专利名称：细粒棘球蚴eg95蛋白的修饰及在酵母中的表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细粒棘球蝴EG95蛋白的修饰方法，以及用这种经过修饰后细粒棘球蝴EG95蛋白制备重组表达质粒、重组酵母工程菌，以及重组酵母工程菌诱导表达方法。
背景技术：
棘球蝴病(Echinococcosis)又称包虫病(Hydatid disease),是由棘球绦虫续绦期的幼虫寄生于哺乳动物(包括人)体内肝、肺等脏器而引起的一种对人畜危害极为严重的人畜共患寄生虫疾病。该病呈世界性分布，我国是包虫病发病最高的国家之一。在我国以细粒棘球蝴引起的囊型包虫病(cystic echinococcosis, CE)和多房棘球绦虫引起的泡 型包虫病(alveolar echinococcosis, AE)分布最为广泛,其中以囊型包虫病(CE)为主。CE对人畜危害极为严重，人可因误食虫卵感染该病，在肝、肺等器官形成占位性病灶。各种动物(包括人)都可因囊泡破裂而产生严重的过敏反应而突然死亡。该病可导致我国畜牧业每年直接经济损失达30多亿元，造成严重的经济损失，严重威胁我国流行区农、牧民身体健康和畜牧业的发展，是“健康中国2020行动计划”规划防治的五大寄生虫病之一。控制包虫病的流行主要是通过切断棘球绦虫生活发育环节，预防中间宿主(人、畜)对棘球蝴的感染，预防或驱虫治疗终宿主(犬)，阻断虫卵的播散。对中间宿主接种疫苗可控制包虫病的流行。因此，通过免疫预防途径控制和消灭包虫病是一项有效的措施和较为理想的途径。研究证实，棘球绦虫六钩蝴分泌抗原具有较好的保护作用，但由于细粒棘球蝴有着复杂的生活史，无法使其在体外培养中大量增殖，抗原来源量有限，因而限制了其在免疫预防中的广泛应用。大量实验研究发现，EG95抗原是六钩蝴组成成分中理想的疫苗抗原候选分子，已成功用于研制抗绵羊细粒棘球蝴病的疫苗。但现有的重组EG95重组蛋白疫苗抗原使用大肠杆菌生产，其表达产物多以不可溶的包涵体形式存在，难以维持蛋白的天然结构，也缺乏蛋白质翻译后加工修饰过程，从而影响了疫苗的免疫保护效果。
发明内容
本发明提供一种对细粒棘球蝴EG95基因进行修饰的处理方法，这种经修饰处理后的细粒棘球蝴EG95基因可制备出重组表达质粒、重组酵母工程菌，以及用这种重组酵母工程菌经诱导表达预期具有表达蛋白具有可溶、纯度高、易于纯化以及生物学活性高的优点。本发明的对细粒棘球蝴主要免疫原性蛋白EG95的修饰方法是在完整EG95蛋白的基础上，从N-端去除23个氨基酸，从C-端截去22个氨基酸，改造后的tEG95基因序列为SEQNa 1，蛋白序列为SEQNs 2。I.前述经修饰的细粒棘球蝴主要免疫原性蛋白EG95(tEG95)制备重组表达质粒的方法是将经改造后的tEG95通过TA克隆到pMD18T-Simple载体上，构建pMD18T_tEG95重组载体，再将重组pMD18T-tEG95载体和pPIC9K进行EcoR I和Not I双酶切，然后再用T4DNA连接酶将tEG95基因片段和pPIC9K载体进行连接，构建成含有a -Factor信号肽的酵母表达载体pPIC9K-tEG95。用前述的重组质粒构建重组酵母工程菌的方法是将所述的酵母表达载体pPIC9K-tEG95经Sal I酶切，然后采用1500V，200 Ω，25 μ F电击5ms，将酶切产物转化毕赤酵母GSl 15，转化液涂布MD平板，然后转接含有lmg/mL的YPD平板上培养，后转至2mg/mLYB)平板获得抗性菌株。将抗性菌转接含2mg/mL YH)液体培养基，96孔细胞培养板上进行有限稀释获取抗性酵母工程菌单克隆，对单克隆进行PCR鉴定，扩增引物序列见附录3，阳性单克隆命名为EG95-1。