组合物及甲硫氨酸的生产方法

专利名称：：组合物及甲硫氨酸的生产方法
技术领域：
：本发明公开了组合物，以及用如微生物、酶和化学物质生产甲硫氨酸及相关产物的方法。
背景技术：
：甲硫氨酸是动物食谱中的必需氨基酸。长期以来，甲硫氨酸的制备是采用丙烯醛、甲硫醇和氰化物作为起始物质，通过各种多步化学反应合成的。有两种产物形式D，L甲硫氨酸及其羟基类似物。与其它氨基酸不同，D-甲硫氨酸在体内转化为必需的L-异构体。据报导，由于家禽需求量的增加和近来作为猪饲料添加剂，饲料级甲硫氨酸的市场在不断扩大。甲硫氨酸的主要生产商(DegussaAG,Adisseo和Novus)满足市场需求的能力取决于原料供应。中间产物丙烯醛和甲硫醇必须转化为3-甲基硫丙醛(3-methylthiopropionaldehyde,MMP)并通过氢氰酸进一步转化成甲硫氨酸。所有这三家生产商都计划增加甲硫氨酸的生产设备并与原料生产相结合(Chem.MarketingReporterApril7，2003)。对大量生物体的甲硫氨酸的生物合成途径(天冬氨酸家族成员)的研究显示出相似和差异。最初确定的反应步骤为高丝氨酸在高丝氨酸酰基转移酶(homoserineacyItransferase)的催化作用下发生酰化反应，除了发生转移的酰基有所不同，它普遍存在于所有生物体中。metA催化作用的产物为乙酰高丝氨酸或琥珀酰高丝氨酸。乙酰高丝氨酸随后通过转硫途径或定向巯基化途径转化为高半胱氨酸。两种途径都被报导存在和作用于酵母、真菌、绿色植物和棒状杆菌属(Corynebacteriumglutamicum)的细菌中。大肠杆菌(E.coli)仅采用转硫途径。转硫途径以胱硫醚作为中间产物并由半胱氨酸作为硫供体。定向巯基化途径包括将硫化物直接整合到酰基高丝氨酸。该途径中的最后一步为高半胱氨酸在高半胱氨酸转甲基酶(homocysteinemethyltransferase,由metE或metH基因编码)的催化作用下转化为甲硫氨酸。其它用于动物饲料的重要的氨基酸，如赖氨酸、苏氨酸和色氨酸通过发酵制备。因此，这些氨基酸可由葡萄糖和其它再生资源作为起始物质生成。遗憾的是通过发酵的方法生产甲硫氨酸并不成功，至今仍采用甲硫氨酸的化学合成。这其中部分原因是由于缺少有效构建的生产甲硫氨酸的生物合成途径及生产甲硫氨酸的合适生产宿主。下面公开了改良的甲硫氨酸生物合成途径及其生产宿主。
发明内容概述通过发酵的方法生产甲硫氨酸及相关产物如S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAMe)的过程在此描述。基因工程化的含有重组DNA分子并生产甲硫氨酸的微生物也描述于此。本发明描述了含有具有定向巯基化活性的外源核酸序列编码的肽(EC2.5.I.49，EC4.2.99.-)，并含有具有转硫活性的内源核酸序列编码的肽(EC2.5.I.48和4.4.I.8)的微生物。该微生物能产生甲硫氨酸及相关产物。在一些例子中，该微生物能产生至少O.1，I，2，5，10，50，75，90或100g/L胞外浓度的甲硫氨酸或SAMe。在一些例子中，存在不止一种甲硫氨酸的生物合成途径，较之在缺少外源核酸序列(其编码的肽具有定向巯基化活性)的条件下，允许生物体产生更多的甲硫氨酸。在其它的例子中，在生物体中活跃着两种以上的甲硫氨酸生物合成途径。在这些例子中，一个或多个外源核酸序列编码的肽具有定向巯基化活性。其中的一种肽能够以O-琥珀酰高丝氨酸作为底物，另一种肽能够以O-乙酰高丝氨酸作为底物。在一些例子中，构建的产甲硫氨酸及相关产物，如SAMe的微生物，所产生的至少10%的甲硫氨酸来自于转硫生物合成途径。在另一些例子中，它们产生的至少20，30，40或50%的产物来自于转硫生物合成途径。在一些例子中，构建的产甲硫氨酸及相关产物，如SAMe的微生物，由定向巯基化生物合成途径活性，产生至少10%的甲硫氨酸。在另一些例子中，它们由定向巯基化生物合成途径，产生至少20，30，40或50%的产物。在一些例子中，构建产甲硫氨酸及相关产物的微生物，以减毒由基因如metD，metK,metj,thrB,serA编码的肽或其制品的活性。在另一些例子中，微生物还被构建成过表达一个或多个基因，如metA,metB,metC,metE,metY,metZ,metX,metH,cysPWUA,cysD,cysN,cysC,cysH,cysl,cysj,cysG,csyK和cysM。本发明还提供生产甲硫氨酸和SAMe的方法。这些方法包括培养构建的生产甲硫氨酸及相关产物的微生物并分离产物。在一些例子中，微生物可以是大肠杆菌(E.coli)，假单胞菌属(Pseudomonassp.)或棒状杆菌属(Corynebacteriumglutamicum.)。在此还描述了新的核酸序列及相应的氨基酸序列(SEQIDN0S:I和2)。这些核酸序列和片段以及这些核酸序列的可用于在重组微生物中产生肽。这些肽用于产生甲硫氨酸和SAMe。这些肽及其变化形式和其片段还用于产生专门的结合剂，如抗体。省略中间产物磷酸腺苷酰硫酸(phosphoadenylylsulfate,PAPS)改善硫的同化过程的方法也描述于此。该方法可用于任何产甲硫氨酸的微生物。该方法是通过在微生物中引入重组的核酸序列，其允许一个或多个腺苷酰硫酸还原酶(adenylylsulfatereductases)(ECI.8.99.2或I.8.4.9)的过量表达。过量表达可以通过引入改变的重组核酸序列，或通过引入新的控制因子，如启动子或增强子，其增强了内源腺苷酰硫酸还原酶的表达或增强了编码腺苷酰硫酸还原酶的重组核酸序列的表达。通过下面的详细描述和具体实施例，本发明及其它方面是显而易见的。图I表明各种微生物产甲硫氨酸的三种途径。所有的途径都部分依赖于采用天冬氨酸作为生产甲硫氨酸的起始物质。天冬氨酸经过多步反应转化为高丝氨酸，高丝氨酸通过MetA或MetX转化为O-乙酰高丝氨酸或0_琥珀酰高丝氨酸。一些微生物，如大肠杆菌和假单胞菌属(Pseudomonassp.)利用MetA多肽产生0_琥拍酰高丝氨酸,而其它微生物,如棒状杆菌属和钩端螺旋体属(Corynebacterium和Leptospirasp.)利用MetX产生O-乙酰高丝氨酸。O-琥珀酰高丝氨酸和O-乙酰高丝氨酸随后通过巯基化途径完全转化为高半胱氨酸，或者通过转硫途径转化为高半胱氨酸(两个反应均在此处做详细描述)。与转硫途径有关的酶以**表不，与疏基化途径有关的酶以*表不。图2表示甲硫氨酸在TF4076BJF中的累积量，仅通过转硫途径表达(TF4076BJF)，仅通过巯基化途径表达(TF4076BJF-A)，或由两种途径同时表达(TF4076BJFmetYX(Lm)。图3示意性表示用于识别反馈抑制抵抗剂metA基因突变体的筛选方法(每个例子中的产品表达以阴影椭圆标出)。图4表示甲硫氨酸的表达受到反馈抑制抵抗剂metA基因的抑制随时间变化的曲线。图5表示大肠杆菌中甲硫氨酸的转运模型。图6表明天然的硫同化途径及新的备选的硫同化途径。序列表序列表中所示的核酸及氨基酸序列采用标准字体缩写，3个字符编码用于氨基酸。仅显示出每个核酸序列的一条链，其互补链可以参考已知链得出。SEQIDNOSil-IO为来自于E.coli的各种突变基因metA的核酸序列和相应的氨基酸序列。SEQIDN0S:11-34为实施例中所用的各种引物序列。