专利名称：非对称多色荧光发夹探针链反应在病原菌检测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物反应技术，特别是涉及基于非对称多色荧光发夹探针链反应在病原菌检测中应用。
背景技术：
分子诊断学方法依据细菌核酸特征进行检测，为临床病原微生物快速检测带来了新契机。核酸分子固相杂交法、DNA测序法、毛细管电泳分析、基因芯片技术等检测方法的先后建立，将细菌分子检测方法提高到一个崭新的阶段，但是这些分子诊断学方法大多需要特殊的大型仪器，技术难度大，难以在临床中普及应用。因此，针对上述问题，如能开发出一种基于新型探针技术，对多种病原菌基因组进行并行检测的快速、特异、简便的分子诊断学方法，对推进分子诊断学技术的实用化显然具有十分重要的意义。Applied Gene Technologies公司的专利名称为“发夹形核酸探针技术”(NucleicAcid Hairpin Probes),专利号为6380377涉及到一种莖环形DNA探针技术,与标准的单链核酸探针相比结构更稳定，酶反应更高效，对错配更加敏感，产生了更少的非特异性靶位结合。这些优点都提高了基因分析的特异性。与传统的PCR、固相核酸杂交等技术相比，该技术具有更为突出的优点检测效率高，检测速度快，该技术同时进行分子识别和级联信号放大，可在10分钟内完成核酸检测；反应体系简单，无需酶及其他复杂的分子生物学试剂；单管反应，所有检测在单一闭管中进行，操作步骤简单，并且有效地避免了传统技术存在的实验室污染问题；该方法还适合与其他检测方法整合。突光共振能量转移(Fluorescenceresonance Energy Transfer, FRET)技术是指当一个荧光分子(又称为供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体分子)的激发光谱相重叠时，且供、受体空间距离相近时(一般为7 IOnm)，则供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减，这种现象被称为荧光共振能量转移。FRET技术具有灵敏度高、专属性强、重现性好等特点，并能避免散射光的影响，比常规荧光法和共振光散射法具有更强的抗干扰能力。FRET技术已被广泛应用于生物及医学研究等方面。FRET探针即共振能量转移的供-受体对，主要分为以下几类荧光蛋白，有机荧光染料，镧系染料和量子点，其中有机荧光染料种类繁多，应用广泛，可根据需要选择适合的染料，并可以和其它类探针配对使用。
发明内容
本发明设计了一种非对称发夹探针链反应技术，巧妙地结合了分子杂交的高特异性和链式聚合的高效性，通过DNA聚合释放的自由能驱动分子级联放大，并将高灵敏的多色荧光共振能量转移技术引入到链式反应中，从而建立一种简单、快速、灵敏的病原菌DNA检测方法。非对称多色荧光发夹探针链反应在病原菌DNA检测中的应用，包括液相杂交链反应体系，所述反应体系中同时加入有非对称发夹探针I和非对称发夹探针2以及待测靶序列，其中非对称发夹探针1，包括回文序列、两条茎臂和连接于一条茎臂上的粘性末端，所述两条茎臂连接于回文序列的两端且具有互补的核酸序列，所述回文序列为与待测靶序列无关的序列，所述茎臂与其连接的粘性末端具有靶序列的互补核酸序列；其中非对称发夹探针2，包括回文序列、两条茎臂和连接于一条茎臂上的粘性末端，所述两条茎臂连接于回文序列的两端且具有互补的核酸序列，所述回文序列与其相连的一条茎臂具有靶序列，所述另一茎臂上相连的粘性末端具有和非对称发夹探针I中回文序列的互补核酸序列，所述非对称发夹探针I的5’端和3’端分别标记荧光受体分子和荧光供体分子或非对称发夹探针2的5’端和3’端分别标记荧光供体分子和荧光受体分子。