用前所述的方法构建并筛选出抗性菌株EG95-1，该菌株于2012年02月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNo5764,保藏分类命名巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。用前述的抗性菌株EG95-1诱导表达方法是将重组工程菌株EG95-1接种于15mLBMGY液体培养基中，28°C培养24h左右，当OD6tltl = 5 6时，室温1500r/min离心5min收获细胞，将收获的细胞用20mL BMMY培养基悬浮于250mL的三角瓶中，无菌培养容器透气封口膜扎口，28°C诱导表达，每24h向培养基中补加甲醇至终浓度为O. 5% I %左右，以保证持续的诱导表达。对本发明的EG95-1抗性菌株进行PCR鉴定所用的扩增引物序列为SEQ Na 3和SEQ Na 4。经本发明的修饰方法修饰的细粒棘球蝴EG95蛋白，是对其编码基因进行了优化和截短处理，这种密码子优化和基因截短处理可使其在酵母细胞内高效表达，而且对EG95蛋白保护性抗原决定族的影响不大，由此构建的表达EG95蛋白的重组酵母菌，可对目的蛋白进行高效可溶性分泌表达，且可对目的蛋白进行一定程度的蛋白翻译后加工修饰。
附图I为本本发明的重组酵母表达载体pPIC9K_tEG95的双酶切鉴定电泳图，其中M.为 DL2000Marker ；1 为 pPIC9K_tEG95 EcoR I 和 Not I 双酶切产物。
附图2为本发明的酵母转化子的PCR鉴定的电泳图，其中M为DL2000Marker ;1为重组毕赤酵母EG95-1转化子的PCR鉴定。图3为重组毕赤酵母EG95-1甲醇诱导后培养基上清的SDS-PAGE电泳图谱。其中M.蛋白质分子质量标准；1.EG95-1重组酵母菌未诱导时的菌液浓缩上清液蛋白；2.EG95-1重组酵母菌诱导48h培养基浓缩上清液蛋白；3. EG95-1重组酵母菌诱导72h的培养基浓缩上清液蛋白；4. EG95-1重组酵母菌诱导96h培养基浓缩上清液蛋白。图4为本发明的重组tEG95蛋白的PMF质谱出峰结果。出峰情况决定质谱结果好坏，本图峰值显示质谱测定结果良好。图5为本发明的重组tEG95蛋白的PMF质谱检测数据库检索结果。图中提到蛋白评分大于85分的结果可信，检索蛋白评分最高的均为细粒棘球蝴EG95蛋白序列，表达蛋白为EG95蛋白高度可信。图6为本发明的重组tEG95蛋白的糖基化分析结果。其中M.蛋白质分子质量标准；I.未进行酶切的两蛋白条带；2、3.接受Endo H酶切的蛋白条带，酶切后目的蛋白由原来的两条蛋白带变为一条蛋白带，因为引入Endo H杂蛋白，因而在66. OKu附近出现一条蛋白带。
具体实施例方式I表达载体pPIC9K_tEG95的构建方法I. I按照SEQ No I提供的经密码子优化并截短的tEG95基因序列进行序列合成，并连接到 pMD18T-Simple 载体(TRKARA，Dalian，Liaoning)上构建 pMD18_tEG95 克隆载体，将pMD18-tEG95和表达载体pPIC9K分别用EcoR I和Not I进行双酶切，胶回收目的产物，T4DNA连接酶连接，获得表达载体pPIC9K-tEG95。