发明详述缩写和术语下面术语和方法的解释较好地描述了本发明并指导本领域的技术人员进行实施。除文中另外明确指定以外，在此所用的“包含，包括”表示“包括”，单数形式的“一”包括复数形式，例如，参见“包含一细胞”表明包括一个或多个这样的细胞，文中提及“包含高半胱氨酸合酶”表明包括一个或多个高半胱氨酸合酶，并等同于本领域技术人员的公知技术等等。除文中另外明确指定以外，术语“或”表示可选择所述备选要素中的单一要素，或两个或多个要素的结合。例如，“高半胱氨酸合酶活性或胱硫醚Y-合酶活性”表示高半胱氨酸合酶活性，胱硫醚Y-合酶活性，或高半胱氨酸合酶活性与胱硫醚Y-合酶活性的结合。有另外说明的除外，在本发明中使用的所有技术和科学术语与本领域已知的常规技术相同。尽管与本发明描述的相似或等同的方法和材料可用于实施或检验本发明，合适的方法和材料描述如下。所述的材料、方法和实施例仅用于解释说明，并不能限制本发明的范围。通过如下详细的描述及权利要求中的描述，本发明的其它特征和优点是显而易见的。登录号(AccessionNumbers):本发明中的登录号来自于NCBI数据库(NationalCenterforBiotechnologyInformation),其由美国国立卫生研究院(theNationalInstituteofHealth,U.S.A.)维护。数据库提供登录号的日期为2007年2月20日。EC号(EnzymeClassificationnumbers,酶分类号)本发明中的EC号来自于KEGG配合基数据库，由基因和基因组京都百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomics)维护，部分由东京大学主办。数据库提供EC号的日期为2007年2月20日。减毒(Attenuate):减轻某物的影响、活性或强度。例如，减毒特定酶对反馈抑制或由化合物(该化合物不是产物或反应物)导致的抑制的敏感度(非特定途径反馈，non-pathwayspecificfeedback),使得该酶活性不受化合物存在的影响。例如，metA基因及其相应的氨基酸序列(如以序列SEQIDN0S:2所示为例)显示出几个突变，减毒了其反馈抑制的敏感度。在实施例3.B中详细描述了MetA敏感度的减毒。另一个例子，酶的活性降低可认为是减毒。cDNA(互补DNA):—条无间隔序列、非编码区(内含子)和调控序列，决定转录的DNA。cDNA可以从细胞中提取的信使RNA通过反转录生成。缺失，去除(Deletion):从核酸分子中去除一个或多个核苷酸，或从蛋白分子中去除一个或多个氨基酸，将去除后的两端连接。可检测，可见(Detectable):可检测到的或确定的存在。例如，如果由产物或反应物产生的信号足以检测到，由反应物生成的产物，如O-琥珀酰高丝氨酸或高半胱氨酸的产生，是可以检测到的。定向疏基化活性(Directsulfhydrylationactivity):OSHS或OAHS与S2_直接反应生成高半胱氨酸的能力。具有该活性的肽包括诸如高半胱氨酸合酶(EC4.2.99.-,EC2.5.I.49)，其由基因metZ和metY编码。DNA:脱氧核糖核酸。DNA为长链聚合物，其包括大部分活有机体的遗传物质(一些病毒的基因含有核糖核酸，RNA)。DNA聚合物的重复单位为四个不同的核苷酸，其中每个核苷酸为四个碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶之一与脱氧核糖结合并带有一个磷酸基团。在DNA分子中由三个核苷酸组成密码子，为氨基酸编码。术语密码子还用于由DNA序列转录得到的mRNA中的三个核苷酸相应的(和互补的)序列。内源(Endogenous):在此用于表示核酸分子以及特定细胞或微生物,说明细胞中的核酸序列或肽序列没有利用重组构建技术，也没有利用重组构建技术植入细胞。如细胞最初从自然界中分离出来时其中的基因。如果通过重组技术，如启动子或增强子引发转录或翻译，调控序列发生改变，仍认为基因是内源的。外源(Exogenous):在此用于表示核酸分子以及特定细胞,是指任一核酸分子不是来自于自然界发现的特定细胞中。因此，非天然产生的核酸分子一旦导入细胞内，将被认为对细胞来说是外源的。天然产生的核酸分子对于特定细胞来说也可以成为外源的。例如，从细胞X中分离出的完整编码序列，一旦将该编码序列导入细胞Y中，则对于细胞Y来说，该编码序列是外源的，即使X和Y是同一类型的细胞。表达(Expression):基因编码的信息转化为细胞的结构和功能的过程，如蛋白质、转运RNA或核糖体RNA。表达的基因包括转录成mRNA，然后翻译成蛋白质，以及那些转录成RNA，但不翻译成蛋白质(例如，转运RNA和核糖体RNAs)的基因。功能缺失(FunctionalDeletion):基因序列的突变、部分或全部缺失、插入或其它变化，其减少或抑制基因产物的产生或使基因产物丧失功能。例如，E.coli中基因metj的功能缺失，降低了对甲硫氨酸生物合成途径的抑制。在另一个例子中，E.coli中基因thrB的功能缺失，降低了苏氨酸生物合成途径中对高丝氨酸的利用。在一些例子中，功能缺失表不敲除突变。分离(Isolated)分离的”生物成分(如核酸分子、蛋白质或细胞)表示从天然存在的成分中与其它生物成分完全分离或纯化出来，如其它的染色体以及染色体体外DNA、RNA和蛋白质。“分离”出的核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法而纯化出来的核酸分子和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达以及通过化学合成方法所产生的核酸分子和蛋白质。在一个例子中，分离表示天然产生的核酸分子不直接与序列的两端邻接，来自于生物体天然产生的基因组其核酸分子是直接邻接的(一端与5’端相连，另一端与3’端相连)。核酸分子(Nucleicacidmolecule):包括RNA和DNA分子,并不限于cDNA、基因组DNA和mRNA。包括合成的核酸分子，如那些通过化学合成的或重组产生的核酸分子。该核酸分子可以为双链或单链。单链的核酸分子可以是有义链或反义链。此外，核酸分子可以是环状的或线性的。可操作地连接(Operablylinked):当第一个核酸序列与第二个核酸序列具有功能上的关系，可将第一个核酸序列可操作地连接到第二个核酸序列。例如，如果启动子影响到编码序列的转录或表达，将该启动子与该编码序列可操作地连接。一般情况下，可操作地连接的DNA序列是邻接的，其对于在同一阅读框中连接两个蛋白编码区是必须的。各自基因的构象串联转录为单一的信使RNA，称为操纵子。这样将基因的位置邻近，例如在质粒载体中，通过单个启动子的转录调控，形成了一个合成的操纵子。开放阅读框ORF(openreadingframe):一系列的三个核苷酸(密码子)编码肽、多肽或氨基酸，无任何终止密码子。这些序列通常可翻译成肽。纯化(Purified):术语纯化并非指绝对纯化；它表示相对的概念。因此，例如纯化肽的制备，如琥珀酰辅酶A高丝氨酸酰基转移酶或高半胱氨酸合酶的制备，所得到的肽浓度要比细胞中肽浓度大。例如，纯化的肽从其可能结合的细胞成分中完全分离出来(核酸、脂类、碳水化合物以及其它肽)。