专利名称：差异保护的正交羊毛硫氨酸技术的制作方法
差异保护的正交羊毛硫氨酸技术优先权本申请要求保护于2009年3月28日提交的美国专利申请序列号12/413，551的优先权，其整体内容在此引作参考。背景发明抗生素的发展，彻底改变了二十世纪后五十年的医学实践。这一期间传染病引起的死亡率明显降低。Armstrong等(1999)PAMA. 281，61-66。然而，自1982年开始，源自传染病的死亡伴随着耐受抗生素病原体的增加稳定上升。医学上重要的多种细菌对常用于治疗临床感染的抗生素的抵抗能力越来越强。在过去的二十年间文献中出现数以千计的记录这一现象的报告和书籍。Armstrong 等(1999)PAMA. 281，61-66 ；Dessen 等(2001) Curr. Drug Targets Infect. Disord. 1,11-16 ；Rapp(2000)Surg Infect(Larchmt). 1,39-47 ； Benin&Dowell(2001)Antibiotic resistance and implications for the appropriate use of antimicrobial agents, Humana Press, Totowa, NJ0尽管需要教导更适当地使用抗生素，但更重要的是有必要开发新抗生素。认为万古霉素是抵抗多种严重细菌感染的最后防御线。病原细菌的耐万古霉素菌株的发现让人担忧，这预示着多药耐药性病原体的出现，所述病原体用现有的药物不能治疗。可怕的是，除非马上开发出新的抗生素，否则我们将事实上回到了抗生素之前的时代。有一种结构新颖的小抗生素类别叫做羊毛硫抗生素(I类细菌素)，基于化学与生物合成的不同其可以被分为5个亚类A(I)型、A(II)型、B型、双组分者和结构未知者。 已经知道该类别抗生素数十年，但却一直没有对其治疗感染性疾病的潜在效用进行广泛试验，尽管业已知道许多羊毛硫抗生素既有效又有广谱活性，特别对革兰氏阳性菌类。出现以上问题的主要原因通常难以获得能够对其进行测试并商业化的足够成本效益量的这些分子。乳链菌肽A(
图1)提供了羊毛硫抗生素以及与羊毛硫抗生素相关的化学复杂性的数量和类型的良好实例。羊毛硫抗生素富含含硫氨基酸羊毛硫氨酸(Lan，ala-S-ala)，经常为3-甲基-羊毛硫氨酸(MeLan，abu-S-ala)。Lan由丙氨酸残基组成，所述丙氨酸残基通过硫醚桥连接产生环状结构，该结构对于其生物活性至关重要。典型在羊毛硫抗生素上有3-5个这样的环，且经常这些环中很多互相之间重叠。认为Lan和MeLan总是具有内消旋立体化学结构。除了 Lan和MeLan残基之外，还可能有翻译后修饰的氨基酸(图2)存在于羊毛硫抗生素中，例如2，3-5脱氢丙氨酸(Dha)、2，3 二脱氢氨基丁酸(Dhb)、不饱和羊毛硫氨酸衍生物如S-氨基乙烯基-D-半胱氨酸(AviCys)和S-氨基-D-甲基半胱氨酸以及 D-丙氨酸、2-氧代丙酰、2-氧代丁酰和羟基丙酰残基。对于在乳链菌肽A的情况而言，由 Lan和MeLan形成的环状结构可以重叠(例如环D和环E)，这进一步增加了分子的复杂性。革兰氏阳性细菌负责生物合成已知的羊毛硫抗生素。它们用对核糖体合成的前肽原(preprop印tide)起作用的系列序贯酶促步骤制备成熟的分子。负责编码修饰酶的基因通常簇集在8-10Kb DNA片段上，该片段可位于染色体上、质粒上或作为转座子的一部分。 在A(I)型羊毛硫抗生素中，在由IanA基因编码的核糖体上合成的前肽中的所有丝氨酸和苏氨酸残基，都通过由IanB基因编码的酶脱水，这些脱水氨基酸参与与位于更接近分子的羧基端的相邻半胱氨酸残基形成硫醚键。这一反应由IanC基因表达的蛋白催化。在某些羊毛硫抗生素情形中，例如在表皮素和变异菌肽1140中，C-末端半胱氨酸由IanD基因表达的酶脱羧基，转变成S-氨基乙烯基-D-半胱氨酸。