I. 2将pPIC9K_tEG95用Sal I酶切进行线性化，准备与毕赤酵母感受态细胞混匀进行电转化。2重组酵母转化子的构建方法2. I挑取毕赤酵母GSl 15单菌落，接种至YPD培养基，所用的YPD培养基参见前述内容，28°C下培养至0D_达到I. 3 I. 5，离心收集菌体，用冰预冷的无菌水和lmol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀各洗涤两次，最后用ImL冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液悬浮，制成感受态细胞。将IOpg的经Sal I线性化的EG95基因与80的感受态细胞混匀，采用1500V，200，25 μ F电击5ms将酶切产物转化毕赤酵母GS115。转化液涂布MD平板，其MD培养基配方为1.34%￥他，4\10-5%生物素和1%葡萄糖，置281恒温培养3611左右。然后转接含有lmg/mL的YPD平板上培养，所用的YI3D培养基配方为I %酵母提取物，2%蛋白胨和2%葡萄糖，然后转至2mg/mL YPD平板获得抗性菌株。将抗性菌转接含2mg/mL YH)液体培养基，96孔细胞培养板上进行有限稀释获取抗性酵母工程菌单克隆。3酵母抗性转化子单克隆的PCR鉴定。3. I挑取上述获得的抗性单克隆菌落置于无菌水中混匀，在56°C水浴中加热2min,再置于_70°C冰箱中，冷冻IOmin,如此重复三次。离心后取上清液为模板进行PCR扩增鉴定，扩增弓I物序列见附录3。3. 2扩增产物在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。在以G418抗性毕赤酵母菌基 因组DNA为模板的反应管中，扩增出大小为333bp的片段，而普通酵母菌及PPIC9K空载体转化菌中则无，表明tEG95基因已整合到GS115的酵母基因组中，参见附图2。如此得到了重组菌株EG95-1，该菌株于2012年02月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No5764。4摇瓶表达将高效表达的重组工程菌株EG95-1(菌株为EG95-1，重组蛋白为tEG95)接种于15mL BMGY液体培养基中，28 °C培养24h左右，当OD6tltl = 5 6时，室温1500r/min离心5min收获细胞。这里所用的BMGY培养基配方为I %酵母提取物，2%蛋白胨，I. 34% YNB，4父10-5%生物素，1%甘油，100臟01/1的磷酸盐缓冲液( !1 6.0)。将收获的细胞用20mLBMMY培养基悬浮于250mL的三角瓶中，无菌培养容器透气封口膜扎口，28°C诱导表达，每24h向培养基中补加甲醇至终浓度为O. 5% 1%左右，以保证持续的诱导表达。在诱导后24h开始取菌，每隔24h取菌一次，检测目的蛋白表达情况。这里所用的BMMY培养基配方为:1%酵母提取物，2%蛋白胨，I. 34% YNB，4X 10-5%生物素，O. 5%甲醇，100mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH 6. O)。5重组蛋白tEG95的检测与鉴定5. I 重组蛋白 tEG95 的 SDS-PAGE 分析重组毕赤酵母EG95-1在BMMY培养基中28°C诱导表达完成后，离心收集上清液，上清液用丙酮沉淀，变性后进行12% SDS-PAGE分析，结果显示在14ku左右处出现蛋白质条带，参见附图3，表明目的蛋白在酵母表达系统内进行了可溶性分泌表达。 5. 2重组蛋白tEG95的质谱分析从考马斯亮蓝染色凝胶上切下重组蛋白带，送北京华大中生科技发展有限公司进行肽指纹图谱分析(PMF)。通过对质谱测定结果进行数据库检索，测定蛋白序列为SEQN2 2，与数据库EG95蛋白序列信息高度一致，表明发酵上清中的重组蛋白为细粒棘球蝴EG95蛋 白，参见附图4和附图5。5. 3重组蛋白EG95-1的糖基化分析根据NEB公司的N-糖苷内切酶(Endo H)的使用说明，将糖蛋白在糖蛋白变性缓冲液中100°c煮沸IOmin使糖蛋白变性，加入I XG5反应缓冲液，于37°C温育I 3h。酶切完成后进行SDS-PAGE电泳分析(见图6)，发现目的蛋白原来的两条带中偏大的条带变小，目的蛋白变为一条带，由此确定目的蛋白的糖链被切除。