在另一个例子中，纯化的肽的制备是从污染物，如那些可能存在于所述肽的化学合成的污染物中完全游离出来。在一个例子中，当样品中肽的重量百分比至少占大约50%时，例如至少占大约60%，70%,80%,85%，90%,92%，95%，98%，99%或更多时，肽是纯化的。可用于纯化肽的方法的例子，包括但不限于Sambrook等公开的方法(MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NewYork,1989,Ch.17)。蛋白纯度可以通过,例如将蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，接着在染色的聚丙烯酰胺凝胶上呈现出单一的肽的条带来测定；通过高压液相色谱测定；通过测序或其它常规方法测定。重组(Recombinant):重组的核酸分子或蛋白指天然不存在的序列，其序列是通过将两个单独的序列片段人工地结合。该人工结合是可以实现的，例如通过化学合成或通过人工操作将分离的核酸分子或蛋白片段结合，如遗传工程技术。重组还用于描述经过人工操作的核酸分子，但含有与生物体中发现的相同的调控序列和编码区。序列同一性/相似性(Sequenceidentity/similarity):两个或多个核酸序列的同一'I"生/相似性，或两个或多个氨基酸序列的同一'I"生/相似性，可表不为序列同一'I"生或相似性。序列同一性可以通过相同序列的百分数来测定；高百分数表示高序列同一性。序列相似性可以通过相似序列的百分数来测定(考虑到保守氨基酸的替换)；高百分数表示高序列相似性。采用标准方法进行比对，同源(Homologs)或直系同源(orthologs)的核酸或氨基酸序列具有相对高的序列同一性/相似性。比较序列间差异的比对方法是本领域公知的。各种程序和比对运算法则描述于此Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981;Needleman&ffunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970;Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444,1988;Higgins&Sharp,Gene,73:237-44,1988;Higgins&Sharp,CABIOS5:151-3，1989;Corpet等，Nuc.AcidsRes.16:10881-90,1988;Huang等ComputerAppls.intheBiosciences8，155-65,1992;andPearson等，Meth.Mol.Bio.24:307-31，1994.Altschul等，J.Mol·Biol.215:403-10，1990，提供了详细的序列比对方法和同源性预测。NCBIBasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST)(Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-10,1990)可以通过几种资源获得，包括美国国立信息中心(NCBI，NationalLibraryofMedicine,Building38A,Room8N805,Bethesda,MD20894)及因特网，根据比对序列的不同，采用序列分析程序blastp,blastn,blastx,tblastn和tblastx。其它信息可参见NCBI网站。BLASTN用于比较核酸序列，BLASTP用于比较氨基酸序列。比较两种核酸序列，选项可设置成_i设置成包含要进行比对的第一条核酸序列的文件(如C:\seql.txt)；-j设置成包含要进行比对的第二条核酸序列的文件(如C:\seq2.txt);_p设置成blastn;_o设置成任何想要的文件名(如C:\output.txt)；-q设置成-I；-r设置成2;其它选项为默认设置。例如，下面的命令可用于生成含有两个序列比对结果的输出文件C:\B12seq-ic:\seql.txt_jc:\seq2.txt-pblastn—oc:\output.txt-q-l_r2。比较两个氨基酸序列，B12seq的选项可设置成_i设置成包含要进行比对的第一条氨基酸序列的文件(如C:\seql.txt);_j设置成包含要进行比对的第二条氨基酸序列的文件(如C:\seq2.txt)；-p设置成blastp;_o设置成任何想要的文件名(如C:\output.txt);其它选项为默认设置。例如，下面的命令可用于生成含有两个氨基酸序列比对结果的输出文件C:\B12seq-ic:\seql.txt_jc:\seq2.txt-pblastp-οc:\output.txt。如果两个比对的序列具有同源性，指定的输出文件将列出所比对序列的同源区域。如果两个比对的序列不具有同源性，指定的输出文件将不显示比对的序列。一旦进行比对，匹配的数量由存在于两个序列中的相同核苷酸或氨基酸的数量来决定。序列同一性的百分数由区分匹配的数量决定，或者通过设定比对序列的长度进行区分，或者通过连接长度(如从比对序列中设定100个连续的核苷酸或氨基酸残基)进行区分，将得到的结果值乘以100。例如，当与具有1554个核苷酸的测试序列进行比对，核酸序列具有1166个匹配的核苷酸，即75.0%的序列同一性(1166+1554X100=75.0)。序列同一性百分数的值采用四舍五入。例如，75.11,75.12,75.13和75.14四舍五入为75.1，而75.15，75.16，75.17，75.18和75.19四舍五入为75.2。长度值总是保持为整数。比较大于30个氨基酸的序列，采用Blast2序列功能，通过BL0SUM62矩阵设置系统默认参数(开放间隔值11，每个残基间隔值I)。采用NCBIBasicBlast2.0，间隔的blastp来自如nr或swissprot数据库，同源性通常是比对的全长氨基酸序列中，有70%的序列相同。通过blastn程序搜索后的结果经DUST过滤(HancockandArmstrong,1994,Comput.Appl.Biosci.10:67-70)。其它程序使用SEG。此外，可进行人工比对。采用该方法进行评估，蛋白的相似性越高，序列同一性百分数值越大，如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少97%或至少99%的与主序列(即有登录号的序列或其它的序列)相同的序列，同时具有主序列的活性。在一些例子中，主序列比天然序列具有更高的活性，而在另一些例子中，主序列活性较低。进行短肽序列比对(小于约30个氨基酸)，采用Blast2序列功能完成比对，通过PAM30矩阵设置系统默认参数(开放间隔值9，延伸空位罚分为I)。采用该方法进行评估，蛋白与参考序列的同源性越高，序列同一性百分数值越大，如至少60%，70%,75%，80%,85%，90%，95%，98%，99%的序列同一性。对非全长的序列进行比对时，10-20个氨基酸的序列同源性为至少75%的序列同一性,序列同一性取决于和参考序列的同一性，为至少85%,90%,95%或98%。评价短序列同一性的方法参见NCBI网站。