所述荧光供体分子和荧光受体分子分别标注于非对称发夹探针2的两端。所述荧光供体分子为有机荧光染料FAM和HEX，荧光受体分子为BHQl。所述非对称发夹探针I的粘性末端位于5’端，所述非对称发夹探针2的粘性末端位于3’端；或者所述非对称发夹探针I的粘性末端位于3’端，所述非对称发夹探针2的粘性末端5 ’端。优选所述非对称发夹探针I的粘性末端位于5’端，所述非对称发夹探针2的粘性末端位于3’端。 所述粘性末端为6-8个碱基。所述待测靶序列为细菌的16S rDNA序列。所述细菌为铜绿假单胞菌，所述非对称发夹探针I、非对称发夹探针2和待测靶序列分别为PA-HlCGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGTCAAAGTACCCCCACTTTCTCCCTC,PA-H2 ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACGGAGGGAGAAAGTGGGGGT,Tpa :ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACG。所述细菌为肺炎克雷伯菌，所述非对称发夹探针I、非对称发夹探针2和待测靶序列分别为KP-Hl GGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTTCAAAGTCTAACTCACCCGTCCGCCAC,KP-H2 AACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACCGTGGCGGACGGGTGAGTTAGACTTTG,Tkp :AACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACC。非对称发夹其基本原理是两条特异性自组装探针由靶核酸特异序列和一回文序列组成，在无靶序列存在的情况下，处于亚稳定的发夹结构，而一旦加入待测靶序列，即触发无需酶参与的链式聚合反应，此时特异性自组装探针的靶核酸特异序列部分与对应靶核酸位点结合，其余探针则两两复性成两段均为回文序列的部分双链探针，在分子识别杂交的同时大幅度地增强检测信号，从而实现了待测靶序列的快速检测。本研究即联合非对称发夹探针链反应技术和FRET技术，建立了一种基于非对称多色荧光发夹探针链反应技术的病原菌检测技术。在此优选的方法中，将有机荧光染料(FAM和HEX)作为荧光供体，BHQl作为荧光受体分别标记于发夹探针两端，当体系中无靶序列存在时，发夹探针处于亚稳定状态，两基团构成FRET对，无荧光信号产生；而当靶序列加入反应体系触发链式聚合反应时，发夹结构打开，产生荧光信号，并且由于是线性放大，荧光信号强度与靶序列拷贝数成正比(如图I所示)。在发明方法将高灵敏的多色荧光共振能量转移技术引入到链式反应中，从而建立一种简单、快速、灵敏的病原菌DNA直接检测方法，克服了原非对称发夹探针进行链式反应时琼脂糖凝胶电泳观察检测结果灵敏度较低的缺陷。在本发明的实施例中，针对细菌的特异性核酸靶序列，设计多重特异性非对称发夹探针，结合FRET技术，提供了一种高效、灵敏的信号检测方法，可实现快速并行检测细菌的目的。
图I.非对称发夹探针链反应技术原理图
图中H1、H2L、I :发夹探针I、发夹探针2、待测靶序列；A和a、B和b、C和c为互补
核酸序列， 是荧光受体,★是荧荧光供体，图2:PCR扩增产物，M DL2,000DNA maker, K :KpnPCR 产物，P P. aerPCR 产物，-:空白对照图3 :PCR扩展产物酶切，M DL 2，OOODNAmaker，K* Kpn 酶切产物，P* P. aer 酶切产物，K Kpn PCR 产物，P P. aer PCR 产物，图4 PA组不同浓度靶序列荧光HCR，其中，A :无靶序列存在；B :靶序列浓度为IuM5C :靶序列浓度为0. 5uM；D :靶序列浓度为0. IuM5E :靶序列浓度为0.05 u M ；F :靶序列浓度为0. 01 u M，图5 KP组不同浓度靶序列荧光HCR，其中，A :无靶序列存在；B :靶序列浓度为IuM5C :靶序列浓度为0. 5uM；D :靶序列浓度为0. IuM5E :靶序列浓度为0.05 u M ；F :靶序列浓度为0. 01 u M，图6 PA组不同浓度不对称PCR产物的荧光HCR，其中A :1 ii I 单链 DNA ；B 2u I 单链 DNA ；C 3u I 单链 DNA ；D 4u I 单链 DNA ；E 5 u I单链DN A ;F :6 ill单链DN A ；G :无单链DNA存在；H :无探针存在图7 KP组不同浓度不对称PCR产物的荧光HCR，其中A :1 ii I 单链 DNA ；B 2u I 单链 DNA ；C 3u I 单链 DNA ；D 4u I 单链 DNA ；E 5 u I单链DN A ;F :6 ill单链DN A ；G :无单链DNA存在；H :无探针存在。
