专利名称：检测i型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增试剂盒及应用。
背景技术：
鸭肝炎(Duck h印atitis，DH)是雏鸭的一种高度致死性传染病。目前认为，鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)有3个血清型,分别引起I型、II型和III型鸭肝炎。I型鸭肝炎最早发现于美国，1950年用鸡胚分离到DHV。1953年开始蔓延到加拿大、英国、德国、意大利、法国、匈牙利、前苏联、印度、日本等国。二十世纪60年代以来，我国兽医科技工作者对该病进行了调查研究和病原分离等工作，目前养鸭比较集中的一些省区均有该病发生和流行。现在分离到的鸭肝炎病毒变种多达100多株。鸭肝炎病毒的传统检测方法为先将病毒分离培养，然后进行血清和综合试验定型分类，此法繁琐耗时、浪费人力物力，虽然多数培养结果可在I周内得到，但中和试验却十分费时、昂贵，甚至有时无法定型。PCR方法具有快速、敏感性强、特异性高等诸多优点，已应用于其他病毒的检测中，但是由于需要昂贵的仪器设备和较高的检测费用，以及对检测人员较高的技术要求，因而使其不适合现场快速检测和基层中普及使用。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技术是由Notomi等于2000年发明的一种新型核酸扩增技术，该技术缩短了核酸扩增时间，提高了扩增效率，并且具有更高的灵敏度、特异性，不需要昂贵的设备，操作也非常简便，普通技术人员均能很快掌握检测方法，被公认为是具有较强实用性的分子检测技术。环介导等温扩增技术中，引物是成功的关键，好的引物可大大提高检测的特异性和灵敏性。
发明内容
本发明的一个目的是提供检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增引物组。本发明所提供的引物组包括引物I、引物2、引物3和引物4，所述引物I、所述引物
2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。所述引物组中所述引物I (F3)、所述引物2 (B3)、所述引物3 (FIP)和所述引物4 (BIP)在环介导等温扩增反应体系中的使用配比(摩尔比)为I : I : 4 : 4。在本发明的实施例中，所述引物I (F3)和所述引物2 (B3)在环介导等温扩增反应体系中的终浓度均为0.2μΜ;所述引物3 (FIP)和所述引物4 (BIP)在环介导等温扩增反应体系中的终浓度均为O. 8 μ Μ。所述引物组中，引物I (F3)和引物2 (Β3)组成外侧引物对；引物3 (FIP)和引物
4(BIP)组成内侧引物对。序列I由22个核苷酸组成，序列2由18个核苷酸组成，序列3由37个核苷酸组成，序列4由43个核苷酸组成。本发明的又一个目的是提供检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增试剂。本发明所提供的扩增试剂包括反转录酶、链置换型DNA聚合酶、Mg2+、甜菜碱(Betaine)、dNTPs、以及所述引物组。所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述链置换型DNA聚合酶、所述反转录酶和所述甜菜碱在环介导等温扩增试剂中的配比为O. 2μΜ
O.2μΜ O. 8μΜ O. 8μΜ O. 8mM 6mM 8U IOU 0. 8M。在本发明的实施例中，所述反转录酶具体为AMV反转录酶，也可以为M-MLV ;所述链置换型DNA聚合酶具体为Bst DNA聚合酶大片段。本发明的另一个目的是提供检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增试剂盒。 为了提高检测结果的准确性，本发明所提供试剂盒除了含有所述引物组，或所述扩增试剂外，还含有阳性对照质粒和/或阴性对照。在本发明的实施例中，所述阳性对照质粒具体为pTP-TSl =DHAV-I，其构建方法包括如下步骤I)提取I型鸭肝炎病毒DHAV-I-SD株的RNA，并以所述RNA为模板，利用由序列表中序列5和序列6所示DNA片段组成的引物对进行反转录PCR ；2)将步骤I)所得的PCR产物与pTP-TSl载体连接，得到所述阳性对照质粒pTP-TSl:DHAV-I。其中，序列5由20个核苷酸组成；序列6由25个核苷酸组成。所述阴性对照可为在检测体系中以纯水代替待测样品，进行环介导等温扩增。本发明所提供的检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增试剂盒中还可以包括荧光显色剂。在本发明的实施例中，所述荧光显色剂具体为荧光染料SYBR GREEN I。