专利名称：一种i型普鲁兰酶的编码基因及其重组表达和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及一种气单胞菌属产普鲁兰酶菌株普鲁兰酶编码基因的克隆。本发明还提供该普鲁兰酶编码基因重组质粒的构建和重组普鲁兰酶制备方法。
背景技术：
I型普鲁兰酶(EC 3.2. 1.41)以内切方式专一水解普鲁兰糖的a-l，6葡萄糖糖苷键，其水解产物主要是麦芽三糖(Doman-Pytka M et al. , Critical Reviews inMicrobiology, 2004, Vol 30，Issue 2，107-121)。除了降解普鲁兰多糖以外，普鲁兰酶还能水解淀粉和支链淀粉，因此I型普鲁兰酶具有很重要应用价值。比如1型普鲁兰酶能够与a -淀粉酶、P -淀粉酶等协同作用生产高葡萄糖浆、超高麦芽糖浆、提高啤酒中的发酵度； 在食品、医药化妆品、分析化学等领域，普鲁兰酶能够逆向合成麦芽糖基-a -环糊精，相比目前广泛应用的环糊精，无任何毒性与溶血性；利用普鲁兰酶水解支链淀粉中的a-l，6糖苷键，可将支链淀粉转变成直链淀粉，后者具有很好的抗水性和成膜性，有望生产可食性包装膜，解决“白色污染”问题；除此之外，采用普鲁兰酶将各类淀粉脱支后再糊化老化处理可增加抗消化淀粉的含量，后者对人体血糖水平、肥胖、癌症、脂质代谢和能量等方面有重要生理功能。目前，国内外分离产普鲁兰酶菌的产酶酶活较低，产酶水平一般为2 5U/mL,且这些产酶菌主要来源于芽孢杆菌属和克雷伯菌属(巩培et W.，天津科技大学学报，2009，Vol 24，Issue 3，10-12 ;Shobha M.S. et aL , Journal of Agricultural and FoodChemistry，2008，Vol 56, Issue 22，10858-10864)。这些产酶菌株大多为病原菌，其发酵液不能直接用于工业添加，特别是食品工业，因此普鲁兰酶基因的重组表达至关重要。然而，普鲁兰酶编码基因序列通常较长(3 6 kb)，这就使其重组表达变得困难重重，国内关于普鲁兰基因重组表达的报道较少。另外，淀粉加工时通常采取50 55 °C的反应温度，这就对普鲁兰酶在该温度下的物理化学的稳定性提出了较高的要求。筛选新型高酶活、具有一定热稳定性的普鲁兰降解酶，具有重要的应用意义。申请人:的课题组先前从稻田土壤中筛选到一株产普鲁兰酶的气单胞菌属菌株Aeromonas sp. As，其菌种保藏号为CGMCC NO. 5490，保藏日期为2011年11月28号，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为3G2。
发明内容
本发明的第一个目的是提供酶活高、热稳定性好的普鲁兰降解酶编码基因。本发明的第二个目的是提供具有活性的上述普鲁兰酶基因片段的重组质粒。本发明的第三个目的是提供上述重组普鲁兰酶的酶学特性和功能及应用。本发明提供的普鲁兰降解酶编码基因，是利用Jerofflmas sp. As菌株(CGMCCNO. 5490)所产，记为 pluAs。
本发明利用PCR技术获得如roffioaas 5/7. As菌株(CGMCC NO. 5490)普鲁兰酶基因/77yAs的全长序列，该基因全长4053 bp，编码1351个氨基酸，预测蛋白大小140 KDa0其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，其核苷酸编码序列如SEQ ID NO I所示，氨基酸序列与Aeromonas普鲁兰酶(通过对该菌株全基因组测序的方法获得,蛋白序列号ABK37551. I)相似度为89%，表明该基因为新的普鲁兰酶基因。本发明还提供上述普鲁兰酶全长基因的克隆方法，即以气单胞菌属菌株Aeromonas sp. As基因组DNA为模板,通过保守序列设计引物,进行PCR扩增(图I)。