具体实施例方式本发明的原理如图I所示。(A)待测靶序列I从探针Hl的粘性末端开始发生严格碱基配对的链置换反应从而打开探针的发夹结构，产生新的粘性末端；(B)Hl的粘性末端与H2L的粘性末端发生反应继续打开探针的发夹结构，猝灭基团和报告基团间距离增大，产生荧光信号，继而探针Hl和H2L之间发生交替杂交反应，形成链式聚合体大幅度放大信号。本发明的具体实施例主要针对于两种病原菌，本领域技术人员可以按照本发明的原理，将其应用于任何微生体的检测，只要找到合适的特异性的待测靶序列。I、特异性非对称HCR发夹探针的设计米用Array Designer 4. 0和Primer Premier 5. 0软件设计非对称发夹式探针，用Omiga 2. 0软件进行探针间、探针与靶序列的互补性分析，设计探针的时候，序列中间需要标记猝灭基团的位置上对应的碱基需设计为T，以便使猝灭基团能够连接到探针上。设计的备选探针序列提交Genbank数据库进行特异性分析，并将设计好的探针提交http://mfold. rna. albany. edu/网站进行二级结构的预测,进一步验证了设计探针的特异性和有效性。表I :探针和靶序列设计 绿脓杆菌HCR探针
PA-Hl__CGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGTCAAAGTACCCCCACTTTCTCCCTC_
PA-H2L~^CCCCCACTTTCTCCCTCAGGACGGAGGGAGAAAGTGGGGGTACTTTg
Tpa~^CCCCCACTTTCTCCCTCAGGACG
肺炎克雷伯菌HCR探f
KP-HI~~GGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTTCAAAGTCTAACTCACCCGTCCGCCAC
KP-H2L~^ACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACCGTGGCGGACGGGTGAGTTAGACTTTG
TkpAACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACC2、将提取的基因组DNA进行PCR实验，制备单链PCR产物。引物16S_a 5’端标记PO4基团，以利于下游进行酶切反应。反应体系如下表2 :PCR扩增反应体系
reagentper sample vol([jl)
TaKaRa Ex Taq(5U/^il)0.25 IOXPCR buffer(Mg2+ Free) 5
MgC12(25mM)4
dNTP mixture(各 2.5mM)4模板DNA I
16s-s(4uM)4
16s-a(4uM)2
Sterile dd H2029.75
total volume50反应条件如下预变性94°C，5min ;变性 94。。，60s ;退火 53°C，45s ;延伸 72°C，45s ；30 个循环；延长 72°C，10min，4°C保存。PCR反应产物进行I. 0%琼脂糖凝胶电泳，每孔5. 0 ill上样。实验结果如图2所示，用所设计的通用引物进行PCR扩增，电泳可见明显目的条带，扩增产物可用于酶切实验。3, A-核酸外切酶消化PCR产物将PCR产物用入-核酸外切酶消化，制备单链DNA (ssDNA)。
反应体系为取45iil PCR反应产物，加入5 ii I IOXReacton Buffer,再加入IOU入-核酸外切酶。
反应条件将反应体系置于37°C水浴5min。于80°C水浴中终止反应。其结果如图3所示，PCR产物经入-核酸外切酶消化后，双链DNA大量减少，酶切效率较高，所得单链DNA可用于进行下游实验。4、不同浓度靶序列荧光HCR实验3. 0 ill荧光HCR反应体系包括40uM的探针H10. I u I ；40uM的探针H2L 0. I ;
3X HBVbuffer I u I ;无菌水0. 8 u I ;不同浓度的靶序列I l.Ou I0反应条件如下99°C,8min ;50°C，lh ;4°C保存。将HCR反应产物转移至毛细管内，3，OOOrpm离心2min.。将毛细
