专利名称：一种重组凡纳滨对虾Fortilin蛋白及酵母转化体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞膜穿透性重组凡纳滨对虫下Fortilin蛋白和表达该蛋白毕赤酵母表达菌株，及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。
背景技术：
对虾是世界上养殖产值最大的水产种类之一，在我国水产养殖中也占有举足轻重的地位。随着对虾养殖业的迅速发展，由于集约化养殖水域生物负载过大等多方面问题，导致了对虾病害流行，其中，对虾病毒感染引发的病害造成了巨大的经济损失，同时也威胁着整个海洋生态的平衡。对虾白斑综合症病毒(WSSV)是对全球对虾养殖业危害最大的病原之一，自1992年爆发以来，给全球对虾养殖业造成了巨大损失。因此，深入开展对虾免疫机制研究并在此基础上寻找对虾疾病防治的有效方法已成为当务之急。
Fortilin 蛋白，即翻译控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumorprotein, TCTP),是ー种广泛表达,高度保守的真核蛋白家族。研究发现，Fortilin蛋白是一种多功能蛋白，具有重要生物学功能，包括调节细胞周期进程和恶性转移、钙结合功能、细胞外组胺释放活性、抗凋亡及抗疟疾作用等。Bangrak 等 2004 年克隆了斑节对奸 Fortilin-Pm-Fortilin,Pm-Fortilin 具有保守的Ca结合结构域，并具有抗凋亡活性。RT-PCR分析发现WSSV感染濒死斑节对虾血液中Fortilin mRNA表达量远低于正常水平，该基因在WSSV爆发时高表达，表明Fortilin可能在保护斑节对虾免受WSSV侵染中起到一定作用。后续研究表明，Pm-Fortilin具有保护对奸抵抗WSSV的作用；对奸注射重组Fortilin (rFortilin)后，进行WSSV感染，存活率达80_100%，且PCR检测WSSV处于低水平，而濒死的对虾WSSV水平很高。此结果表明，注射重组rFortilin能以未知的机制降低病毒感染，推測可能是抑制病毒复制。近期有学者利用昆虫ば9细胞研究Fortilin和病毒基因之间的相互作用，结果显示，Pm-Fortilin抑制WSSV早期基因WSSV DNA polymerase和晚期基因VP15，VP28的表达，结合前期研究结果，表明Fortilin通过Ca2+信号和转录控制干扰WSSV増殖。但是，ロ服重组Fortilin组对虾攻毒后存活率仅为10%。药物注射费时费力，显然不适用于大規模对虾养殖，那么如何提高ロ服效用，以方便的饲用方式应用于实际生产是亟待解决的问题。Fortilin蛋白具有重要的抗病毒作用，但其ロ服利用效率差难以应用于对虾养殖生产，这也是活性蛋白和多肽应用普遍面临的问题。因此，本发明从养殖应用出发，着眼于提高蛋白转运效率，以细胞穿膜肽引导Fortilin跨膜转运，同时以酵母作为运载体系，为蛋白应用寻找ー种新的方便有效的方式。
发明内容
本发明的目的是提供ー种重组凡纳滨对虾Fortilin蛋白及酵母转化体，即对凡纳滨对奸的Fortilin蛋白进行改造,并在毕赤酵母中实现稳定、分泌表达，可提高对奸机体免疫力，方便的应用于对虾养殖生产中白斑病毒的防治，从而弥补现有技术的不足。本发明ー个方面涉及ー种重组凡纳滨对虾Forti I in蛋白，其氨基酸序列为SEQ IDNO:I 或 SEQ ID NO:3。其对应的核苷酸序列分别为SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4。本发明另ー个方面涉及用于表达重组凡纳滨对虾Fortilin蛋白的酵母转化体，一种转化体，为巴斯德毕赤酵母X-33/pGAPZ a A-FT (Pichia Pastoris Χ-33/pGAPZ a A-FT),已于2012年4月5日保藏于位于湖北省武汉市武昌区武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO M 2012097。