本发明还提供3种含有普鲁兰酶基因片段(见图2)的核苷酸编码序列的重组质粒。该质粒是 pET2Ia-PluAs-I、pET21a_PluAs_2、pET21a_PluAs_3。将含有本发明的普鲁兰酶基因片段编码序列通过常规方法克隆至载体的多克隆位点，即可形成上述重组质粒。蛋白质结构域分析(http://www. expasy. ch/)表明 Jerofflmas sp. As 的 PluAs蛋白具有4个保守结构域，分别为图2中所示PUD (CBM41)、CBM48、GH13和DUF (Domainof unknown function)。其中PUD结构域为预测的普鲁兰酶底物结合结构域；CBM48存在 于多种分解支链的酶中，比如普鲁兰酶、异淀粉酶等；GH13结构域是在普鲁兰酶中存在的a -淀粉酶催化结构域，能够水解普鲁兰多糖、支链淀粉中的a _1，6糖苷键；DUF结构域的功能未知，在细菌和真菌中都发现了这一保守结构域，大小约170个氨基酸残基，SP为蛋白信号肽区域。PulIulan-Starch结构域为革兰氏阴性菌普鲁兰酶基因共有的保守结构域。
将PluAs与气单胞菌属来源及其他种属来源的普鲁兰降解酶蛋白构建系统发育树，分析了 PluAs的进化地位,结果表明PluAs ^jjiGromoims hydrophia来源的普鲁兰降解酶进化关系最相近，而与芽孢杆菌属OfeciBm)来源的普鲁兰降解酶进化关系较远。见图3所
/Jn o本发明还提供重组表达具有活性的I型普鲁兰酶的方法，所用的表达系统可以是大肠杆菌表达系统，也可以是酵母表达系统。为了获得具有活性的普鲁兰酶片段，本发明通过PCR的方法扩增了如图2所示的WyAs基因片段，分别是PluAs蛋白的四个核心结构域(22 1114位氨基酸，PluAs-I，蛋白预测大小117 KDa)，去除TOD结构域的基因片段(149 1344位氨基酸，PluAs-2，蛋白预测大小129 KDa)，革兰氏阴性菌普鲁兰酶的保守结构域(149 1114位氨基酸，PluAs-3，蛋白预测大小104 KDa)。该大肠杆菌重组表达质粒为pPET21a-PluAs-l、pPET21a-PluAs-2、pPET21a-PluAs-3，该重组表达蛋白C端融合6 XHis标签，利用Ni柱纯化获得与预测蛋白分子量相一致的重组普鲁兰酶片段。如图4所示泳道I为纯化后的PluAs-3，泳道2为蛋白标准分子量，泳道3为纯化后的PluAs-1，泳道4为纯化后的PluAs-2。纯化后的PluAs-1、PluAs-2、PluAs-3 的普鲁兰酶比酶活分别约为 600 U/mg，650 U/mg, 250 U/mg。本发明对重组普鲁兰酶最适pH进行了测定。分别配制含1%普鲁兰多糖的pH3. 0 10. 0的缓冲液，其中pH 3. 0 6. 0为20mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，pH 7. 0为20mM 的 NaH2PO4-Na2HPO4 缓冲液，pH 8. 0 10. 5 为 20mM 的 Tris-HCl 缓冲液，pH 11. 0 为20mM的甘氨F酸-NaOH缓冲液。取含有底物的缓冲液98 y L与2 U L纯化后的酶液一起在水浴中60°C反应10 min。测定普鲁兰酶活力，其中酶活力最高的设为100%。图5表明，该酶的最适pH均为8.0，在pH 7.0 10. 0的范围内酶活均在80%以上，在pH 5.0时，保留40% 70%左右的酶活。见图5所示。
