专利名称：一种胸水分离肺癌细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种肿瘤细胞分离的方法，具体涉及一种胸水中分离纯化肺癌细胞的方法，属于肿瘤细胞生物学技术领域。
背景技术：
胸腔是由壁层胸膜与脏层胸膜所组成的一个封闭性腔隙，其内为负压，正常情况下两层胸膜之间存在很少量(约f 30毫升)的液体所起润滑作用，减少在呼吸活动过程中两层胸膜之间的摩擦，利于肺在胸腔内舒缩。这种液体从壁层胸膜产生，由脏层胸膜吸收，不断循环之处于动态平衡，液体量保持恒定。当发生某种情况影响到胸膜，无论是壁层胸膜产生胸水或是脏层胸膜吸收胸水的速率有变化，都可使胸腔内液体增多，也就是所谓胸腔积水(积液)。、肺癌胸水是中晚期肺癌患者较常见的并发症，最初可能对生活质量影响还不大，但随着病程进展，会引起呼吸困难、咳嗽、胸痛等症状，对病人的危害甚至超过了肺癌本身。癌性胸水往往是血性的，除脱落的肿瘤细胞外内含大量红白细胞以及细胞碎片。肿瘤研究需要大量的临床肿瘤组织和细胞，目前大部分研究者主要选用临床肿瘤病人的手术标本，虽然来源较多，标本量大，但由于晚期肺癌的治疗往往以保守治疗为主，不易获得相应的手术标本。晚期肺癌病人较多出现胸水等并发症，抽取胸水是临床的常规治疗方法，在胸水中分离肿瘤细胞具有简便、经济的特点，同时又可以得到大量的恶性度高病程晚期的肺癌细胞。以往采用直接离心的方法虽然简单易行，但其它细胞和组织碎片较多，肿瘤细胞的纯度较低，实际应用意义不大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种胸水分离肺癌细胞的方法，以解决现有技术所存在的诸多不足之处。本发明的原理
使用梯度离心的方法可以将不同大小、比重的细胞进行分层和分离，我们在此方法的引导下，经过反复探索和实验，利用肿瘤细胞比其它正常细胞体积大、比重大的特点，建立了一个胸水中分离肺癌细胞的方法，并用于肺癌细胞的收集、培养和细胞系的建立。Percoll是一种包有乙烯卩比咯烧酮的娃胶颗粒。渗透压很低(<20mosm/kg H 2
0)，粘度也很小，可形成高达I. 3g / ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200 IOOOg)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此用于分离细胞、细菌及病毒。但未见利用相应密度梯度的离心方法在胸水中分离肺癌细胞，同时进行相关的原代培养和建系。
本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现
一种胸水分离肺癌细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤
(1)不同浓度Percoll溶液的制备先用9份Percoll与I份8.5% NaCl或I. 5M PBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液稀释到6(T70%Wt、4(T50%Wt ；
(2)胸水悬液的制备胸水样本1500rpm离心5分钟，弃上清，1% PBS清洗一遍，1500rpm离心5分钟，弃上清，1%PBS重悬；此时胸水悬液中含多种细胞成分以及细胞组织碎片; (3)不连续密度梯度Percoll层的制备
6(T70%Wt、4(T50%Wt、胸水悬液按照I :1 1的比例由高密度向低密度逐层配置，形成3个密度梯度；
(4)离心2800-3200rpm离心 25_40min ；
(5)取样所要分离的细胞位于两层界面，小心地吸取中间细胞层，1%PBS清洗I遍，1500rpm离心5min,弃上清，收获细胞；以及
(6)细胞培养获得的细胞用10%FBS的DMEM常规培养。其中，步骤(I)中所述的生理溶液为0.85% WT NaCl或0.15M PBS。所述Percoll 溶液的浓度为 60%wt、40%wt。其中，步骤(3)中每个梯度3ml，共9ml，由下至上加入IOml离心管，根据胸水悬液的多少确定多少离心管。其中，步骤(4)中所述的离心为3000rpm离心30min。本发明的有益效果
本发明的方法具有简单、稳定、成本低、效果好的优点。
以下结合附图
和具体实施方式
来进一步说明本发明。图I为细胞分离后的形态图。图2为细胞分离后的形态图。图3为细胞分离后的形态图。图4为细胞分离后的形态图。
具体实施例方式为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
实施例实验步骤
I.不同浓度(密度)Percoll溶液的制备
