专利名称：一种利用高地芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及ー种利用高地芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的方法。
背景技术：
蛋白酶作为エ业化生物酶制剂中应用广泛、用量最多的ー种酶，其目前市场中用量约占生物酶总量的60%，其中碱性蛋白酶就占25%。蛋白酶除了广泛应用于洗涤剂行业夕卜，还广泛应用于食品加工、化工エ业、医药和轻エ业等多个行业，呈现出巨大的市场应用价值，而且其应用范围还在不断扩大，尤其在应用于大豆肽等功能食品添加剂的生产等。我国自20世纪50年代开始筛选产碱性蛋白酶菌种，经过不断选育，在研究和生产碱性蛋白酶的活力水平上有较大的进步，已经应用于生产的主要有地衣芽孢杆菌2709和 C1213、短小芽孢杆菌209和嗜碱性短小芽孢杆菌ガ^^等。但是，当前我国国内碱性蛋白酶的产生菌株单一，酶产量和酶学性质都不能满足现代エ业发展的需求，导致国产碱性蛋白酶市场份额锐減。我国大多采用进ロ的碱性蛋白酶制剂，并且大規模エ业生产中用的碱性蛋白酶还是主要依赖国外进ロ。大豆肽是大豆蛋白的酶解产物,主要是大豆蛋白水解后的多种肽混合物。大豆肽除了具有易消化吸收等特性外，还具有独特的生理功能，对机体具有多种调节功能，在促进脂肪代谢、降低血清胆固醇、降血压以及增强肌肉运动能力等方面具有显著作用。可以作为功能因子，添加在多种食品中。因其功能性强、应用广泛，大豆肽成为近年来研究的热点。酶法生产大豆肽具有其他方法所不具有的优势,如营养价值高、功能性强、酶解条件温和、反应时间短、效率高，产物杂质少、无有毒物质产生、无污染等反应条件温和，不产生消旋作用，也不破坏氨基酸；产品纯度高，产物易分离，成本低廉等。因而，酶法是当前大豆肽生产的首选方法。目前，虽然传统蛋白酶生产技术相对成熟，但在大豆肽专用碱性蛋白酶的研究和生产方面进展缓慢，且其关键技术被几家国际酶制剂公司所垄断。近年来国内大豆肽的需求快速增长，但我国与大豆肽应用相关的蛋白酶研究和生产因投入不足，因而存在单位酶活低、水解产物不理想等问题。而国外公司的相关蛋白酶产品售价一直较高，从而导致酶使用成本増加，成为当前限制我国大豆肽产业发展的瓶颈。因此，研发大豆肽专用碱性蛋白酶的发酵技术显得十分重要。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种生产碱性蛋白酶的方法，这种碱性蛋白酶适合于生产大豆肽。本发明采用如下技术方案ー种利用高地芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的方法，其生产关键技术如下；
选用高地芽孢杆菌为碱性蛋白酶发酵菌种，采用培养基配方为每升液体培养基含有豆柏40-80克，蔗糖30-70克，吐温-80 O. 3-0. 7克，葡萄糖20克，氯化钙O. 7克，硫酸镁O. 4克，氯化钾O. 3克。发酵条件为培养温度为37° C，初始pH值为ρΗΙΟ.Ο，搅拌速度300 rpm，充气速度lvvm，发酵时间3天。发酵液再经过压滤机过滤、超滤浓缩、添加稳定剂和防腐剤，包装后即为商品碱性蛋白酶。本发明所述的发酵菌种为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis PY41)。本发明所述的豆柏为大豆油エ业生产副产品。
本发明添加的稳定剂和防腐剂都是食品法规允许的添加剤。另外，搅拌速度的单位rpm即为姆分钟转数,充气速度单位vvm即为姆分钟单位体积发酵液充入相同体积的无菌空气，这都是发酵行业常见表示方式。本发明与已有技术相比具有以下显著特点和积极效果本发明通过微生物液体发酵技术生产碱性蛋白酶，发酵エ艺简单，发酵原料主要利用豆柏等便宜原料，生产成本较低。发酵后处理工艺也比较简单，生产技术简化，有利于发酵エ厂技术人员和工人掌握。本发明所采用菌种高地芽孢杆菌生长快，发酵速度快，生产过程不易染菌，发酵技术成熟，适合エ业化生产。本发明生产的碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白得到的大豆肽产品具有如下特性通过闻效液相色谱法分析，大丑肽分子量分布为分子量丽< 1000 Da的短肽占80. 7%,MW ^ 2000 Da的肽占91%。产品符合国家标准(GB/T22492-2008)中的大豆肽ー级标准。大豆肽分子量分析參照QB/T22492-2008方法，结果见附图I。