本发明对重组普鲁兰酶最适温度进行了测定。将2 UL纯化后的酶液与98 UL含1%普鲁兰多糖的Tris-HCl中(pH 8.0)混匀，分别在20，30，40，50，60，70和80 °C温度下反应10 min，然后用DNS法测定普鲁兰酶活力，其中酶活力最高的设为100%。图6的结果表明3种重组普鲁兰酶的最适反应温度均为60 °C。见图6所示。本发明对重组普鲁兰酶的热稳定性进行了测定。将适量酶液放置在55 °C、60 V和65 °C下恒温水浴中，每隔15 min取样测定剩余酶活力，以保温0 min时的酶活力计为100%。图7的结果表明，在55 °C条件下处理lh，PluAs-I的酶活基本保持不变，PluAs-2和PluAs-2酶活力残余约70% ;由于淀粉加工时通常采取50 55 V的反应温度，该酶的在这一温度下的物理化学的稳定性符合工业发展的需求。见图7所示。本发明对重组普鲁兰酶的pH稳定性进行了测定。将适量酶液分别置于pH 3 11的缓冲液中。4 V放置24 h后，于普鲁兰酶最适条件下测定残余的酶活力，其中酶活力最高的设为100%。图8的结果表明，该重组普鲁兰酶在碱性和中性环境下非常稳定；在pH5. 0的条件下反应24 h残余酶活为60% 80%。在pH为3. 0 4. 0酸性的条件下，酶活有 比较明显的降低。见图8所示。根据 IUBMB (International Union of Biochemistry and MolecularBiology)建立的两类分类标准(把普鲁兰降解酶分成多类，其中I型普鲁兰酶(Type Ipullulanase, EC 3. 2. I. 41)专一水解普鲁兰糖a _1，6糖苷键产生麦芽三糖；新普鲁兰酶(Neopullulanase，EC3. 2. I. 135)专一水解普鲁兰多糖的a-1，4糖苷键产生潘糖。不同类型的普鲁兰降解酶能够水解不同的糖苷键，并生成不同的产物，因此在各个行业中的应用也不尽相同；而I型普鲁兰酶在工业上的应用价值最为广泛。本发明通过薄层层析(TLC)和离子色谱法(HPAEC，如图10)对PluAs-I水解普鲁兰多糖的产物进行了分析，层析分析图见图9所示。图9中泳道I为葡萄糖(Cl)、麦芽糖(C2)、麦芽三糖(C3)层析后位置；泳道2为未水解过的普鲁兰多糖(0 min);泳道3 9是使用PluAs-I水解普鲁兰多糖不同时间得到的产物(泳道3 5 min ;泳道4 10 min ;泳道5 15 min ;泳道6 20 min ;泳道7 25 min ；泳道8:30 min;泳道9:40 min)。该图表明PluAs-I的通过内切方式为水解普鲁兰多糖，得到的终产物为三糖。通过TLC分析表明PluAs-2和PluAs-3具有相同的水解方式。为了进一步鉴定该普鲁兰降解酶的催化分类，本发明采取离子色谱的方法对其水解普鲁兰多糖的产物进行了鉴定。见图10所示。该普鲁兰降解酶水解普鲁兰多糖产生的三糖产物，其离子色谱保留时间约为17.5 min (如A)。通过标准加入法分析，结果表明该酶水解普鲁兰糖三糖产物的色谱峰与麦芽三糖标准品的峰发生重叠(如B)，形成单一峰，这一结果说明该普鲁兰酶完全水解普鲁兰多糖的产物是麦芽三糖，因此PluAs-I的催化分类属于I型普鲁兰酶。通过相同的实验证明PluAs-2和PluAs-3的催化分类均为I型普鲁兰酶。关于重组普鲁兰酶PluAs-I与淀粉糖化酶对淀粉的协同糖化作用研究。由于3个重组普鲁兰酶中PluAs-I具有较好的热稳定性和pH稳定性，本发明挑选PluAs-I与淀粉糖化酶协同作用，检测其对淀粉的糖化作用。见图11所示。其中，A为a-淀粉酶糖化淀粉不同时间的葡萄糖产物含量变化为a -淀粉酶糖和普鲁兰酶协同水解淀粉不同时间的葡萄糖产物含量变化。该图的结果表明，使用两种酶协同水解淀粉能够制备更高葡萄糖含量的产物。