由于遗传密码的退化机制，不具有高度同一性的核酸序列编码相同的或相似的(保守的)氨基酸序列。利用这一退化机制，使得核酸序列发生变化产生出大量的核酸分子，所有的这些核酸分子编码相同的蛋白。这类同源的核酸序列为，例如，具有至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少98%或至少99%的与主序列(即有登录号的序列或其它的序列)相同的序列。本领域的技术人员应当以这些相同序列的范围值仅作为指导；落在此范围外的，其序列可能具有同源性。转化细胞(Transformedcell):利用诸如生物技术导入核酸分子的细胞,如琥拍酰辅酶A高丝氨酸酰基转移酶或高半胱氨酸合酶的核酸分子。转化指所有的可以将核酸分子导入细胞中的技术，包括但不限于病毒载体的转染，接合，质粒转化，以及通过电穿孔，脂质体转化和基因枪的方法将裸DNA导入。转硫活性(Transsulfurationactivity):通过中间产物胱硫醚产生甲硫氨酸或SAMe的活性。具有这种活性的肽包括胱硫醚Y合酶(EC2.5.I.48)和胱硫醚β裂解酶(EC4.4.I.8)，这些肽分别由基因metB和metC编码。任何结合了胱硫醚Y合酶(EC2.5.I.48)和胱硫醚β裂解酶(EC4.4.1.8)的肽，能够使微生物具有转硫活性。允许产物生产的条件(Underconditionsthatpermitproductproduction)任何使微生物能够产生所需产物，如甲硫氨酸或SAMe产物的发酵条件。这些条件通常包括温度、通气和培养基。培养基可以是肉汤培养基或凝胶培养基。一般地，培养基包括碳源，如葡萄糖、果糖、纤维素或其它的能够被微生物直接利用的物质，或用于培养基中促进碳源利用的酶。为确定培养条件是否可以生成产物，将微生物培养24、36或48小时后取样。例如，为检测甲硫氨酸或SAMe的存在，采用了实施例中提供的检验方法。载体(Vector):用以将核酸分子导入到细胞中，由此形成转化细胞。载体含有能够允许其在细胞中复制的核酸序列，如复制起点。载体还含有一个或多个选择性标记基因以及本领域已知的其它遗传要素。发明详述I.甲硫氨酸生产途径如图I所示，可采用多种生物合成途径来制备甲硫氨酸或其中间产物，如天冬氨酰磷酸(aspartylphosphate)、天冬氨酸半醒、高丝氨酸、O-琥拍酰高丝氨酸(OSHS)、O-乙酰高丝氨酸(OAHS)、胱硫醚、高半胱氨酸、甲硫氨酸，以及S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)。为了达到本发明的目的，根据其内容，中间产物可被认为是反应物或产物。例如，当讨论利用天冬氨酸激酶将天冬氨酸转化为天冬氨酰磷酸时，天冬氨酸为反应物，而天冬氨酰磷酸为产物。同理，当说明书描述采用天冬氨酸半醛脱氢酶将天冬氨酰磷酸转化为天冬氨酸半醛时，天冬氨酰磷酸为反应物，天冬氨酸半醛为产物。本领域的普通技术人员可以理解图I所示的多种生物合成途径，因为在提供的每种酶族中都有多种酶能够用于将反应物转化为产物，从而构成途径。此外，这些反应可在体内或体外，或通过体内反应和体外反应的结合进行，诸如体外反应，包括非酶化学反应。在途径中，也可通过包括将中间产物作为发酵进料，为宿主微生物提供中间产物。这样，如果生物合成途径制备的特定中间产物的量少于所需量，就可以将该中间产物添加到进料中。在连续发酵设备和间歇发酵设备中，这种方式都可以实现。本领域的普通技术人员可以认识到生产宿主可利用除葡萄糖以外的碳源。备选的碳源包括诸如蔗糖、果糖、纤维素、半纤维素、淀粉或甘油。当使用备选的碳源时，需要包括在发酵介质中转化碳源的酶。A.葡萄糖转化为天冬氨酸微生物通常以葡萄糖制备天冬氨酸，本领域的普通技术人员可以理解，有很多提高生产菌株中天冬氨酸浓度的方法。例如，提高丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的表达，改变乙醒酸支路(glyoxylateshunt)或排除消耗丙酮酸生成其它产物,如乙酸盐或乙醇。此外，可将天冬氨酸包括在发酵进料中，在甲硫氨酸的生物合成途径中用作反应物，由微生物吸收。天冬氨酸也可在赖氨酸、苏氨酸和天冬酰胺酸生物合成途径中作为中间产物。因此，有必要减毒或去除(敲除)这些途径，从而使更多的天冬氨酸被用于甲硫氨酸生产途径中。B.天冬氨酸转化为天冬氨酰磷酸生产宿主可采用公知的多肽构建，以生产天冬氨酰磷酸或过度生产天冬氨酰磷酸。如可采用W004069996A2公开的反馈抑制天冬氨酸激酶替代内源性天冬氨酸激酶或与内源性天冬氨酸激酶共存。本发明中采用的天冬氨酸激酶包括EC(EnzymeClassificationnumbers酶分类号)2.7.2.4的肽，以及其它能够将天冬氨酸催化为天冬氨酰磷酸的肽。此外，本领域普通技术人员可以理解，一些天冬氨酸激酶肽也可催化其它反应，例如一些天冬氨酸激酶肽还可接受除天冬氨酸以外的其它底物。因此也包括这种非特异天冬氨酸激酶肽。天冬氨酸激酶序列是公众可获得的。如GenBank登录号NZ_AAVY01000022、NC_006958和NZ_AAffffO1000055公开了天冬氨酸激酶核酸序列；GenBank登录号NP_418448、NP_599504和ZP_01638096公开了天冬氨酸激酶肽序列。确定特定肽的天冬氨酸激酶活性特征的分析法是本领域公知的。如，由Cohen,GN(MethodsinEnzymology,113:596:600,1985)描述的分析法可用于确定特异肽的活性特征。C.天冬氨酰磷酸转化为天冬氨酸半醛生产宿主可采用公知的多肽构建，以生产天冬氨酸半醛，或过度生产天冬氨酸半醛。在甲硫氨酸生物合成途径中提高产物产量的一种方法是通过过表达或表达更高活性形式的天冬氨酸半醛脱氢酶。本发明中采用的天冬氨酸半醛脱氢酶包括天冬氨酸半醛脱氢酶多肽(EC1.2.I.11)，以及其它能够将天冬氨酰磷酸催化为天冬氨酸半醛的肽。此外，本领域普通技术人员可以理解，一些天冬氨酸半醛脱氢酶肽也可催化其它反应。例如一些天冬氨酸半醛脱氢酶肽还可接受除天冬氨酰磷酸以外的其它底物，因此也包括这种非特异天冬氨酸半醛脱氢酶肽。天冬氨酸半醛脱氢酶序列是公众可获得的。如GenBank登录号NC_006958、NZ_AAVY01000015和NZ_AAWW01000010公开了天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸序列；GenBank登录号NP_417891、NP_599505和ZP_0164))72公开了天冬氨酸半醛脱氢酶肽序列。确定特定肽的天冬氨酸半醛脱氢酶活性特征的分析法是本领域公知的。如，由Cohen，GN(MethodsinEnzymology,113:600-602,1985)描述的分析法可用于确定特异肽的活性特征。D.天冬氨酸半醛转化为高丝氨酸生产宿主可采用公知的多肽构建，以生产高丝氨酸，或过度生产高丝氨酸。在甲硫氨酸生物合成途径中提高产物产量的一种方法是通过过表达或表达更高活性形式的天冬氨酸半醛脱氢酶。本发明中采用的高丝氨酸脱氢酶包括高丝氨酸脱氢酶肽(EC1.I.I.3)，以及其它能够将天冬氨酸半醛催化为高丝氨酸的肽。此外，本领域普通技术人员可以理解，一些高丝氨酸脱氢酶多肽也可催化其它反应，如一些高丝氨酸脱氢酶肽还可接受除天冬氨酸半醛以外的其它底物。