液中蛋白质浓度。菌体去除率测定采用分光光度法，在650nm下分别测定发酵液和萃取相的OD值，菌体去除率为发酵液和萃取相的OD值之差与发酵液OD值的比值。实施例1应用自有专利申请技术(CN1854301A和CN1854306A)构建的基因工程菌及生产方法获得重组人血清白蛋白发酵液，其菌体浓度为37g/100ml发酵液，蛋白质浓度9.5g/L。
在4°C下，取200ml上述重组人血清白蛋白发酵液，加入磷酸氢二钾63.5g，待盐溶解后，再加入68.8ml无水乙醇，充分搅拌，pHll。 4。C静置3小时，萃取相160ml，萃余相120ml，萃取相澄清透明，菌体去除率为99.95°/。，使用Bradford法测得萃取相蛋白质浓度为7.6mg/ml，萃余相蛋白质浓度为0.2mg/ml。蛋白质回收率为98.0%，分配系数达到50.6。 SDS-PAGE电泳分析表明，在处理过程中重组人血清白蛋白集中于萃取相，且未见降解和聚合产物出现，考马斯亮蓝染色，扫描仪扫描显示白蛋白占总蛋白的82%。
应用自有专利申请技术(CN1854155A)将上述萃取相进行纯化操作。收集阳离子柱层析的流穿液进行减压蒸馏回收乙醇，得到乙醇60.0ml，乙醇回收率为87.2%。将萃余相静置48小时，萃余相分为菌体和清液两部分，20。C下在清液中加入18.5ml硫酸，pH5.0，析出大量晶体状沉淀，干燥称重，得到磷酸二氢钾28.9g，磷酸盐的摩尔回收率为58.2%。
实施例2
使用实施例1中的发酵液200ml，在25。C下顺序加入碳酸钠40g和乙醇65ml混合，pH13。搅拌混合后按照实施例1的操作进行双水相分离操作，蛋白回收率86.2%，菌体去除率为99.96%。
实施例3
使用实施例1中的发酵液200ml，在4。C下顺序加入氯化钠15g、磷酸钾42g，乙醇68.5ml，充分搅拌，pH13。搅拌混合后按照实施例1的操作进行双水相分离操作，蛋白回收率85.2%，菌体去除率为99.96%。实施例4
使用实施例1中的发酵液200ml，在4。C下顺序加入甲醇35.0ml、磷酸氢二钾60.2g和乙醇34.5ml， pHll。搅拌混合后按照实施例1的操作进行双水相分离操作，蛋白回收率95.2%，菌体去除率为99.94%。
实施例5
使用实施例1中的发酵液200ml，在4°C下顺序加入磷酸氢二钾60.2g、丙酮25.0ml和乙醇55ml， pHll。搅拌混合后按照实施例1的操作进行双水相分离操作，蛋白回收率96.2%，菌体去除率为99.95%。
实施例6
使用实施例1中的发酵液200ml，在37°C下顺序加入无水硫酸钠64g、乙醇72.5ml,调节为pH3.5。搅拌混合后按照实施例1的操作进行双水相分离操作，蛋白回收率84.2%，菌体去除率为99.96%。
实施例7
应用自有专利申请技术(CN1854301A和CN1854306A)构建的基因工程菌及生产方法获得重组人血清白蛋白发酵液，其菌体浓度为48g/100ml发酵液，蛋白质浓度12.5g/L。
在20。C下，取200ml重组人血清白蛋白发酵液，加入磷酸氢二钾58.0g，待盐溶解后，再加入82.0ml无水乙醇，充分搅拌，pHll。 4。C静置12小时，萃取相150ml，萃余相125ml，萃取相澄清透明，菌体去除率为99.93%，使用Bradford法测定萃取相蛋白质浓度为11.5mg/ml,萃余相蛋白质浓度为0.4mg/ml。蛋白质回收率为97.2%，分配系数达到34.5。 SDS-PAGE电泳分析表明，在处理过程中重组人血清白蛋白集中于萃取相，且未见降解和聚合产物出现，考马斯亮蓝染色，扫描仪扫描显示白蛋白占总蛋白的81.5%。
应用自有专利申请技术(CN1854155A)将上述萃取相进行纯化操作。收集阳离子柱层析的流穿液进行减压蒸馏回收乙醇，得到乙醇73.0ml，乙醇回收率为89.0%。将萃余相静置48小时，萃余相分为菌体和清液两部分，0。C下向清液加入65ml乙醇和ll.Oml盐酸，pH4.0，析出大量晶状沉淀，干燥称重，得到磷酸二氢钾39.5g,磷酸盐的摩尔回收率为87.2%。