本发明用HPAEC分析PluAs-I与淀粉糖化酶对淀粉协同糖化后的水解产物。见图12所示。其中，(A)为糖化前的淀粉液化液(糖化0 h样品)，可以发现糖化之前葡萄糖含量较低，样品中含有较多二糖、三糖等不同聚合度的糖组分。(B)为单一添加糖化酶水解淀粉液化液6 h所得的产物；从图中可知，糖化6 h后液化液中得到较高浓度的葡萄糖组分，但还有较少两的三糖组分，出峰时间为18.5 min;由于糖化酶对a _1，6糖苷键水解效率较低，推测该三糖组分可能为潘糖或异潘糖(由a-1，6糖苷键和a-1，4糖苷键组成)。(C)为同时添加糖化酶和普鲁兰酶对淀粉液化液协同水解6 h后产物分析图谱；结果表明使用同时使用两种酶具有更好的效果，所得糖产物都为葡萄糖，并未检测到多余的三糖组分。因此，在工业应用中同时使用两种酶将对葡萄糖浆等产物的制备具有更好、更高效的作用。综上，本发明获得了 3种含有基因核心结构域的大肠杆菌重组质粒，重组表达蛋白比酶活约250 650 U/mg。重组表达的普鲁兰酶最适pH均为8. 0，最适反应温度为60°C;在55°C处理I h，该普鲁兰酶的残余活性达到了 90%以上。通过薄层层析和离子色谱分析鉴定该重组表达普鲁兰酶为I型普鲁兰酶，能够水解普鲁兰多糖或淀粉中的a -1，6葡萄糖糖苷键，不能水解直链淀粉和环糊精。Triton X-100、SDS、尿素、甲醇、乙醇、Mn2+能够 不同程度的提高酶活；a-，￠-, Y-环糊精、Cu2+、Ni2+、Co2+对酶活力具有较大程度的抑制。本发明的重组普鲁兰酶可应用于淀粉加工、环保、食品、医疗保健等行业。
图I :气单胞菌属来源普鲁兰酶基因序列比对图。根据已完成基因组测序的气单MMAeromonas hydrophia^Aeromonas salmonicida 热Aeromonas veronii
酶基因，通过Align-X进行序列软件比发现I 100 bp和4001 4122 bp区域为保守序列,如图I (A)和I (B)所示。根据此区域的核苷酸序列特征,设计引物扩增了 Jeroffioaassp. As完整的普鲁兰酶编码基因(/77yAs)。该基因全长4053 bp，编码1351个氨基酸，蛋白预测分子量为140 KDa。与该蛋白的氨基酸序列相似度最高的序列为Jerofflmas hydrophia假定的普鲁兰酶，其相似度仅为89%，表明获得普鲁兰酶基因为新基因。图2 PluAs蛋白结构域。图3 :气单胞菌属普鲁兰酶PluAs (Aeromonas sp. PluAs)系统发育树分析。图4 :重组表达 PluAs-I、PluAs-2、PluAs_3 蛋白纯化图。图5 重组普鲁兰酶最适pH测定图示。图6 :重组普鲁兰酶最适温度测定图示。图7 :重组普鲁兰酶的热稳定性测定图示。图8 :重组普鲁兰酶的pH稳定性测定图示。图9: PluAs-I水解普鲁兰多糖产物薄层层析分析图。图10 =PluAs-I水解普鲁兰多糖产物离子色谱分析图。图11 :重组普鲁兰酶PluAs-I与淀粉糖化酶对淀粉的协同糖化作用图示。图12 =HPAEC分析PluAs-I与淀粉糖化酶对淀粉协同糖化后的水解产物。
具体实施例方式所用实验材料和相关操作方法如下，未详述处可以参考冷泉实验室的《分子克隆》(J. Sambrook, et al.,第二版，1996)
I.菌株，载体大肠杆菌菌株E. coli Rosetta和ToplO,质粒pPMD18_T,pPET21a,均为本实验室保存，与现有文献中相应物质的性质相同。2.培养基
LB 培养基1.0% Polypeptone (BBI),0. 5% Yeast Extract (Oxoid),0. 5% NaCl, pH