上述的酵母转化体在制备凡纳滨对虾免疫增强剂中的应用。一种凡纳滨对虾免疫增强剂，是将巴斯德毕赤酵母X-33/pGAPZ a A-FT的发酵上清液冻干制备的。本发明以PCR的方法构建Fortilin和TAT的融合基因，并借助重组表达质粒pGAPZ a A-TF和pGAPZ a A-FT将融合基因整合到毕赤酵母Χ_33的染色体上，有效地避免了外源基因的丢失。同时，该载体上具有抗性筛选标记基因，组成型启动子以及α-因子信号肽序列，可以方便的进行阳性转化子的筛选、进行组成型表达及引导重组蛋白的分泌表达。另外，毕赤酵母自身分泌蛋白少，具有真核生物翻译后修饰功能，这些特点利于重组蛋白的表达和使其具有生物活性。并且，毕赤酵母便于进行高密度发酵培养，适于大規模生产。该系统表达的重组蛋白可以酵母表达上清冻干粉形式作为添加剂用于对虾养殖中，有效提高对虾免疫，增强对虾对白斑病病毒的抵抗力。
图I :本发明的细胞膜穿透性重组凡纳滨对奸TAT-Fortilin和Fortilin-TAT表达载体构建过程示意图；图2 :凡纳滨对虾Fortilin基因凝胶电泳图，其中I :DNA分子量标准(DL2000)，2 Fortilin基因PCR产物；图3 :细胞膜穿透性重组凡纳滨对虾TAT-Fortilin和Fortilin-ΤΑΤ基因PCR扩增产物凝胶电泳图，其中泳道M :DNA分子量标准(DL2000);泳道1，2 =TAT-Fortilin ;泳道3,4 =Fortilin-TAT ；图4 :细胞膜穿透性重组凡纳滨对奸TAT-Fortilin和Fortilin-ΤΑΤ表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳，M是蛋白分子量，泳道I是重组酵母X-33/pGAPZ a A-TF表达产物，箭头所示为TAT-Fortilin融合蛋白，泳道2是重组酵母X-33/pGAPZ a A-FT表达产物，箭头所示为Fortilin-ΤΑΤ融合蛋白，NC是阴性对照X-33/pGAPZ a A ；图5 白斑病病毒WSSV攻毒后凡纳滨对虾累积死亡率统计图。
具体实施例方式以下结合实施例来进ー步解释本发明，但还可以按本领域的其它类似方法来完成本发明实施例中记载的内容。实施例I凡纳滨对虾TAT-Fortilin或者Fortilin-ΤΑΤ融合基因的克隆 提取凡纳滨对虾肝胰腺总RNA后，以01 igo dT引物反转录成cDNA。以cDNA为模板，根据GenBank中凡纳滨对奸Fonilin基因序列(GenBank ID DQ231062)设计引物，并引入TAT基因序列，同时依据pGAPZ a A载体上的酶切位点以及Fortilin基因序列的酶切特性，分别在正向引物中引入限制性内切酶EcoR I识别位点(GAATTC)，在反向引物引入限制性内切酶肋Xba I识别位点(TCTAGA)。TAT-Fortilin基因扩增引物如下上游引物TF-F CCG-GAATTC ATG TATGGCAGGAAGAAGCGGAGACACCGACGAAGA AAGGTCTTCAAGGACATGCTCAC,下游引物TF-R :GC TCTAGA TTATAGCTTCTCCTCTGTTAGACCGTATTTTGG ；Fortilin-ΤΑΤ基因扩增引物上游引物FT-F CCG -GAATTC ATGAAGGTCTTCAAGGACATGCTCACAGGT，下游引物FT-R :Ge ic γα(；α TCA rcTrccTCCcrarcTCCCcrrcnccrccc^