附图为大豆肽样品的HPLC图谱
注色谱柱为TSKgelG2000SWXL[300 mmX7.8 mm(内径)，日本东洋曹达凝胶柱，分离分子量范围是5000-105 Da;流动相こ腈+水+三氟こ酸=45+55+0. I ;紫外检测器的波长设为220 nm ;泵流速设为I mL/ min ;柱温设为室温；进样体积为20 μし
具体实施例方式实施例I
ー种利用高地芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的方法，具体为
选用高地芽孢杆菌为碱性蛋白酶发酵菌种，采用培养基配方为每升液体培养基含有豆柏50克，蔗糖50克，吐温-80 O. 5克，葡萄糖20克，氯化钙O. 7克，硫酸镁O. 4克，氯化钾O. 3克。发酵条件为培养温度为37° C，初始pH值为ρΗΙΟ.Ο，搅拌速度300 rpm，充气速度lvvm，发酵时间3天。发酵液再经过压滤机过滤、超滤浓缩、添加稳定剂和防腐剤，包装后即为商品碱性蛋白酶。实施例2
ー种利用高地芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的方法，具体为
选用高地芽孢杆菌为碱性蛋白酶发酵菌种，采用培养基配方为每升液体培养基含有豆柏60克，蔗糖70克，吐温-80 O. 7克，葡萄糖20克，氯化钙O. 7克，硫酸镁O. 4克，氯化钾O. 3克。发酵条件为培养温度为37° C，初始pH值为ρΗΙΟ.Ο，搅拌速度300 rpm，充气速度lvvm，发酵时间3天。发酵液再经过压滤机过滤、超滤浓缩、添加稳定剂和防腐剤，包装后即为商品碱性蛋白酶。
实施例3
ー种利用高地芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的方法，具体为
选用高地芽孢杆菌为碱性蛋白酶发酵菌种，采用培养基配方为每升液体培养基含有豆柏70克，蔗糖30克，吐温-80 O. 4克，葡萄糖20克，氯化钙O. 7克，硫酸镁O. 4克，氯化钾O. 3克。发酵条件为培养温度为37° C，初始pH值为ρΗΙΟ.Ο，搅拌速度300 rpm，充气速度lvvm，发酵时间3天。发酵液再经过压滤机过滤、超滤浓缩、添加稳定剂和防腐剤， 包装后即为商品碱性蛋白酶。
权利要求
1.一种利用高地芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的方法，其特征在于以高地芽孢杆菌为发酵菌种，采用如下关键技术和工艺参数(1)每升液体培养基含有豆柏40-80克，蔗糖30-70克，吐温-800. 3 -0. 7克；(2)每升液体培养基同时含有葡萄糖20克，氯化钙0.7克，硫酸镁0. 4克，氯化钾0.3 克； (3)发酵条件为温度为37°C，初始pH值为pHlO.O，搅拌转速300 rpm，充气速度为I vvm,发酵时间3天； (4)发酵液再经过压滤机过滤、超滤浓缩、添加稳定剂和防腐剂，包装后即为商品碱性蛋白酶。
2.根据权利要求I所述的一种利用高地芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的方法，其特征在于得到的碱性蛋白酶适合于生产具有抗氧化等功能性的大豆肽。
全文摘要
本发明涉及了一种利用高地芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的方法。利用一株高地芽孢杆菌为碱性蛋白酶发酵菌种，采用培养基配方为每升液体培养基含有豆粕40-80克，蔗糖30-70克，吐温-80 0.3-0.7克，葡萄糖20克，氯化钙0.7克，硫酸镁0.4克，氯化钾0.3克。同时培养温度为37°C，初始pH值为pH10.0，搅拌速度300rpm，充气速度1vvm，发酵时间3天。发酵液再经过压滤机过滤、超滤浓缩、添加稳定剂和防腐剂，包装即成。采用高地芽孢杆菌为碱性蛋白酶发酵菌种；培养基配方中碱处理大豆粉、蔗糖和吐温80的添加对发酵液中碱性蛋白酶酶活的提高起到关键作用；大豆肽具有便于人体消化吸收、抗氧化、抗菌等功能特性，本发明生产的碱性蛋白酶适合应用于大豆肽生产。
文档编号C12R1/07GK102676482SQ20121014448
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月11日 优先权日2012年5月11日
发明者丁长河, 李盘欣, 陈复生 申请人:河南省南街村(集团)有限公司