7. O。3.实验试剂普鲁兰多糖、马铃薯淀粉、直链淀粉等多糖购于Sigma公司；分子生物学需要的试剂购自TaKaRa公司；引物合成和DNA测序由上海英潍捷基生物技术有限公司完成。DNS (3，5-二硝基水杨酸)试剂(甲液溶解6. 9 g结晶酚于15. 2 mL 10%Na0H中，用蒸馏水稀释至69 mL，再加入6. 9 g NaHSO3 ;乙液255克酒石酸钾钠加至300 mL 10%Na0H中，再加入880 mL 1%3，5- 二硝基水杨酸溶液；将甲液与乙液相混合即得到黄色DNS试剂，储于棕色瓶中，在室温下放置7 10天后使用)。 4.大肠杆菌系统表达及纯化酶蛋白将含有酶基因的PET21a质粒转化至大肠杆菌表达菌Rosetta中,涂布于LB+Amp平板,37°C倒置培养至转化子出现。用牙签挑取一个单克隆转化子接种至3ml LA (LB培养液+100ug/ml氨苄青霉素)培养液中，37°C，220 rpm培养过夜。次日取0.5 mL过夜菌至50 mL LA中，37°C，220rpm培养，当菌密度(0D. 600)达到0.4 0.6，加入终浓度为0. I mM的IPTG，22°C，220rpm继续培养12小时。离心收集菌体，用pH8.0，20 mM Tris-HCl重悬菌体，超声破碎大肠杆菌细胞，高速离心收集上清，Ni-NTA柱结合目的酶蛋白，用梯度浓度的咪唑洗脱蛋白。5.普鲁兰酶酶活力测定方法本发明使用DNS还原糖法测定普鲁兰酶的酶活力。具体方法如下取10 u L适当稀释酶液加入90 ii L含1% (质量体积比)的普鲁兰多糖的Tris-HCl缓冲液中(pH 8.0，20 mM)，60°C反应10 min，加入100 u L DNS终止反应，煮沸10min显色；以10 UL煮沸灭活的酶液为空白对照，570 nm测定吸光值，根据标准曲线计算产生还原糖的量，每组反应做3个平行样品。酶活单位定义每分钟释放I ymol还原糖(以葡萄糖计)定义为一个酶活力单位(U)。实施例I :通过PCR方法获得Jerofflmas 5/7. As普鲁兰酶全长基因
通过比对已报道的气单胞菌属普鲁兰酶基因(来源于对产酶菌株全基因组测序后获得的信息)，寻找基因5’和3’端保守区域(见图3)，设计PCR引物Aero-F和Aero-R如下Aero-F ATGGATATGAAMAGACCAAAGTGGCG (正向引物，不含酶切位点)，即 SEQ ID NO 3。Aero-R CTTGRCRCKGCACTCCTGRATSACRGCRGTACC (反向引物，不含酶切位点)，即SEQ ID NO 4。以Aeromonas sp. As基因组为模板，以上述引物进行PCR扩增。PCR扩增产物回收后连于PMD18-T载体，转化大肠杆菌ToplO菌株，获得质粒pT-pluAs，测序后果利用NCBI的数据库的Blastp软件(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)进行蛋白质同源性比对和蛋白结构域分析(图2)。实施例2 :通过PCR方法获得WyAs-I及大肠杆菌Rosetta基因工程菌的制备 本发明通过PCR的方法扩增了如图2所示的基因片段，分别是=PluAs蛋白的四
个核心结构域(22 1114位氨基酸，PluAs-I )，去除PUD结构域的基因片段(149 1344位氨基酸，PluAs-2)，革兰氏阴性菌普鲁兰酶的保守结构域(149 1114位氨基酸，PluAs-3)。该大肠杆菌重组表达质粒为 pPET21a-PluAs-l、pPET21a-PluAs-2、pPET21a-PluAs_3，该重组表达蛋白C端具有融合表达的6 XHis标签。设计PCR 引物 Pul_F64 和 Pul_R3342 扩增 PluAs-1，如下
Pul-F64 CCC GAATTC TGTAACGACAACAGTTCTTCACCCTCC(正向引物，含&0RI 酶切位点)，即 SEQ ID NO 5。Pul-R3342 CCC GCGGCCGC CCCCAAGAAGCCACGGACAAACA (反向引物，含酶切位点，不含终止密码子，利用载体上的终止密码子终止表达)，即SEQ ID NO 6。 设计PCR 引物 Pul_F445 和 Pul_R4032 扩增 PluAs-2，如下