随后由IanT基因的产物转运出细胞， 然后由IanP编码的细胞外蛋白酶裂解经修饰的前肽原的前导序列，产生成熟的抗生素。Ra 等(1996)Microbiology-Uk. 142,1281-1288 ；Kupke&Gotz(1996)Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology. 69,139—150 ；Kuipers 等(1996)Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology. 69,161-169。研究羊毛硫抗生素在治疗应用中的潜在效用的尝试，一直受到难于获得足够量或足够纯度的羊毛硫抗生素的阻碍。到今天为止已表征的约40种羊毛硫抗生素(Chatterjee 等(2005)Chemical Reviews. 105,633683)中，只有由乳链球菌(Str印tococcus lactis) 产生的A(I)型羊毛硫抗生素乳链菌肽A实现了商品量制备，在过去50年中其作为食品防腐剂被广泛应用。乳链菌肽A的长时间广泛应用没有出现明显抗性(DelvesBroughton等 (1996)Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology. 69，193-202)，这强烈促进开发另外的羊毛硫抗生素用于不同应用。用经过多年优化的发酵工艺进行乳链菌肽A的大规模生产。最近申请了乳链菌肽 A的纯化方案的美国专利(USPA 2004/0072333)。该方案使用了昂贵的蛋白酶混合物，随后使用柱色谱。然而，尚没有公开的商业上切实可行的乳链菌肽A的纯化程序。这说明目前关注于发现生产用于治疗应用的纯乳链菌肽A和其它羊毛硫抗生素的恰当方法。各种可能选择可用于羊毛硫抗生素的大规模生产。从原料成本观点出发，发酵工艺是无可辩驳的最好方法。目前用于很多羊毛硫抗生素的发酵方法产量为每升微克量级， 其不足以用于药物开发。作为选择，一直在探索在A(I)型羊毛硫抗生素中用羊毛硫抗生素修饰机制进行体夕卜生产。 Kupke&Gotz(1996)Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology. 69,39-150 ；Kuipers 等(1996)Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology. 69， 161-169。负责羊毛硫抗生素前肽原翻译后修饰的酶在无细胞裂解物中或作为纯化实体无 舌个生，LanD if {歹Ij夕卜。Kupke&Gotz (1996) Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology. 69,139-150 ；10 ；Kupke&Gotz(1997) Journal of Biological Chemistry. 272,4759-4762 ；Kupke φ (1992)Journal of Bacteriology. 174,5354—5361 ；Kupke 等(1993)Fems Microbiology Letters. 112,43—48 ； Kupke 等(1995)Journal of Biological Chemistry. 270，11282-11289 ;Kupke 等(1994) Journal of Biological Chemistry. 269，5653-5659。对 A(II)型羊毛硫抗生素而言，最近在Science中报道，体外合成乳链球菌素481是可能的。属于该组和B型羊毛硫抗生素的分子仅用单一多头酶LanM来完成Dha、Dhb、Lan和MeLan残基的形成。Xie等(2004) Science. 303,679-681.乳链球菌素481生物合成的报告没有提供关于产量或纯度的任何详细信息，但他们的工作是在纳克级别上完成的。该报告中阐述的进展代表很小但却是明显的进步，其受到广泛称赞的接受进一步表明将羊毛硫抗生素开发为治疗药物的迫切需