TAGCTTCTCCTCTGTTAGACCGT ；斜体部分序列为TAT序列，引物粗体加下划线部分序列分别为EcoR I、Xba I酶切识别位点，且在酶切位点前弓I入保护碱基。PCR反应条件为94°C预变性3min，94°C变性30s、57. 5°C退火 30s、72°C延伸 lmin，32 个循环，72°C延伸 lOmin。细胞膜穿透性重组凡纳滨对虾TAT-Fortilin和Fortilin-ΤΑΤ基因PCR扩增产物凝胶电泳鉴定见图3，540bp位置有一明亮的扩增谱帯，与目的基因的分子量相符，DNA序列測定结果显示序列与目的基因完全相符，表明已成功获得这两个基因。其氨基酸序列分别为SEQ ID NO :1或3，对应的核苷酸序列为SEQ ID NO 2或4。实施例2重组表达载体pGAPZ a A-TF和pGAPZ a A-FT的构建对空质粒载体pGAPZ a A和上述ΤΑΤ-Fortilin和Fortilin-ΤΑΤ基因PCR产物分别进行EcoR I和Xba I双酶切，切胶纯化后T4DNA连接酶于16° C连接过夜，转化感受态大肠杆菌DH5a，在含25yg/mL Zeocin的低盐LB培养基上培养，以引物对pGAP_F和3' AOXl进行PCR扩增鉴定阳性克隆，并选取阳性克隆委托上海博尚生物技术有限公司测序，确定TAT-Fortilin和Fortilin-ΤΑΤ基因分别成功克隆进pGAPZ a A载体，分别命名为pGAPZ a A-TF 和 pGAPZ a A-FT0引物序列为pGAP-FGTCCCTATTTCAATCAATTGAA,3' AOXl GCAAATGGCATTCTGACATCC 实施例3表达TAT-Forti I in和Fortilin-ΤΑΤ蛋白的毕赤酵母重组株的构建和鉴
定纯化重组质粒pGAPZ a A-TF, pGAPZ a A-TF及空质粒pGAPZ a A, Bin I酶切使之线性化。參照Irwitrogen公司毕赤酵母操作手册制备酵母X-33感受态细胞。线性化质粒电击转化酵母，涂布Zeocin (100 μ g/mL)抗性YPDS平板，筛选阳性转化子。提取酵母基因组DNA,以引物对pGAP-F/3' AOXl进行PCR鉴定。阳性重组酵母命名为X-33/pGAPZ a A-TF,X-33pGAPZ a A-FT,转空白质粒pGAPZ a A的酵母作为对照。本发明获得了ー个染色体上带有Fortilin-ΤΑΤ的巴斯德毕赤酵母X_33/pGAPZ a A-FT (Pichia Pastoris X-33/pGAPZ a A-FT)，多次传代培养表明携带有Fortilin-TAT的重组载体已整合在酵母的染色体上，并能够高效的表达重组蛋白，从而克服了转化酵母易丢失转入基因质粒的问题。将该酵母于2012年4月5日保藏于位于湖北省武汉市武昌区武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO M 2012097。实施例4利用毕赤酵母基因工程菌株X-33/pGAPZ a A-TF与X_33pGAPZ a A-FT表达重组融合蛋白TAT-Fortilin和Fortilin-TAT挑取重组酵母单克隆至IOml YPD培养基中，30° C振荡过夜培养。取0. Iml过夜培养物接种至50ml YPD培养基中，30° C振荡培养72h。培养物13500r/min离心2min，收集上清进行SDS-PAGE电泳检測。电泳结果见图4，对比空载质粒的酵母发酵上清，重组酵母发酵上清中明显存在目的蛋白电泳条带，表明成功分泌表达细胞膜穿透性重组凡纳滨对虾TAT-Fortilin 和 Fortilin-TAT 融合蛋白。