所述检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增引物组在制备检测或辅助检测I型鸭肝炎病毒试剂或试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。所述引物组，或所述试剂，或所述试剂盒在鉴定和/或辅助鉴定待测样品中是否含有I型鸭肝炎病毒中的应用也属于本发明的保护范围。应用本发明所提供的所述引物组，或所述扩增试剂，或所述试剂盒鉴定和/或辅助鉴定待测样品中是否含有I型鸭肝炎病毒的方法，包括如下步骤在实际应用中，用所述引物组，或所述试剂，或所述试剂盒对待测样品进行环介导等温扩增反应，所述环介导等温扩增反应在如下条件下进行60°C -65°C恒温反应lh，如63°C，恒温反应lh。所述待测样品来自健康的动物或死亡的动物或空气。所述环介导等温扩增中，所述待测样品可以为RNA，也可以为DNA。环介导等温扩增结束后，按照如下方法确定待测样品中是否含有I型鸭肝炎病毒环介导等温扩增结束后，根据如下标准对结果进行判断如果阳性对照反应管底部有明显的白色沉淀，阴性对照没有，则说明结果可信；在此前提下，如果待测样品反应管有明显的白色沉淀，则说明待测样品中存在I型鸭肝炎病毒，若没有白色沉淀，向反应体系中加入SYBR Green I型核酸染料，如果反应液变成绿色，说明待测样品中含有I型鸭肝炎病毒，若反应体系呈现桔黄色，则说明待测样品中没有I型鸭肝炎病毒。当然也可将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测待测样品中是否含有I型鸭肝炎病毒，电泳检测如出现阶梯状DNA条带，则说明待测样品中含有I型鸭肝炎病毒，若未出现阶梯状DNA条带，则说明待测样品中没有I型鸭肝炎病毒。如图I所示。
观察阳性对照和阴性对照反应液是否有白色沉淀，阳性对照反应液有明显的白色沉淀，阴性对照没有，如果是这种现象则继续观察待测样品液，如果待测样品反应液有白色沉淀，则说明待测样品为含有鸭肝炎病毒的样品或候选含有鸭肝炎病毒的样品，若没有白色沉淀，向反应体系中加入SYBR Gre en I型核酸染料，如果反应液变成绿色，说明待测样品中含有或候选含有I型鸭肝炎病毒，若反应体系呈现桔黄色，则说明待测样品中没有或候选没有I型鸭肝炎病毒。所述I型鸭肝炎病毒为DHAV-I-SD株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 3746。本发明所提供的检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增引物组、试剂或试剂盒具有如下优点I、操作简便将待测样品和检测试剂混合后，放入63°C的恒温加热设备中反应I小时即可。2、鉴定简便可直接用肉眼观测，或加入SYBR Green I型核酸染料后肉眼观察，若直接用肉眼观测反应体系中出现白色沉淀，或直接用肉眼观测反应体系无白色沉淀，但加入SYBR Green I型核酸染料后变为绿色，则为阳性(待测样品含有或候选含有I型鸭肝炎病毒)；若反应体系呈现桔黄色，则为待测样品中没有或候选没有I型鸭肝炎病毒。3、特异性强检测体系中的四条引物靶序列的特异性结合保证了环介导等温扩增检测的高度特异性。实验证明，使用本发明所提供的引物组、试剂或试剂盒检测多种其他鸭来源病毒、细菌和鸭的正常组织均为阴性结果，只有检测I型鸭肝炎病毒为阳性结果。4、灵敏度高该方法扩增所需模板少，在I型鸭肝炎病毒较少的情况下也能将其检出。实验证明，使用本发明所提供的引物组、试剂或试剂盒可检测到最低浓度为O. 2pg/微升的I型鸭肝炎病毒RNA。
图I为LAMP反应检测I型鸭肝炎病毒的结果。其中，泳道M为NP5000分子量标准，泳道I为阴性结果(阴性对照)，泳道2为阳性结果。图2为检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增试剂盒的特异性分析结果。其中，泳道M为NP2000分子量标准，泳道I为I型鸭肝炎病毒，泳道2为鸭病毒性肠炎病，泳道3为番鸭细小病毒，泳道4为禽流感病毒，泳道5为鸭疫里氏杆菌，泳道6为肠炎沙门氏菌，泳道7为大肠杆菌，泳道8为正常鸭胚尿囊液，泳道9为纯水阴性对照。图3为检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增试剂盒的灵敏度分析结果。其中，泳道M为NP5000分子量标准，泳道I为IO2倍稀释鸭肝炎病毒RNA，泳道2为IO3倍稀释鸭肝炎病毒RNA，泳道3为IO4倍稀释鸭肝炎病毒RNA，泳道4为IO5倍稀释鸭肝炎病毒RNA，泳道5为IO6倍稀释鸭肝炎病毒RNA，泳道6为IO7倍稀释鸭肝炎病毒RNA，泳道7为IO8倍稀释鸭肝炎病毒RNA，泳道8为IO9倍稀释鸭肝炎病毒RNA。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