因此也包括这种非特异高丝氨酸脱氢酶肽。高丝氨酸脱氢酶肽序列是公众可获得的。如GenBank登录号NC_006958、NZ_AAVY01000013和NZ_AAWW01000033公开了高丝氨酸脱氢酶核酸序列；GenBank登录号NP_414543、ZP_01639819和NP_600409公开了高丝氨酸脱氢酶肽序列。确定特定肽的高丝氨酸脱氢酶活性特征的分析法是本领域公知的。如，由Patte.等(Biochem.Biophys.Acta128:426-439,1966)描述的分析法可用于确定特异肽的活性特征。E.高丝氨酸转化为O-琥珀酰高丝氨酸(OSHS)生产宿主可采用公知的多肽构建，以生产O-琥珀酰高丝氨酸(OSHS)，或过度生产0SHS。在甲硫氨酸生物合成途径中提高产物产量的一种方法是通过过表达或表达更高活性形式的高丝氨酸O-琥拍酰转移酶(homoserine0-succinyItransferase)肽或采用高丝氨酸O-琥珀酰转移酶肽的反馈抑制不敏感形式。本发明中采用的琥珀酰辅酶A高丝氨酸酰基转移酶包括高丝氨酸O-琥珀酰转移酶肽(EC2.3.I.46)，以及其它能够将高丝氨酸催化为OSHS的肽。此外，本领域普通技术人员可以理解，一些高丝氨酸O-琥珀酰转移酶肽也可催化其它反应，如一些琥珀酰辅酶A-高丝氨酸酰基转移酶肽还可接受除高丝氨酸以外的其它底物。因此也包括这种非特异琥珀酰辅酶A-高丝氨酸酰基转移酶肽。高丝氨酸O-琥珀酰转移酶肽序列是公众可获得的。如GenBank登录号NZ_AAWW01000055公开了高丝氨酸O-琥珀酰转移酶核酸序列；GenBank登录号AAC76983公开了高丝氨酸O-琥珀酰转移酶肽序列。确定琥珀酰辅酶A-高丝氨酸酰基转移酶的活性特征的分析法是本领域公知的。如，由Lawrence(J.Bacteriol.,109:8-11,1972)描述的分析法可用于确定特异肽的活性特征。基因编码的琥珀酰辅酶A-高丝氨酸酰基转移酶肽在本发明中是指metA。E.高丝氨酸转化为O-乙酰高丝氨酸(OAHS)生产宿主可采用公知的多肽构建，以生产O-乙酰高丝氨酸(OAHS)，或过度生产0AHS。在甲硫氨酸生物合成途径中提高产物产量的一种方法是通过过表达或表达更高活性形式的高丝氨酸O-乙酰转移酶肽(EC2.3.1.31)。本发明中采用的高丝氨酸O-乙酰转移酶包括高丝氨酸O-乙酰转移酶肽(EC2.3.I.31)，以及其它能够催化为OAHS的肽。此外，本领域普通技术人员可以理解，一些高丝氨酸O-乙酰转移酶肽也可催化其它反应，如一些高丝氨酸O-乙酰转移酶肽还可接受除高丝氨酸以外的其它底物。因此也包括这种非特异高丝氨酸O-乙酰转移酶肽。高丝氨酸O-乙酰转移肽序列是公众可获得的。如GenBank登录号Y10744区域2822..3961、NZ_AAAH02000004区域:166057.·167193，以及NZ_AAAY02000081区域:补体(11535.·12605)公开了高丝氨酸O-乙酰转移酶核酸序列；GenBank登录号CAA71733、ZP_00766367和ZP_00107218公开了高丝氨酸O-乙酰转移酶肽序列。确定特定肽的高丝氨酸脱氢酶活性特征的分析法是本领域公知的。如，由Lawrence(J.Bacteriol.,109:8-11,1972)描述的分析法可用于确定特异肽的活性特征。基因编码的高丝氨酸O-乙酰转移酶肽在本发明中是指metX。G.疏基化通过定向巯基化途径，以高半胱氨酸合酶(homocysteinesynthaseenzyme)完成高半胱氨酸的生产，其中一些酶釆用OSHS为底物，一些酶釆用OAHS为底物。此外，有些酶釆用OSHS或OAHS为底物。I.O-琥珀酰高丝氨酸(OSHS)转化为高半胱氨酸生产宿主可采用公知的多肽构建，以生产高半胱氨酸，或过度生产高半胱氨酸。在甲硫氨酸生物合成途径中提高产物产量的一种方法是通过过表达或表达更高活性形式的高半胱氨酸合酶肽(EC4.2.99.-)。本发明中采用的高半胱氨酸合酶包括高半胱氨酸合酶肽(EC4.2.99.-)，以及其它能够将O-琥珀酰高丝氨酸(OSHS)催化为高半胱氨酸的肽。OSHS通过与硫化物反应转化为高半胱氨酸在本发明中是指定向巯基化。此外，本领域普通技术人员可以理解，一些高半胱氨酸合酶肽也可催化其它反应，如一些高半胱氨酸合酶肽还可接受除OSHS以外的其它底物。因此也包括这种非特异高半胱氨酸合酶肽。高半胱氨酸合酶肽序列是公众可获得的。如GenBank登录号AE004091公开了高半胱氨酸合酶(O-琥珀酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶)核酸序列；GenBank登录号AAG06495公开了高半胱氨酸合酶(O-琥拍酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶)氨基酸序列。确定特定肽的高半胱氨酸合酶活性特征的分析法是本领域公知的。如，由Yamagata(MethodsinEnzymology,143:478,1987)描述的分析法,采用适当的底物，可用于确定特异肽的活性特征。基因编码的高半胱氨酸合酶肽在本发明中是指metZ。2.O-乙酰高丝氨酸(OAHS)转化为高半胱氨酸生产宿主可采用公知的多肽构建，以生产高半胱氨酸，或过表达高半胱氨酸。在甲硫氨酸生物合成途径中提高产物产量的一种方法是通过过表达或表达更高活性形式的高半胱氨酸合酶肽(EC2.5.I.49)。本发明中采用的高半胱氨酸合酶包括高半胱氨酸合酶肽(EC2.5.I.49)，以及其它能够将O-琥珀酰高丝氨酸(OAHS)催化为高半胱氨酸的肽。OAHS通过与硫化物反应转化为高半胱氨酸在本发明中是指定向巯基化。此外，本领域普通技术人员可以理解，一些高半胱氨酸合酶肽也可催化其它反应，如一些高半胱氨酸合酶肽还可接受除OSHS以外的其它底物，如实施例2提及的高半胱氨酸合酶，就可以选择OSHS或OAHS作为底物，因此也包括这种非特异高半胱氨酸合酶肽。高半胱氨酸合酶肽序列是公众可获得的。如GenBank登录号AE004091区域:5655648.·5656925、Y10744区域:1485.·2813、NZ_AAAHO2000004区域164536.·165990以及NZ_AAAY02000081区域:补体(12750.·14054)公开了高半胱氨酸合酶(O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶)核酸序列；GenBank登录号AAG08410、CAA71732、ZP_00766366和ZP_00107219公开了高半胱氨酸合酶(O-乙酰-高丝氨酸硫化氢解酶)氨基酸序列。确定特定肽的高半胱氨酸合酶活性特征的分析法是本领域公知的。如，由Yamagata(MethodsinEnzymology,143:478,1987)描述的分析法,采用适当的底物,用于确定特异肽的活性特征。基因编码的高半胱氨酸合酶肽在本发明中是指metY。H.转硫作用I.O-琥珀酰高丝氨酸(OSHS)或乙酰高丝氨酸(OAHS)转化为胱硫醚生产宿主可采用公知的多肽构建，以生产胱硫醚，或过度生产胱硫醚。在甲硫氨酸生物合成途径中提高产物产量的一种方法是通过过表达或表达更高活性形式的胱硫醚Y-合酶肽(EC2.5.I.48)。