实施例8
应用自有专利申请技术(CN1854301A和CN1854306A)构建的基因工程菌及生产方法获得重组人血清白蛋白发酵液，其菌体浓度为25g/100ml发酵液，蛋白质浓度6.5g/L。
在37。C下，取200ml重组人血清白蛋白发酵液，加入磷酸氢二钾79.5g，待盐溶解后，再加入48.6ml无水乙醇，充分搅拌，pHll，静置12小时，萃取相75ml，萃余相155ml，萃取相澄清透明，菌体去除率为99.97%，使用Bradford法测定萃取相蛋白质浓度为6.0 mg/ml，萃余相蛋白质浓度为0.4mg/ml。蛋白质回收率为87.9%,分配系数为7.25。 SDS-PAGE电泳分析表明，在处理过程中重组人血清白蛋白集中于萃取相，且未见降解和聚合产物出现，考马斯亮蓝染色，扫描仪扫描显示白蛋白占总蛋白的83.1%。
萃取相柱吸附重组转铁蛋白，流穿液减压蒸馏回收乙醇，得到乙醇44.0ml，乙醇回收率为90.5%。将萃余相静置48小时，萃余相分为菌体和清液两部分，10°C下向清液加入52.5ml丙酮，用乙酸调节pH5.0,析出大量晶体状沉淀干燥称重，得到磷酸二氢钾43.4g，磷酸盐的摩尔回收率为69.8%。
实施例9
应用自有技术构建的表达人转铁蛋白的酿酒酵母工程菌，经发酵所获得发酵液的菌体浓度为20g/100ml发酵液，蛋白浓度0.10g/L。
在20。C卜_，取200ml重组人转铁蛋白发酵液，加入磷酸氢二钾60.8g，待 盐溶解后，再加入72.5ml无水乙醇，充分搅拌，pHll， 4。C静置6小时，萃取 相165ml，萃余相l]5ml。移去萃取相，向萃余相中加入乙醇65ml， 4°C静置6 小时，合并两次萃取相，萃取相体积240ml，萃取相澄清透明，菌体去除率为 99.94%，使用Bradford法测定萃取相蛋白质浓度为0.062mg/ml，蛋白质回收率 为93.0%。 SDS-PAGE电泳分析表明，在处理过程中重组人转铁蛋白集中于萃 取相，且未见降解和聚合产物出现。
应用自有专利申请技术(CN1854155A)将上述萃取相进行纯化操作。收集 阳离子柱层析的流穿液进行减压蒸馏回收乙醇，得到乙醇64.5ml，乙醇回收率为 89.0%。将萃余相静置48小时，萃余相分为菌体和清液两部分，20。C下向清液加 入82.0ml乙醇和14.0ml盐酸，析出大量晶状沉淀，干燥称重，得到磷酸二氢钾39.7g， 磷酸盐的摩尔回收率为83.5%。
实施例IO
应用自有专利申请技术(CN1854301A和CN1854306A)构建的基因工程菌 及生产方法获得重组人血清白蛋白发酵液，其菌体浓度为35g/100ml发酵液，蛋 白质浓度9.0g/L。
在200mL实验规模的基础上，根据所确定的分离条件进行线性放大，实验参 数基本一致。在4。C下，取100L重组人血清白蛋白发酵液，加入磷酸氢二钾31kg， 待盐溶解后，再加入33.9L无水乙醇，充分搅拌，pHll。 4。C静置5小时，萃取相 80L,萃余相59.5L，萃取相澄清透明，菌体去除率为99.95%，使用Bradford法测 定萃取相蛋白质浓度为8.2mg/ml，萃余相蛋白质浓度为0.5mg/ml。蛋白质回收率 为95.6%，分配系数为22.1。
SDS-PAGE电泳分析表明，在处理过程中，重组人血清白蛋白集中于萃取相，且未见降解和聚合产物出现，考马斯亮蓝染色，扫 描仪扫描显示白蛋白占总蛋白的80%。
取萃取相，减压蒸馏回收乙醇，得到乙醇29.8L，乙醇回收率为87.9%。将萃 余相静置48小时，萃余相分为菌体和清液两部分，4。C下向清液加入47L乙醇和 6.6L盐酸，pH4.0，析出大量晶体状沉淀，干燥称重，得到磷酸二氢钾20.6kg,磷 酸盐的摩尔回收率为85.0%。
实施例ll
应用自有专利申请技术(CN1854155A)将实施例IO中的萃取相进行纯化操 作。纯化过程采用高盐阳离子交换层析、疏水交换层析和弱阴离子交换层析。 所收获产品利用SDS-PAGE电泳法测定为单一条带，TSK 3000色谱柱分析其纯 度为99.71%。