先用9份Percoll与I份8. 5% NaCl或I. 5M PBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85% NaCl或0. 15M PBS)稀释到所需浓度。我们采用的是60%与40%浓度。该浓度梯度经过比较发现简便有效，分离效果较好。
2.胸水悬液的制备
胸水样本1500rpm离心5分钟,弃上清，1% PBS清洗一遍，1500rpm离心5分钟,弃上清，1%PBS重悬；此时胸水悬液中含多种细胞成分以及细胞组织碎片。3.不连续密度梯度Percoll层的制备
60%、40%、胸水悬液按照I :1 1的比例由高密度向低密度逐层配置，形成3个密度梯度。具体要求是加液时尽量轻柔缓慢，以免影响原有密度梯度。一般每个梯度3ml，共9ml，由下至上加入IOml离心管，根据胸水悬液的多少确定多少离心管。4.离心
2800-3200rpm离心25_40min，肿瘤细胞较大故离心速度较快和时间较长，通常我们选用3000rpm离心30min，由于3层之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。离心机放置的实验台要稳固，离心机最好是进口的。5.取样
所要分离的肺癌细胞由于体积略大比重略重位于离心管近中间界面，形成灰白色细胞层；其它细胞和碎片较小沉入管底，如果是血性胸水可见管底的红色细胞团。所要分离的细胞位于两层界面，小心地吸取中间细胞层，1% PBS清洗I遍，1500rpm离心5min，弃上清，收获管底的灰白色肺癌细胞，显微镜下观察细胞形态。6.细胞培养
由于胸水中经过密度梯度离心后分离纯化的肺癌细胞恶性度(晚期才出现胸水)和纯度(极少有其它细胞)均比手术标本(一般早期考虑手术治疗，标本中除肿瘤细胞外，还有较多的正常细胞、坏死细胞和组织碎片)要好，是细胞培养的良好材料。分离的原代细胞可以用10%FBS的DMEM进行常规培养。或者根据需要连续培养传代建立相应的肺癌细胞系。获得的细胞用10%FBS的DMEM常规培养。胸水肺癌细胞分离情况，详细结果见表I。表1为胸水肺癌细胞分离情况
权利要求
1.一种胸水分离肺癌细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)不同浓度Percoll溶液的制备先用9份Percoll与I份8.5% NaCl或I. 5M PBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液稀释到6(T70%Wt、4(T50%Wt ； (2)胸水悬液的制备胸水样本1500rpm离心5分钟，弃上清，1% PBS清洗一遍，1500rpm离心5分钟，弃上清，1%PBS重悬；此时胸水悬液中含多种细胞成分以及细胞组织碎片; (3)不连续密度梯度Percoll层的制备 6(T70%Wt、4(T50%Wt、胸水悬液按照I :1 1的比例由高密度向低密度逐层配置，形成3个密度梯度； (4)离心2800-3200rpm离心 25_40min ； (5)取样所要分离的细胞位于两层界面，小心地吸取中间细胞层，1%PBS清洗I遍，1500rpm离心5min,弃上清，收获细胞；以及 (6)细胞培养获得的细胞用10%FBS的DMEM常规培养。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)中所述的生理溶液为0.85% WTNaCl 或 0. 15M PBS。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述Percoll溶液的浓度为60%wt、40%wto
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(3)中每个梯度3ml，共9ml，由下至上加入IOml离心管，根据胸水悬液的多少确定多少离心管。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(4)中所述的离心为3000rpm离心30mino
全文摘要
本发明公开了一种胸水分离肺癌细胞的方法，包括(1)不同浓度Percoll溶液的制备、(2)胸水悬液的制备、(3)不连续密度梯度Percoll层的制备、(4)离心、(5)取样以及(6)细胞培养。本发明的方法具有简单、稳定、成本低、效果好的优点。
文档编号C12N5/09GK102676456SQ20121014377
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者刘蕾, 姚明, 孙磊, 李榕, 顾爱琴 申请人:上海市胸科医院