引物由北京博迈德生物科技有限公司合成，Bst DNA聚合酶购自NEB公司(M0275V)，AMV反转录酶购自NEB公司(M0277L)，dNTPs购自北京诺派生物科技有限公司(10612-01)，甜菜碱(Betaine)购自 Sigma 公司(B7045)，MgS04 购自西陇化工(7487-88-9)，IOXThermoPol buffer购自NEB公司(M0275V)，pTP-TSl克隆载体购自北京诺派生物科技有限公司(30212-01 )，一步法RT-PCR试剂盒购自北京诺派生物科技有限公司(10433-01 )。I型鸭肝炎病毒DHAV-I-SD株(鸭甲型肝炎病毒I型DHAV-SD株)已于2010年4月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏中心登记入册编号CGMCC No. 3746。该毒株已在2010年8月6日申请的的专利中公开过，专利申请号为201010247306. 9，申请公布号为CN101948809A。 实施例I、LAMP反应检测I型鸭肝炎病毒一、检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增试剂盒的制备I、检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增引物组的制备本实施例检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增引物组由引物I、引物2、引物3和引物4组成。这四个引物按照如下方法制备从GENBANK上检索查找I型鸭肝炎病毒的基因组序列(GENBANK JF828983. 1)，通过BLAST软件进行同源性分析，选取I型鸭肝炎病毒的特异性保守序列，设计LAMP引物。设计的LAMP引物序列如下，人工合成F3 (序列 1，引物 I) :5’ -ATGCTAAGAACTGAAAAAGACT-3’ (GENBANK JF828983. I 的第 4300-4321 位)B3 (序列 2，引物 2) :5’ -ACCAAGAGGTTCAGGACG-3’ (GENBANK JF828983. I 的第4495-4512位的反向互补序列)FIP (序列 3，引物 3):5，-GGTTCAATGTGCCAGAGAC-TGAGCATAACACTCGTCC-3 ’(“ _，，前的序列为 GENBANK JF828983. I的第4372-4390位的反向互补序列后的序列为GENBANK JF828983. I的第 4329-4346 位)BIP (序列 4，引物 4):5’ -TCCAAGGTATTTCAAGTGCTCGT-GGCTCAAAATTGACTTGGTG-3’前的序列为GENBANK JF828983. I 的第 4394-4416 位后的序列为 GENBANK JF828983. I 的第4456-4475位的反向互补序列)2、检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增试剂的优化本实施例的检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增试剂，包括反转录酶、链置换型DNA聚合酶、Mg2+、甜菜碱、dNTPs和步骤I的引物组，其中所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述链置换型DNA聚合酶、所述反转录酶和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比为O. 2μ M O. 2μ M O. 8μ M O. 8μ M O. 8mM 6mM 8U IOU 0. SM。该扩增试剂是通过建立并优化检测I型鸭肝炎病毒的LAMP反应体系得出的，具体方法如下所述提取I型鸭肝炎病毒DHAV-I-SD株(保藏号CGMCC No. 3746)的RNA，具体操作参照分子克隆第二版。将提取的RNA作为待测样品。通过在25 μ I的LAMP反应体系(待测样品为I μ I)设置不同终浓度的MgS04(4mM、4.5mM、5mM、5. 5mM、6mM、6. 5mM、7mM、7. 5mM、8mM、8. 5mM)、dNTP (0. 6mM、0. 8mM、lmM、l. 2mM、
I.4mM、l. 6mM)、甜菜碱(0. 2Μ、0· 4Μ、0· 8Μ、1Μ、1· 2Μ、1· 4Μ、1· 6Μ)和温度(60 °C、61 °C、62 °C、63°C、64°C、65°C)，优化各组分及反应参数，从而获得最佳的(优化后)检测I型鸭肝炎病毒的LAMP反应体系和条件。(I)优化后的LAMP反应体系为