实施例5饲料添加重组蛋白对提高凡纳滨对虾免疫カ及抗WSSV能力作用(I)实验饲料的制作分别挑取X-33/pGAPZ a A-TF和X-33/pGAPZ a A-FT阳性酵母转化子，小量活化后接种至YPD培养基扩大培养，5000rpm离心5min后，收集酵母表达上清，10^5mbar, -60°C进行真空冷冻干燥。以鱼粉、豆柏和花生柏为主要蛋白源，鱼油和大豆卵磷脂为主要脂肪源配制凡纳滨对虾基础饲料。以酵母表达上清冻干粉形式在基础饲料中添加100mg/kg重组蛋白TAT-Fortilin、Fortilin-TAT,同时设立空质粒对照组。饲料原料经粉碎过筛，混合，カロ鱼油，加水，挤压制粒一系列t呆作，并在室温干媒后，到切成3_长的颗粒。( 2 )实验动物分组及饲养条件实验用凡纳滨对虾为同一批孵化的虾苗，购于青岛宝荣水产科技发展有限公司。正式实验前，虾苗放于室内海水系统中暂养，并以实验基础饲料饱食投喂，使之逐渐适应实验饲料及实验设施。暂养IOd后，挑选个体大小均匀的健康对虾随机分配到室内海水系统中的27只容积为50L的玻璃缸中进行养殖实验。设4个处理，每个处理设3个重复，每个重复15尾虾，体长5-6cm，体重4. 87±0. 26g。整个饲养实验持续20d，投饵量开始时按对虾体重的5%_10%进行投喂，然后根据每天对虾的摄食情况进行适当调整。每天投喂3次，投喂时间为6:00，11:00，18:00，投喂2h后吸去残饵和粪便，每日换水I次，日换水量为2/3 ;饲养期间连续充气，水温24-28°C，盐度30-32，pH 7. 8-8. 2，溶解氧不低于6. 5mg/L。表I实验分组及饲料组成
权利要求
1.ー种重组凡纳滨对虾Fortilin蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO: I或SEQ ID N0:3。
2.如权利要求I所述的重组凡纳滨对虾Fortilin蛋白，其特征在于所述的序列为SEQID NO: I的蛋白，其对应的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
3.如权利要求I所述的重组凡纳滨对虾Fortilin蛋白，其特征在于所述的序列为SEQID NO:3的蛋白，其对应的核苷酸序列为SEQ ID N0:4。
4.用于表达权利要求I所述重组凡纳滨对奸Fortilin蛋白的酵母转化体。
5.如权利要求4所述的转化体，为巴斯德毕赤酵母X-33/pGAPZa A-FT,保藏编号为CCTCC NO Μ 2012097。
6.权利要求4所述的酵母转化体在制备凡纳滨对虾免疫增强剂中的应用。
7.—种凡纳滨对虾免疫增强剂，是将权利要求5所述的巴斯德毕赤酵母Χ-33/pGAPZ a A-FT的发酵上清液冻干制备的。
全文摘要
本发明涉及一种重组凡纳滨对虾Fortilin蛋白及酵母转化体，是以PCR的方法构建Fortilin和TAT的融合基因，并借助重组表达质粒将融合基因整合到毕赤酵母X-33的染色体上，有效地避免了外源基因的丢失。同时，该载体上具有抗性筛选标记基因，组成型启动子以及α-因子信号肽序列，可以方便的进行阳性转化子的筛选、进行组成型表达及引导重组蛋白的分泌表达。另外，毕赤酵母自身分泌蛋白少，具有真核生物翻译后修饰功能，这些特点利于重组蛋白的表达和使其具有生物活性。并且，毕赤酵母便于进行高密度发酵培养，适于大规模生产。该系统表达的重组蛋白可以酵母表达上清冻干粉形式作为添加剂用于对虾养殖中，有效提高对虾免疫，增强对虾对白斑病病毒的抵抗力。
文档编号C12R1/84GK102643338SQ20121014647
公开日2012年8月22日 申请日期2012年5月12日 优先权日2012年5月12日
发明者周怡, 张文兵, 徐玮, 麦康森 申请人:中国海洋大学