管至于导致荧光显微镜下观察荧光并照相。实验结果如图4、图5所示，所设计的HCR特异性探针均可成功启动杂交链反应，发生无需酶作用的链式反应，使得发夹探针结构打开，荧光供体分子在一定波长的光的激发光下发出荧光。当初始靶序列浓度大于或等于0. IyM时，可观察到明显荧光，即12iU反应体系中靶序列达0. 4pmol时可以检测到荧光，说明所设计的探针具有较好的特异性和敏感性。5、单链PCR产物的荧光HCR实验用以上不对称PCR方法制备的单链DNA为模板，进行荧光HCR实验。反应体系如下表3 :单链PCR产物的荧光HCR反应体系
权利要求
1.非对称多色荧光发夹探针链反应在病原菌DNA检测中的应用，包括液相杂交链反应体系，所述反应体系中同时加入有非对称发夹探针I和非对称发夹探针2以及待测靶序列，其中非对称发夹探针1，包括回文序列、两条茎臂和连接于一条茎臂上的粘性末端，所述两条茎臂连接于回文序列的两端且具有互补的核酸序列，所述回文序列为与待测靶序列无关的序列，所述茎臂与其连接的粘性末端具有靶序列的互补核酸序列；其中非对称发夹探针2，包括回文序列、两条茎臂和连接于一条茎臂上的粘性末端，所述两条茎臂连接于回文序列的两端且具有互补的核酸序列，所述回文序列与其相连的一条茎臂具有靶序列，所述另一茎臂上相连的粘性末端具有和非对称发夹探针I中回文序列的互补核酸序列，所述非对称发夹探针I的5’端和3’端分别标记荧光受体分子和荧光供体分子或非对称发夹探针2的5’端和3’端分别标记荧光供体分子和荧光受体分子。
2.根据权利要求I所述的应用，所述荧光供体分子和荧光受体分子分别标注于非对称发夹探针2的两端。
3.根据权利要求2所述的应用，所述荧光供体分子为有机荧光染料FAM和HEX，荧光受体分子为BHQl。
4.根据权利要求I所述的应用，所述非对称发夹探针I的粘性末端位于5’端，所述非对称发夹探针2的粘性末端位于3’端。
5.根据权利要求I所述的应用，所述粘性末端为6-8个碱基。
6.根据权利要求I所述的应用，所述待测靶序列为细菌的16SrDNA序列。
7.根据权利要求I所述的应用，所述细菌为铜绿假单胞菌，所述非对称发夹探针I、非对称发夹探针2和待测靶序列分别为PA-HlCGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGTCAAAGTACCCCCACTTTCTCCCTC,PA-H2 : ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACGGAGGGAGAAAGTGGGGGT，Tpa :ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACG。
8.根据权利要求I所述的应用，所述细菌为肺炎克雷伯菌，所述非对称发夹探针I、非对称发夹探针2和待测靶序列分别为KP-Hl GGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTTCAAAGTCTAACTCACCCGTCCGCCAC,KP-H2 AACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACCGTGGCGGACGGGTGAGTTAGACTTTG,Tkp :AACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACC。
全文摘要
本发明涉及“非对称多色荧光发夹探针链反应在病原菌DNA检测中的应用”，属于生物技术检测领域。本发明联合非对称发夹探针链反应技术和FRET技术，建立了一种基于非对称多色荧光发夹探针链反应技术的病原菌检测技术。当体系中无靶序列存在时，发夹探针处于亚稳定状态，两基团构成FRET对，无荧光信号产生；而当靶序列加入反应体系触发链式聚合反应时，发夹结构打开，产生荧光信号，并且由于是线性放大，荧光信号强度与靶序列拷贝数成正比。在发明方法将高灵敏的多色荧光共振能量转移技术引入到链式反应中，从而建立一种简单、快速、灵敏的病原菌DNA直接检测方法，克服了原非对称发夹探针进行链式反应时琼脂糖凝胶电泳观察检测结果灵敏度较低的缺陷。
文档编号C12Q1/04GK102643910SQ20121010324
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月10日 优先权日2012年4月10日
发明者夏涵, 府伟灵, 梁盼盼, 黄庆 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院