同时说明目的蛋白在酵母表达系统中表达时进行了糖基化，表达蛋白更加接近EG95天然蛋白的结构，其生物学活性应较未进行糖基化的蛋白要高。以上表明，经本发明的密码子优化和截短处理后构建的表达tEG95蛋白的重组酵母菌EG95-1，可对目的蛋白，即tEG95蛋白，进行高效可溶性分泌表达，完全克服了现有技术的表达产物多以不可溶的包涵体形式存在，难以维持蛋白的天然结构和缺乏蛋白质翻译后加工修饰过程的不足，从理论上来说，这会提高疫苗的免疫保护效果。
权利要求
1.细粒棘球蝴主要免疫原性蛋白EG95的修饰方法，其特征在于在完整EG95蛋白的基础上，N-端去除23个氨基酸，C-端截去22个氨基酸，改造后的tEG95基因序列为SEQ Na 1，蛋白质序列为SEQ No 2。
2.权利要求I所述的经修饰细粒棘球蝴主要免疫原性蛋白tEG95制备重组表达质粒的方法，将权利要求I所述的改造后的tEG95通过TA克隆到pMD18T-Simple载体上，构建pMD18T-tEG95重组载体，再将重组pMD18T_tEG95载体和pPIC9K进行EcoR I和Not I双酶切，然后再用T4DNA连接酶将tEG95基因片段和pPIC9K载体进行连接，构建成含有a -Factor信号肽的酵母表达载体pPIC9K_tEG95。
3.用权利要求2所述的重组质粒构建重组酵母工程菌的方法，其特征是将权利要求2所述的酵母表达载体pPIC9K-tEG95经Sal I酶切，然后采用1500V，200，25 y F电击5ms，将酶切产物转化毕赤酵母GSl 15，转化液涂布MD平板，然后转接含有lmg/mL的YPD平板上培养，后转至含2mg/mL YPD平板获得抗性菌株，将抗性菌转接含2mg/mL YPD液体培养基，96孔细胞培养板上进行有限稀释获取抗性酵母工程菌单克隆。
4.用权利要求3所述的方法构建并筛选出酵母单克隆菌株EG95-1，该菌株于2012年02月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo5764。
5.权利要求4所述的菌株诱导表达方法，其特征在于将重组工程菌株EG95-1接种于15mL BMGY液体培养基中，28°C培养24h左右，当0D600 = 5 6时，室温1500r/min离心5min收获细胞，将收获的细胞用20mL BMMY培养基悬浮于250mL的三角瓶中，无菌培养容器透气封口膜扎口，28°C诱导表达，每24h向培养基中补加甲醇至终浓度为0. 5% I %左右，以保证持续的诱导表达。
6.对抗性酵母工程菌EG95-1进行PCR鉴定所用的扩增引物序列为SEQN22和SEQN2 3。
全文摘要
本发明公开一种细粒棘球蚴EG95蛋白的修饰方法，以及用这种经过修饰后细粒棘球蚴EG95蛋白制备重组表达质粒、重组酵母工程菌，以及重组酵母工程菌诱导表达方法。本发明的对细粒棘球蚴主要免疫原性蛋白EG95的修饰方法是在完整EG95蛋白的基础上，从N-端去除23个氨基酸，从C-端截去22个氨基酸，改造后的tEG95基因序列为SEQ ID No.1，蛋白序列为SEQ ID No.2。用本性发明的方法构建并筛选出酵母单克隆菌株EG95-1于2012年02月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5764。
文档编号C12N1/19GK102731641SQ20121010351
公开日2012年10月17日 申请日期2012年4月10日 优先权日2012年4月10日
发明者倪兴维, 娄忠子, 李宏民, 贾万忠, 闫鸿斌 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所