可以看到，利用双水相方法处理重组人血清白蛋白发酵液，可以和后续的层 析纯化进行有效连接，所收获的产品纯度好，经过进一步的处理后产品质量可 以达到药用级别。
权利要求
1. 一种酵母来源重组蛋白发酵液的双水相固液分离方法，其特征在于向酵母来源的重组蛋白质发酵液中添加可溶性无机盐和亲水性有机溶剂并充分搅拌，通过调节盐、亲水性有机物和发酵液的比例，调节体系的pH，控制操作温度形成双水相，上相即为富含重组蛋白质的萃取相，下相为含菌体的萃余相；对萃取相中的重组蛋白和有机溶剂以及萃余相中的无机盐分别进行分离、回收。
2. 根据权利要求1所述的一种酵母来源重组蛋白发酵液的双水相固液分离方 法，其特征在于所述加入的可溶性无机盐占体系的质量份数为5 35%，优选 8 30%;加入亲水性有机物占体系的质量份数为5~40%，优选8~35%。
3. 根据权利要求1或2所述的一种酵母来源重组蛋内发酵液的双水相固液分离 方法，其特征在于所述可溶性无机盐为磷酸盐、硫酸盐、碳酸盐、卣化物或其 混合物，优选磷酸氢二钾、磷酸钾、碳酸钠、碳酸钾、氯化钠、硫酸铵，硫酸 钠、硫酸钾或其混合物；混合物选自优选盐的两种或多种，其屮每种盐质量比 为0.1% 99.9%。
4. 根据权利要求1或2所述的一种酵母来源重组蛋白发酵液的双水相固液分离方法，其特征在于所述亲水性有机物为醇类、酮类或其混合物；优选乙醇、甲醇、正丙醇、异丙醇、异丁醇、乙二醇或丙酮；混合物选自优选亲水性有机物 的两种或多种，每种亲水性有机物体积比为0.1% 99.9%。
5. 根据权利要求1或2所述的一种酵母来源重组蛋白发酵液的双水相固液分离 方法，其特征在于双水相固液分离方法可以采用单级萃取，对于蛋白回收率小 于80%的体系可以采用多级萃取；所述双水相体系的pH值为3 13;静置的吋 间为1~12小时；操作温度为0~40°C。
6. 根据权利要求1所述的一种酵母来源重组蛋白发酵液的双水相固液分离方法，其特征在于萃取相在蛋白回收后采用蒸馏、减压蒸馏和/或精馏的方法进行有机溶剂回收；萃余相通过加入酸调节pH，加入有机溶剂以及改变温度的方法使加入的盐析出而回收。
7. 根据权利要求1或7所述的一种酵母来源重组蛋白发酵液的双水相固液分离 方法，萃余相中盐回收时，加入的酸选自无机酸或有机酸，优选磷酸、盐酸、 硫酸和醋酸，pH调节范围为1 9;加入的有机溶剂为醇类，酮类或腈类，优选乙醇，甲醇和丙酮，加入有机溶剂与萃余相之比为0.1 10: 1;温度调节范围为-4 30。C。
8. 根据权利要求1或2所述的一种酵母来源重组蛋白发酵液的双水相固液分离 方法，其特征在于所述重组蛋白质为分泌在酵母细胞外部的重组蛋白质。
9. 根据权利要求1, 2或8所述的一种酵母来源重组蛋白发酵液的双水相固液分 离方法，其特征在于重组蛋白质为重组白蛋白及其融合蛋白，重组转铁蛋白， 重组乳铁蛋白和重组胶原蛋白及其融合蛋白。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，涉及酵母来源重组蛋白发酵液的固液分离方法。其特征在于向酵母来源的重组蛋白质发酵液中添加可溶性无机盐和亲水性有机溶剂并充分搅拌，通过调节盐、亲水性有机物和发酵液的比例，调节体系的pH，控制操作温度形成双水相，上相即为富含重组蛋白质的萃取相，下相为含菌体的萃余相。对萃取相中的重组蛋白和有机溶剂以及萃余相中的无机盐分别进行分离、回收。本发明解决了目前发酵法生产重组蛋白质工艺中存在的菌体去除困难、成本高等问题，具有分离效果好，分离时间短，成本低，易于工业化放大的特点，是一种具有工业应用前景的酵母来源重组蛋白质发酵液固液分离方法。
文档编号C07K1/00GK101481403SQ20091001028
公开日2009年7月15日 申请日期2009年1月24日 优先权日2009年1月24日
发明者修志龙, 李梅彦, 力 杜, 波 江, 王冀民, 王志明, 田明玉, 董悦生, 茜 贾, 健 高, 黄顺军 申请人:大连理工大学;华北制药集团新药研究开发有限责任公司