5求。由于系统的复杂性及很可能需要对参与的各种基因进行差异调节表达，用克隆到适宜的一种或多种表达载体和非敏感宿主的Ian基因簇进行大规模生产羊毛硫抗生素的第三个选择是不大可能的。业已将gallidermin的Lan基因簇克隆到枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)中，以试图改善该特定羊毛硫抗生素的生产。然而，这一策略没有导致产量的大大提升，且因为已知基因调控位点随物种不同而变化，其不适用于所有羊毛硫抗生素。相关方法利用克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)中的变异菌肽1140人工基因。该人工基因用半胱氨酸密码子置换参与硫醚桥形成的丝氨酸和苏氨酸残基的天然密码子。将该被修饰的基因克隆到PET32中，并在大肠杆菌的Origami菌株中表达，以使二硫键增至最大限度。开发新的化学方法以从二硫化物基团中挤出单个硫原子，由此将其转变为硫醚。一般而言，证实该方法是可行的，但由于二硫键的多种排列及难以从非活性异构体中分离出活性形式，获得的产率低。乳链菌肽A和其它羊毛硫抗生素的生物活性的关键是通常重叠的环结构，这形成了合成上难以克服的问题。一直都在广泛研究用于合成各种含有羊毛硫氨酸的生物活性肽以及羊毛硫抗生素的体外合成方法。合成羊毛硫抗生素的挑战是艰难的，到目前为止，没有发展出全面的合成策略。文献报道了几种羊毛硫氨酸的合成方法。这些包括应用碱性或亲核条件在预装配肽的胱氨酸单元进行基于原位的脱硫。Galande等(2003) Biopolymers(Peptide Science)71,543-551 ;Galande&Spatola(2001)Letters in Peptide Science. 8, 247-251.由于缺乏非对映体选择性和低产量，脱硫的方法尚未显示任何商业可行性。亦使用仿生方法，其中在预先生成的肽中产生Dha残基，接着进行迈克尔加成以形成羊毛硫氨酸环。肽的预组织可能导致非对映选择性的迈克尔加成。Burage等(2000) Chemistry A European Journal. 6，1455-1466。亦采用在厢树脂上使肽环化，其中合成含有正交保护的羊毛硫氨酸的线性肽，接着环化并裂解环肽产物。Melacini等(1997)，J. Med. Chem. 40, 2252-2258 ；Osapay φ (1997)Journal of Medicinal Chemistry. 40，2441-2251。 这些方法都充满希望，但缺少产生带有重叠硫醚环的羊毛硫抗生素的能力。当考虑到大部分已知羊毛硫抗生素含有重叠环时，这一点变得尤其重要。从概念上说，发展体外合成方法具有明显优势，所述方法包括相对于生物学和仿生学方法对固相肽合成(SPPS)方法进行改良。首先，分子组成不限于正常生理氨基酸集； 有可能设计氨基酸类似物并用良好建立的固相合成方法将其纳入。也可以进行平行合成， 由此显著增加候选底物的数量。因为所述方法完全在体外进行，因此排除了因体内合成生物活性分子而产生的许多问题。例如，发酵过程中产物的降解将不再是问题，也不用关注生物活性分子对生产者微生物的细胞毒性作用。为实现体外合成的目的，用不同方法为SPPS设计了具有潜在合适保护基的正交羊毛硫氨酸，例如将半胱氨酸迈克尔加成到预先形成的Dha。Probert等(1996) Tetrahedron Letters. 37，1101-1104。这一方法导致1 1的非对映体混合物，因此，几乎未显示出商业价值。亦报道具有受保护的半胱氨酸的丝氨酸内酯的开环，但这产生羊毛硫氨酸和硫酯的混合物。业已研究了氮丙啶的开环，但显示由于氮丙啶在α和β位开口而产生区域异构(regioisomeric) t昆合物。