Pul-F445 CCC GAATTC AAGGTGGTCTTCAGCGATCACCC
(正向引物，含&0RI酶切位点)，即SEQ ID NO 7。Pul-R4032 CCC GCGGCCGC CTTGGCACGGCACTCCTGGAT
(反向引物，含酶切位点，不含终止密码子，利用载体上的终止密码子终止表达)，即 SEQ ID NO 8。使用引物Pul-F445和Pul-R3342 扩增 PluAs-3，序列即 SEQ ID NO 7和 SEQ ID NO6。以质粒pT-pluAs为模板，使用以上引物PCR扩增，PCR扩增产物回收后连于pPET21a载体，转化大肠杆菌ToplO菌株，获得质粒pPET21a-PluAs_l/-2/-3。 将原核表达质粒pET21a-PluAs-l/-2/-3按参考例4的方法转化大肠杆菌Rosetta0从转化子中各挑选5个阳性转化子，与受体菌阴性对照同步进行发酵，发酵上清也分别进行SDS-PAGE和普鲁兰酶的酶活力检测，结果显示工程菌株Rosetta/pET21a-PluAs-l/-2/-3各阳性转化子均有相同的表达量且酶活一致，可用于后续的实验研究。蛋白纯化的方法见参考例4，纯化后蛋白条带如图4。实施例3 :重组表达普鲁兰酶的酶学特性分析
(I)最适PH值测定分别配制含1%普鲁兰糖的pH 3.0 10.0的缓冲液，其中pH
3.0 6. 0为20mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，pH 7. 0为20mM的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液，pH 8. 0 10. 5为20mM的Tris-HCl缓冲液，pH 11. 0为20mM的甘氨酸-NaOH缓冲液。取含有底物的缓冲液98 ii L与2 UL纯化后的酶液一起在水浴中60°C反应10 min。测定普鲁兰酶活力，其中酶活力最高的设为100% (如图5)。(2)最适反应温度测定将2 UL纯化后的酶液与98 U L含1%普鲁兰多糖的Tris-HCl 中(pH 8.0)混匀，分别在 20，30，40，50，60，70 和 80 °C温度下反应 10 min，然后用DNS法测定普鲁兰酶活力，其中酶活力最高的设为100% (如图6)。(3)热稳定性分析将适量的酶液放置在55°C、60°C和65°C下恒温水浴中，每隔15min取样测定剩余酶活力，以保温0 min时的酶活力计为100% (如图7)。(4)pH稳定性分析将适量酶液分别置于pH 3 11的缓冲液中，其中pH 3. 0 6. 0为20mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，pH 7. 0为20mM的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液，pH8. 0 10. 5为20mM的Tris-HCl缓冲液，pH 11. 0为20mM的甘氨酸-NaOH缓冲液。酶液于4 V放置24 h后，在普鲁兰酶最适条件下测定残余的酶活力，其中酶活力最高的设为
100% o实施例4 :重组表达普鲁兰酶的酶学催化类型分析由于不同类型的普鲁兰酶的应用不相同；其中，I型普鲁兰酶在工业上的应用最广。为了鉴定重组表达普鲁兰酶的酶学催化类型，本发明使用TLC和HPAEC方法对重组普鲁兰酶水解普鲁兰多糖产物进行分析，具体操作如下