权利要求
1.检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增引物组，由引物I、引物2、引物3和引物4组成，所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。
2.根据权利要求I所述的检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增引物组，其特征在于所述引物组中所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比为I : I : 4 : 4。
3.检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增试剂，包括反转录酶、链置换型DNA聚合酶、Mg2+、甜菜碱、dNTPs和权利要求I或2所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增试剂，其特征在于所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述链置换型DNA聚合酶、所述反转录酶和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比为O. 2 μ M : O. 2 μ M : O. 8 μ M0.8μΜ 0.8mM 6mM 8U IOU 0.8M。
5.根据权利要求3或4所述的检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增试剂，其特征在于所述反转录酶为AMV反转录酶或M-MLV反转录酶；所述链置换型DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
6.检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增试剂盒，含有下述a)和b) a)阳性对照质粒和/或阴性对照； b)权利要求I或2所述引物组，或权利要求3-5中任一所述扩增试剂。
7.根据权利要求6所述检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括荧光显色剂。
8.根据权利要求6或7所述检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于所述荧光显色剂为荧光染料SYBR GREEN I ； 所述阳性对照质粒为pTP-TSl =DHAV-I，其构建方法包括如下步骤 1)提取I型鸭肝炎病毒为DHAV-I-SD株的RNA，利用由序列表中序列5和序列6所示DNA片段组成的引物对进行反转录PCR;所述DHAV-I-SD株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 3746 ； 2)将步骤I)所得的PCR产物与pTP-TSl载体连接，得到所述阳性对照质粒pTP-TSlDHAV-I。
9.权利要求I或2所述检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增引物组在制备检测或辅助检测I型鸭肝炎病毒试剂或试剂盒中的应用。
10.权利要求I或2所述引物组,或权利要求3-5中任一所述试剂,或权利要求6-8中任一所述试剂盒在鉴定和/或辅助鉴定待测样品中是否含有I型鸭肝炎病毒中的应用，所述应用中利用权利要求I或2所述引物组，或权利要求3-5中任一所述试剂，或权利要求6-8中任一所述试剂盒对待测样品进行环介导等温扩增反应；所述环介导等温扩增反应在如下条件下进行60°C -65°C恒温反应Ih，优选为63°C恒温反应Ih ； 所述待测样品来自健康的动物或死亡的动物或空气。
全文摘要
本发明公开了检测I型鸭肝炎病毒的环介导等温扩增试剂盒及应用。本发明所提供试剂盒中包括检测I型鸭肝炎病毒的引物组，所述引物组包括引物1、引物2、、引物3和引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。所述试剂盒还包括反转录酶、链置换型DNA聚合酶、Mg2+、甜菜碱、dNTPs、阳性对照质粒和荧光显色剂。本发明所提供的试剂盒操作及鉴定结果的判断简便、特异性强、灵敏度高，可检测到0.2pg/微升的I型鸭肝炎病毒RNA。
文档编号C12R1/93GK102643933SQ201210143460
公开日2012年8月22日 申请日期2012年5月9日 优先权日2012年5月9日
发明者刘文军, 孙蕾, 李晶, 杨利敏, 毕玉海, 许磊 申请人:中国科学院微生物研究所