本发明中采用的胱硫醚Y-合酶包括胱硫醚Y-合酶肽(EC2.5.I.48)，以及其它能够将OSHS或OAHS催化为胱硫醚的肽。此外，本领域普通技术人员可以理解，一些胱硫醚Y-合酶肽也可催化其它反应，如一些胱硫醚Y-合酶肽还可接受除OSHS或OAHS以外的其它底物，因此也包括这种非特异胱硫醚Y-合酶肽。胱硫醚Y-合酶肽序列是公众可获得的。如GenBank登录号NC_006958、NZ_AAWW01000006和NC_004129公开了胱硫醚Y-合酶核酸序列；GenBank登录号NP_418374、YP_348978和NP_601979公开了胱硫醚Y-合酶肽序列。确定特定肽的胱硫醚Y-合酶活性特征的分析法是本领域公知的。如，MethodsinEnzymology,17:425-433,1971描述的分析法,可用于确定特异肽的活性特征。基因编码的胱硫醚Y-合酶肽在本发明中是指metB。2.胱硫醚转化为高半胱氨酸生产宿主可采用公知的多肽构建，以生产高半胱氨酸，或过度生产高半胱氨酸。在甲硫氨酸生物合成途径中提高产物产量的一种方法是通过过表达或表达更高活性形式的胱硫醚β-裂解酶肽(EC4.4.I.8)。本发明中采用的胱硫醚β-裂解酶包括胱硫醚β-裂解酶肽(EC4.4.I.8)，以及其它能够将胱硫醚催化为高半胱氨酸的肽。此外，本领域普通技术人员可以理解，一些胱硫醚裂解酶肽也可催化其它反应，如一些胱硫醚裂解酶肽还可接受除胱硫醚以外的其它底物，因此也包括这种非特异胱硫醚β_裂解酶肽。胱硫醚β_裂解酶肽序列是公众可获得的。如GenBank登录号NZ_AAffffO1000001、NC_006958和NZ_AAVY01000004公开了胱硫醚β-裂解酶核酸序列；GenBank登录号NP_746463、YP_226552和NP_417481公开了胱硫醚β-裂解酶肽序列。确定特定肽的胱硫醚β_裂解酶活性特征的分析法是本领域公知的。如,MethodsinEnzymology,143:483-486,1987描述的分析法可用于确定特异肽的活性特征。基因编码的胱硫醚裂解酶肽在本发明中是指metC。I.高半胱氨酸转化为甲硫氨酸生产宿主可采用公知的多肽构建，以生产甲硫氨酸，或过度生产甲硫氨酸。在甲硫氨酸生物合成途径中提高产物，如甲硫氨酸或SAMe产量的一种方法是通过过表达或表达更高活性形式的高半胱氨酸甲基酶肽(homocysteinemethlyasepeptide)(EC2.I.I.14和2.I.I.13)。本发明中采用的高半胱氨酸甲基酶包括高半胱氨酸甲基酶肽(EC2.I.I.14和2.I.I.13)，以及其它能够将高半胱氨酸催化为甲硫氨酸的肽。此外，本领域普通技术人员可以理解，一些高半胱氨酸甲基酶肽也可催化其它反应，如一些高半胱氨酸甲基酶肽还可接受除高半胱氨酸以外的其它底物。因此也包括这种非特异高半胱氨酸甲基酶肽。高半胱氨酸甲基酶肽序列是公众可获得的。如GenBank登录号NC_004129、NC_006958和NC_000913公开了高半胱氨酸甲基酶核酸序列；GenBank登录号AP_004520、YP_225791和CAK16133公开了高半胱氨酸甲基酶肽序列。确定特定肽的高半胱氨酸甲基酶活性特征的分析法是本领域公知的。如,AnalyticalBiochemistry,228,323-329,1995描述的分析法，可用于确定特异肽的活性特征。基因编码的高半胱氨酸甲基酶肽在本发明中是指metH或metEοJ.甲硫氨酸转化为S-腺苷甲硫氨酸生产宿主可采用公知的多肽构建，以生产S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)，或过度生产SAMe。在甲硫氨酸生物合成途径中提高产物产量的一种方法是通过过表达或表达更高活性形式的甲硫氨酸腺苷转移酶肽(methionineadenosyItransferasepeptides)(EC2.2.I.6)。本领域普通技术人员可以理解，当甲硫氨酸是所需产物时，需要减毒由metK编码的甲硫氨酸腺苷转移酶肽(EC2.2.1.6)的活性或表达。本发明中采用的甲硫氨酸腺苷转移酶包括甲硫氨酸腺苷转移酶肽(EC2.2.1.6)，以及其它能够将甲硫氨酸催化为SAMe的肽。此外，本领域普通技术人员可以理解，一些甲硫氨酸腺苷转移酶肽也可催化其它反应，如一些甲硫氨酸腺苷转移酶肽还可接受除甲硫氨酸以外的其它底物。因此也包括这种非特异甲硫氨酸腺苷转移酶肽。甲硫氨酸腺苷转移酶肽序列是公众可获得的。如GenBank登录号NC_002516、NC_006958和NC_000913公开了甲硫氨酸腺苷转移酶核酸序列；GenBank登录号NP_747070、CAI37180和NP_600817公开了甲硫氨酸腺苷转移酶肽序列。确定特定肽的甲硫氨酸腺苷转移酶活性特征的分析法是本领域公知的。如,MethodsinEnzymology,94:219-222,1983描述的分析法,可用于确定特异肽的活性特征。基因编码的甲硫氨酸腺苷转移酶肽在本发明中是指metK。II.将生产菌株基因工程化以提高甲硫氨酸的产量天冬氨酸的产量可采用本领域公知的任何方法提高。例如，天冬氨酸的产量可采用几种不同的方式，通过提高由细胞产出的草酰乙酸的产量来提高天冬氨酸的产量。(Gokarn等,Appl.Microbiol.Biotechnol.,56:188-95,2001;Sanchez等,MetabolicEng.,8:209-226,2006)。产物的产量也可通过过表达L-甲硫氨酸生物合成途径中的各种基因来提高。例如，可将诸如metA、metB、metC、metE和metH,以及cysD、cysN、cysC、cysH、cysI、cysJ、cysK和cysM的基因设置在各种启动子的控制之下，以提高所生产的酶的量。metA基因编码高丝氨酸琥珀酰转移酶，该酶是以高丝氨酸进行甲硫氨酸生物合成途径的第一种酶，是甲硫氨酸生产的调控点。metA蛋白是温度敏感性蛋白，具有186个氨基酸残基，计算分子量为35.7kDa。由终产物，甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸抑制metA活性是公知的(Lee等，J.Biol.Chem.241:5479-5780，1966)。这两种产物的反馈抑制具有协同作用，即低浓度的甲硫氨酸单独只具有轻微抑制作用，而组合后具有强效抑制作用。因此，生产菌株能够从反馈抑制抵抗剂metA活性中受益。在甲硫氨酸生产菌株中，另一种能够减毒或去除的基因是metj。metj编码的肽调控甲硫氨酸生物合成途径中几个基因的表达。metj编码的蛋白连接在S-腺苷甲硫氨酸上，并阻抑metA、metC和metF基因。由metF基因编码的蛋白，5，10_亚甲基四氢叶酸还原酶(methyIenetetrahydrofοlatereductase)参与N(5)-亚甲基四氢叶酸的合成，后者为高半胱氨酸生产L-甲硫氨酸的甲基供体(Sheppard等，J.Bacteriol.181:718-25,1999)。US2002/0049305公开了可通过提高棒状菌(Corynebacteria)中5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(metF)的表达来改进L-甲硫氨酸的生产。