取5 U L化后的酶液加入到95 ii L的底物(含1%普鲁兰多糖的20 mM Tris-HCl，pH8.0)，60 °C反应3 h，取2 3 ii L水解后样品点样于Silica gel 60 F254板上，吹干后将硅胶板放置在丁醇/乙醇/水(5:3:2)展层液中展2 3次。展层结束后，在硅胶板上喷上甲醇/浓硫酸(7:3)显色液，于110°C烘干显色5 min。将上述酶解液2000倍,取I mL上样于色谱柱,使用Dionex 600离子色谱分析系统检测酶解液的组成，稀释2000倍的1%的麦芽三糖作为标准品。HPAEC洗脱条件在100mmol/L NaOH中以0 250 mmol/L醋酸钠梯度洗脱30 min,流速为I mL/min。实施例5 :重组表达普鲁兰酶的底物特异性分析
用20 mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)配制1%的普鲁兰多糖、马铃薯淀粉、直链淀粉、糖原、a-环糊精、￠-环糊精、Y-环糊精溶液，取2 UL纯化后的酶液与98 UL底物混合，于60 °C反应10 min，用DNS还原糖法测定重组普鲁兰酶对不同底物的水解酶活。将重组普鲁兰酶水解普鲁兰多糖的能力设为100%，计算其水解淀粉、糖原等多糖的能力。结果如表I所示，重组普鲁兰酶能够特异水解普鲁兰多糖和淀粉，其水解淀粉能力约为水解普鲁兰多糖的14% 16%。不能够水解直链淀粉，糖原和a -/ 0 -/ Y -环糊精。表I. PluAs-I底物特异性分析
权利要求
1.一种来源于气单胞菌属的普鲁兰酶编码基因，其特征在于编码I型普鲁兰酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO I所示，记为PIuAs。
2.如权利要求I所述的普鲁兰酶编码基因，其特征在于所述编码的I型普鲁兰酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3.具有I型普鲁兰酶活性的DNA片段，其特征在于分别是SEQID NO 2的第22 1114位氨基酸，记为PluAs-Ι，蛋白预测大小117 KDa ;SEQ ID NO 2的第149 1344位氨基酸，记为PluAs-2，蛋白预测大小129 KDa ；SEQ ID NO 2的第149 1114位氨基酸，记为PluAs-3，蛋白预测大小104 KDa0
4.含有如权利要求3所述具有I型普鲁兰酶活性的DNA片段的核苷酸编码序列的重组质粒，其特征在于由含有所述DNA片段的核苷酸编码序列克隆至载体pET21a的多克隆位点而获得，分别记为 pET21a-PluAs-l、pET21a-PluAs-2、pET21a-PluAs-3。
5.ー种重组表达具有活性的I型普鲁兰酶的方法，其特征在于，所用的表达系统是大肠杆菌表达系统，或者是酵母表达系统。
6.如权利要求4所述的重组表达的I型普鲁兰酶片段在淀粉加工、环保、食品、或医疗保健中的应用。
全文摘要
本发明属于基因工程和蛋白质工程技术领域，具体为一种I型普鲁兰酶的编码基因，及其重组表达和应用。本发明提供了来源于气单胞菌属的普鲁兰酶新基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示，记为pluAs。该普鲁兰酶为I型普鲁兰酶，能够降解普鲁兰多糖或淀粉中的α-1，6葡萄糖糖苷键。重组表达该基因的三种具有I型普鲁兰酶活性的DNA片段，该重组普鲁兰酶片段最适pH均为8.0，最适反应温度为60℃；在55℃处理1h，该普鲁兰酶的残余活性达90%左右；在pH7～10的条件下非常稳定。使用重组普鲁兰酶与淀粉糖化酶协同糖化淀粉，能够制备具有更高葡萄糖含量的产物。本发明提供的重组普鲁兰酶可应用于淀粉加工、环保、食品、医疗保健等行业。
文档编号C12N15/70GK102676557SQ20121014552
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月11日 优先权日2012年5月11日
发明者冯碧薇, 吕红, 周峻岗, 王儒恺 申请人:复旦大学