Dugave&Menez (1997) Tetrahedron-Asymmetry. 8, 1453-1465 ；Swali 等(2002)Tetrahedron. 58，9101-9109。最近的报告建议用受保护的溴丙氨酸使适当保护的半胱氨酸烷基化，可导致合成羊毛硫氨酸，但是，该方法不允许构建具重叠环的分子。Zhu(2003)European Journal of Organic Chemistry. 20, 4062-4072。因为市购用于SPPS的Fmoc/Boc保护的类似物不足以解决合成羊毛硫抗生素及其它构象上受限的生物活性肽的挑战，所以本领域存在对合成含有分子内桥的肽的需要，所述分子内桥产生内部环状结构，包括多环和重叠环状结构。特别需要用于大规模合成羊毛硫抗生素的体外方法。发明简述因此，本发明提供合成包含至少一个分子内桥的分子内桥连多肽的方法，所述方法包括a)让下式的差异保护的正交分子内桥的游离羧基末端与固相支持体或任选与固相支持体结合的氨基酸或多肽的游离氨基末端偶联，其中Ln代表共价结合的氨基酸侧链，其中D、E和G为保护基，它们各自在不同反应条件下被选择性地除去，其中用于除去保护基D的反应条件与用于除去多肽链的其余氨基酸的氨基保护基的条件不同；b)除去保护基E，以形成游离氨基末端；c)将氨基受到保护的氨基酸添加到所述游离氨基末端，然后使所述氨基酸脱保护，以产生新的游离氨基末端；d)任选重复C) 一次或多次；e)除去保护基G以形成游离羧基末端；f)让e)的游离羧基末端与所述游离氨基末端偶联；g)除去保护基D以形成游离氨基末端；和h)任选将氨基受到保护的氨基酸添加到所述游离氨基末端，然后使所述氨基酸脱保护，以产生新的游离氨基末端；和i)任选重复h) —次或多次。本发明进一步提供合成包含两个重叠分子内桥的分子内桥连多肽的方法，所述方法包括a)让下式的第一个差异保护的正交分子内桥的游离羧基末端与固相支持体或任选与固相支持体结合的氨基酸或多肽的游离氨基末端共价结合，
权利要求
1. 一种合成包含两个重叠分子内桥的分子内桥连多肽的方法，所述方法包括 a)除去下式的第一个差异保护的正交分子内桥中的保护基E，以形成游离氨基末端
2.权利要求1的方法，其中R为-C(O)-O-J,其中J为保护基，将所述保护基在不同于 D、E和G的反应条件下选择性地除去。
3.权利要求1的方法，其中R为-H。
4.权利要求1的方法，其中所述氨基末端保护基选自BoC、TroC、Alloc、ivDde.Cbz和 Fmoc ο
5.权利要求1的方法，其中所述羧基末端保护基选自芴基甲酯、甲酯、苯甲酯、烯丙基酯和Tce酯。
6.权利要求1的方法，所述方法还包括以任何次序并以任何重复次数的一个或多个以下步骤a)让所述分子内桥连多肽的羧基末端与包含一个或多个氨基酸的肽链偶联；b)让所述分子内桥连多肽的羧基末端与包含分子内桥的肽链偶联；c)让所述分子内桥连多肽的氨基末端与包含一个或多个氨基酸的肽链偶联；和d)让所述分子内桥连多肽的氨基末端与包含分子内桥的肽链偶联。
7.权利要求1的方法，其中所述包含两个重叠分子内桥的分子内桥连多肽为羊毛硫抗生素或其类似物。
8.权利要求7的方法，其中所述包含两个重叠分子内桥的分子内桥连多肽为MU1140或其类似物。
全文摘要
本发明提供合成包含至少一个分子内桥的分子内桥连多肽的方法。本发明进一步提供合成包含两个分子内桥的分子内桥连多肽的方法，其中所述两个分子内桥形成两个重叠环、两个串联环或两个嵌入环。本发明亦提供用于合成包括乳链菌肽A在内的羊毛硫抗生素的方法。另外，本发明提供通过本文所公开的方法合成的分子内桥连多肽和差异保护的正交羊毛硫氨酸。
文档编号C07K1/06GK102405227SQ201080015931
公开日2012年4月4日 申请日期2010年3月25日 优先权日2009年3月28日
发明者A·瓦库伦科, J·D·希尔曼, K·基里琴科 申请人:奥洁克公司