因此，本发明中所述的工程化的微生物也可经工程化以提高metF的产量。metK基因的调控也可提高甲硫氨酸和SAMe的产量，在所有有机体中，S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)是主要的甲基供体,参与多胺生物合成(polyaminebiosynthesis)。SAMe也是甲硫氨酸腺苷转移酶(methionineadenosyItransferase)(MAT或MetK,EC2.5.I.6)。MetK催化唯一公知的SAMe生物合成途径。完整的三聚磷酸盐链从ATP断开，形成锍(suIfonium)化合物。SAMe的形成降低了甲硫氨酸的浓度，减毒了通过MetA反馈抑制的甲硫氨酸生物合成途径的活性。因此，metK的功能性缺失或减毒可提高甲硫氨酸的生产。本领域的普通技术人员可以理解，任何制备甲硫氨酸的细胞利用硫的效率是非常重要的，尤其是对在硫同化过程中利用磷酸腺苷酰硫酸(phosphoadenylylsulfate(PAPS))作为中间产物的微生物，因为制备PAPS需要消耗I摩尔ATP。硫酸盐相当不活跃，为了能被细胞利用，必须首先将其转化为更活跃的形式。在大肠杆菌(E.coli)中，通过胞质输运系统，其由三个细胞质膜成分和位于胞质中的底物特异性结合蛋白组成，将硫酸盐吸收进细胞。硫酸盐渗透酶的三个膜成分由cysT、cysW和cySA(cysA基因座)基因编码。调控cysA基因座的产物，使其与其他硫-同化途径一致，作为cys调节子的一部分。然后通过连接到核苷激活硫酸盐，以通过与大多数有机体相似的途径得到高能核苷磷酰硫酸。如图6所示，微生物，如大肠杆菌利用将硫酸盐转化为腺苷酰硫酸(adenylylsulfate(APS))的途径，其通过利用硫酰酶肽(sulfateadenylyltransferasepeptide)(EC2.7.7.4，由cysNcysD编码)。然后APS通过APS激酶(EC2.7.I.25由cysC编码)转化为PAPS。此步骤需要一个ATP。PAPS通过PAPS还原酶(ECI.8.4.8，由cysH编码)转化为亚硫酸盐，随后亚硫酸盐通过NADPH-亚硫酸盐还原酶(EC1.8.I.2，由cysIcysJcysG编码)转化为硫化物。备选的途径如图6右侧所示,采用腺苷酰硫酸还原酶(EC1.8.99.2或1.8.4.9)将APS直接转化为亚硫酸盐。本领域的普通技术人员可以理解，任何可将APS转化为亚硫酸盐的腺苷酰硫酸还原酶都可以使用。例如，源于枯草杆菌(Bacillussubtilis,登录号CAA04409)或铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,登录号NP_250447)的腺苷酰硫酸还原酶。编码核酸序列的腺苷酰硫酸还原酶可被引入任何用于生产甲硫氨酸的微生物中。例如，本发明中描述的菌株，以及由MetabolicExplorer在W02005/108561和W02006138689中描述的菌株，以及由Kumar和Gomes在(BiotechnologyAdvances23:41-61,2005)描述的菌株都可以受益于本发明中公开的省略PAPS的途径，从而在硫酸同化中少需要一个ATP分子。具体实施例方式实施例I.甲硫氨酸生产的多途径之一，采用外源性表达的核酸序列利用定向巯基化。A.同时具有metABC(转硫作用)和metAZ(定向巯基化)的微生物的构建如前所述，主要通过转硫反应产生大肠杆菌中甲硫氨酸的内源性产物。本实施例描述了大肠杆菌的工程化以增加定向巯基化，同时也保留了内源性metAZ途径。通过克隆O-琥拍酰硫化氢解酶(O-succinylsulfhydrylase)(EC4.2.99.-)(其通过与硫化氢反应可将O-琥珀酰高丝氨酸转化成高半胱氨酸)增加定向巯基化。这种酶由metZ编码，并可在一些假单胞菌属(Pseudomonasspecies)中找到(Vermeij和Kertesz,JBacteriol.181:5833-5837，1999以及Inoue等，J.Bacteriol.179:3956-3962，1997)。更具体地说，来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的metZ被克隆为菌株TF4076BJF的甲硫氨酸营养缺陷型，该菌株由苏氨酸生产菌株TF4076产生，(下面的实施例3中进一步描述了由thrB和metj的缺失形成的其他修饰，以及在pTrc启动子的控制下metF的插入)。这些营养缺陷型具有metB基因缺失,或metB和metC基因缺失。来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的metZ增强了metB和metBC缺失突变体在基本培养基中的生长。如表I所示，即使在烧瓶培养中甲硫氨酸生产没有完全恢复，metZ表达还是诱导了metBC缺失突变体中高达100mg/L的甲硫氨酸生产。这表明metZ负责细胞中高半胱氨酸的生产。由metZ转化的缺失突变体的甲硫氨酸的低产量可能是由于受到了细胞内成分中硫化物的限制(下面提供了增加硫化物浓度的方法)。由metZ转化的metBC缺失突变体的生长在2mM硫化钠的存在下在M9培养基中增强的发现支持了这种说法。在体外分析中，O-琥珀酰硫化氢解酶具有低硫化物亲和力。通过定向进化，有可能发展成具有更高硫化物亲和力和更高活性的改良的O-琥珀酰硫化氢解酶。在甲硫氨酸途径中，高活性O-琥珀酰硫化氢解酶可以替代metB和metC，或者可以补助该途径，增加甲硫氨酸的碳通量(carbonflux)。表ITF4076BFJ-BC的生长互补和甲硫氨酸生产n广葡萄糖用量甲琉敦酸中间产4l(mgi)GA和HS(g/L)TF4076BJF-BCOD--=—1--1~s--__(g/L)OSHmetHSGA空栽体2310Λ3867OJ0:0IpCL-meiR20,938.1OJ0.0OJ—[—0:2—pCL-mefB-metC9.740.0OJ6704362ΛpPm-metZ13.040.00.01013.1[4.3pCL-metBpCL1920中metB与其自己的启动子pCL-metB-metCpCL1920中metB和metC与它们自己的启动子pPro-Z:pProLar载体(ClonTech)中来自铜绿假单胞菌的metZB.同时具有metABC(转硫作用)和metXZ(定向巯基化)的微生物的构建本实施例显示了在大肠杆菌中，以两种途径同时进行甲硫氨酸生产。第一种途径是内源性metABC途径，第二种途径允许通过来自不同有机体的metY和metX的表达进行定向疏基化。如图I所示,大肠杆菌利用转硫作用途径基因metA、metB和metC并通过0SHS,内源性地生产甲硫氨酸。通过采用向大肠杆菌中克隆和表达基因metX和metY的基因工程，向大肠杆菌添加其他途径，其产生了同时通过转硫作用和定向巯基化制备甲硫氨酸的宿主有机体。以下描述了从钩端螺旋体菌(Leptospirameyeri)、抗福射菌(Deinococcusradiodurans)、澄色绿屈接菌(Chloroflexusaurantiacus)、扩展短杆菌(Brevibacteriumlinens)、念珠藻(Nostocpunctiforme)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)DNA中克隆用于构建异源性途径的metX和metY基因，构建了几种不同的菌株来分析添加这些基因对甲硫氨酸生产的影响。还克隆并检测了来自谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)和啤酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)的高半胱氨酸合酶。证明了这两种途径同时发生，这种添加改善了甲硫氨酸生产。为了评价钩端螺旋体菌metX和metY酶是否能辅助大肠杆菌甲硫氨酸营养缺陷型的生长，将钩端螺旋体菌metYX基因菌群从质粒metXY-pCR2.O-TOPO中扩大，并克隆到pPRO-Nde-del载体中。在该质粒中metYX因的转录由位于载体上的lac/ara启动子启动。评价了包括W3110ΛmetA(停止OSHS的生成)、TF4076BJF(增加高丝氨酸生产)、TF4076BJFΔmetA(停止OSHS的生成)和TF4076BJFΔmetAmetB(停止OSHS和来自OAHS或OSHS的胱硫醚的生成)在内的四种大肠杆菌菌株。菌株TF4076BJF是苏氨酸营养缺陷型，为生产甲硫氨酸，以增加碳通量到高丝氨酸下调，其中高丝氨酸能够通过大肠杆菌天然途径产生甲硫氨酸。菌株能够分别由克隆载体和含有metYX的质粒转化，然后将转化体划线接种到含有葡萄糖(2g/L)、异亮氨酸(O.15g/L)、苏氨酸(O.3g/L)、卡那霉素(50mg/L)和IPTG的M9基本平板培养基。来自钩端螺旋体菌的metYX基因菌群在24小时内补助W3110ΛmetA的生长。仅表达metX的W3110AmetA菌株在M9基本培养基上不能生长。因此，大肠杆菌W3110缺少利用O-乙酰基-L-高丝氨酸作为前体生物合成甲硫氨酸的有效酶。如W02006113897中所述，菌株W3110AmetA由对照空白载体pPRO-Nde-del转化，在48小时之内没有生长。当由克隆载体或者含有来自钩端螺旋体菌的metYX的质粒转化时，菌株TF4076BJF能够在基本平板培养基上生长。还检测了可选的metYX基因用于基本培养基的生长互补。在从抗辐射菌、橙色绿屈挠菌、扩展短杆菌、念珠藻中克隆metYX基因时，由于缺少与下游基因metX相邻的有效的大肠杆菌核糖体结合位点(rbs),metX基因的翻译与由位于载体上的rbs启动的metY基因的翻译一起进行。来自钩端螺旋体菌、抗辐射菌和橙色绿屈挠菌的metYX基因菌群对于补助甲硫氨酸营养缺陷型菌株的生长是最有效的。在甲硫氨酸营养缺陷型中也观察到了生长互补，其中metY(钩端螺旋体菌)被钩端螺旋体菌metYX基因菌群中的metY(铜绿假单胞菌)替代。这些细胞显示了与表达钩端螺旋体菌metYX的相同甲硫氨酸营养缺陷型有关的降低的生长率。实施例3中描述了利用摇瓶法测定甲硫氨酸的产量。简言之，培养物在补充了150mg/L甲硫氨酸(以改善初始生长)的培养基中在30°C下生长50小时，采用HPLC测定甲硫氨酸。表2显示与那些仅有转硫作用或者定向巯基化相比，在具有两种途径的菌株中甲硫氨酸的产量更高。表2甲硫氨酸产量权利要求1.具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性的的分离多肽，与具有如基因库登录号No.AAC76983所述的氨基酸序列的野生型高丝氨酸0-琥珀酰转移酶多肽相比，其通过L-甲硫氨酸显示对反馈抑制的敏感性降低。2.根据权利要求I所述的分离多肽，其在对应于野生型高丝氨酸0-琥珀酰转移酶多肽的氨基酸24，29，79，114，140，163，222，275，290，291，295，297，304和305的一个或多个氨基酸位置含有突变。3.根据权利要求2所述的分离多肽，其在对应于野生型高丝氨酸0-琥珀酰转移酶多肽的氨基酸163，222和295的一个或多个氨基酸位置含有突变。4.根据权利要求2所述的分离多肽，其在对应于野生型高丝氨酸0-琥珀酰转移酶多肽的氨基酸24，275，297和305的一个或多个氨基酸位置含有突变。5.根据权利要求2所述的分离多肽，其在对应于野生型高丝氨酸0-琥珀酰转移酶多肽的氨基酸290的氨基酸位置含有突变。6.根据权利要求2所述的分离多肽，其在对应于野生型高丝氨酸0-琥珀酰转移酶多肽的氨基酸29，114和140的一个或多个氨基酸位置含有突变。7.根据权利要求2所述的分离多肽，其在对应于野生型高丝氨酸0-琥珀酰转移酶多肽的氨基酸79，140，291和304的一个或多个氨基酸位置含有突变。8.根据权利要求2所述的分离多肽，其中24位的氨基酸苏氨酸被丝氨酸替换；29位的氨基酸丝氨酸被脯氨酸替换；79位的氨基酸天冬酰胺被丝氨酸替换；114位的氨基酸谷氨酸被甘氨酸替换；140位的氨基酸苯丙氨酸被丝氨酸或异亮氨酸替换；163位的氨基酸赖氨酸被谷氨酰胺替换；222位的氨基酸苯丙氨酸被亮氨酸替换；275位的氨基酸丙氨酸被谷氨酸替换；290位的氨基酸天冬酰胺被组氨酸替换；291位的氨基酸酪氨酸被天冬酰胺替换；295位的氨基酸谷氨酰胺被精氨酸替换；297位的氨基酸苏氨酸被丙氨酸替换；和304位的氨基酸甲硫氨酸被亮氨酸替换；以及305位的氨基酸天冬酰胺被酪氨酸替换。9.根据权利要求3所述的分离多肽，其中163位的氨基酸赖氨酸被谷氨酰胺替换；222位的氨基酸苯丙氨酸被亮氨酸替换；以及295位的氨基酸谷氨酰胺被精氨酸替换。10.根据权利要求4所述的分离多肽，其中24位的氨基酸苏氨酸被丝氨酸替换；275位的氨基酸丙氨酸被谷氨酸替换；297位的氨基酸苏氨酸被丙氨酸替换；以及305位的氨基酸天冬酰胺被酪氨酸替换。11.根据权利要求5所述的分离多肽，其中290位的氨基酸天冬酰胺被组氨酸替换。12.根据权利要求6所述的分离多肽，其中29位的氨基酸丝氨酸被脯氨酸替换；114位的氨基酸谷氨酸被甘氨酸替换；以及140位的氨基酸苯丙氨酸被丝氨酸或异亮氨酸替换。13.根据权利要求I所述的分离多肽，其中79位的氨基酸天冬酰胺被丝氨酸替换；140位的氨基酸苯丙氨酸被丝氨酸或异亮氨酸替换；291位的氨基酸酪氨酸被天冬酰胺替换；以及304位的氨基酸甲硫氨酸被亮氨酸替换。14.根据权利要求I所述的分离多肽，其包含选自SEQIDNO:2，4，6，8和10的氨基酸序列。15.编码权利要求I所述的分离多肽的分离核苷酸。16.根据权利要求15所述的分离核苷酸，其含有选自SEQIDN0:l，3，5，7和9的核苷酸序列。17.含有权利要求15所述的分离核苷酸的质粒。18.用权利要求17所述质粒转化的微生物菌株。19.制备L-甲硫氨酸的方法，其包括在允许L-甲硫氨酸产生的条件下培养根据权利要求18所述的微生物；以及分离产生L-甲硫氨酸。全文摘要本发明公开了一种以内源基因的转硫途径，同时以外源基因的定向巯基化途径生产甲硫氨酸和相关产物的微生物；还公开了这些新型基因可用于甲硫氨酸和SAMe的生产。文档编号C12N1/21GK102703398SQ20121014454公开日2012年10月3日申请日期2007年4月11日优先权日2007年4月11日发明者严惠媛,布莱恩·布鲁泽,张眞淑,牛伟,申容旭,费尔南多·A·桑切斯-列拉,赵光命,赵英郁,金素影,霍利·J·杰森,默文·德苏泽申请人:Cj第一制糖株式会社