专利名称：产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及ー株产丁ニ酸基因工程菌及其发酵生产丁ニ酸的方法，具体是ー株高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等单糖，并且高效利用各种比例混合糖以及纤维素水解液生长并产丁ニ酸重组菌株及其利用该菌株发酵生产丁ニ酸的方法
背景技术：
丁ニ酸(succinic acid)又称琥珀酸，被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品和塑料等行业，作为C4平台化合物，可用于合成1，4-丁ニ醇、四氢呋喃、Y-丁内酯等有机化学品以及聚丁ニ酸丁ニ醇酯(PBS)类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制产品之一。丁ニ酸的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法，利用微生物发酵法转化可再生资源，由于原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且在发酵过程中可以吸收固定CO2，能有效缓解温室效应，开辟了温室气体ニ氧化碳利用的新途径，今年来成为研究的热点。丁ニ酸的生产菌株主要集中在Anaerobiospirillum succiniciproducens、Actinobacillus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens、重组谷孰酸棒杆菌和重组大肠杆菌。其中利用野生菌株生产丁ニ酸虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养基成本较高，且甲酸、こ酸等副产物积累较多，阻碍了其エ业化进程。而重组大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近年来被广泛用于研究以获得产丁ニ酸优秀菌株。PTS转运系统是大肠杆菌中葡萄糖转运的主要转运方式，但是PTS转运系统的存在，使大肠杆菌不能同时利用葡萄糖和其他各种单糖代谢生长，而野生型大肠杆菌能够分别利用葡萄糖、木糖、果糖、阿拉伯糖等单糖在厌氧条件下代谢生长，但是丁ニ酸不是其主要代谢产物，为减少副产物生成，大肠杆菌敲除或失活乳酸脱氢酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性減少副产物的生成。但是当以葡萄糖或果糖为碳源时，由于敲除乳酸脱氢酶(LDH)基因和丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因，导致菌株辅酶不平衡，并且积累了大量丙酮酸，导致菌体不能利用葡萄糖和果糖厌氧条件下代谢生长，井生产丁ニ酸；而以木糖或阿拉伯糖为碳源吋，由于敲除乳酸脱氢酶(LDH)基因和丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因，减少了丙酮酸和こ酸的生成，从而使伴随丙酮酸和こ酸生成的ATP減少，最终导致重组大肠杆菌不能利用木糖和阿拉伯糖代谢生长，井生产丁ニ酸。玉米芯是农业生产中比较常见的废弃物，由于其成分含有大量纤维素，因此其水解液对微生物发酵来说，是ー种很好的可持续利用的绿色碳源，但其稀酸水解液含有高浓度木糖，因此现有技术中大多数产丁ニ酸大肠杆菌不能利用玉米芯水解液发酵生产丁ニ酸。姜岷等将玉米芯按料液比1:5 (质量体积比)配制玉米芯料液，物料粒径250 380 u m,H2SO4用量3% (体积分数)，水解温度126°C，反应时间215h，利用活性炭吸附及Ca(OH)2中和等方式，对玉米芯多组分糖液进行脱毒脱盐处理，总糖质量浓度为50g/L，其中木糖占80%以上。稻草秸杆是重要的ー类可再生生物质资源。目前，除了在造纸业エ业方面的利用，绝大多数被废弃，严重浪费了资源并且污染了环境。其主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，因此其水解液对微生物发酵来说，是ー种很好的可持续利用的绿色碳源，但其水解液含有高浓度木糖，因此现有技术中大多数产丁ニ酸大肠杆菌不能利用稻草秸杆水解液发酵生产丁ニ酸，陶文沂等通过稀硫酸121°C处理稻草秸杆lh，再用20g/L的NaOH于121°C处理秸杆lh，葡萄糖和木糖二者总质量浓度达50g/L左右。甘蔗渣是甘蔗制糖时榨糖之后剩下的主要成分，因此其水解液对微生物发酵来说，是ー种很好的可持续利 用的绿色碳源，但其水解液含有高浓度木糖，因此现有技术中大多数产丁ニ酸大肠杆菌不能利用稻草秸杆水解液发酵生产丁ニ酸，约含有50%的纤维素通过粉碎以及碱/氧化法预处理可得到总糖质量为50g/L，其中木糖占80%以上。糖蜜是エ业制糖过程中，蔗糖结晶后，剰余的不能结晶，但仍含有较多糖的液体残留物。余炜等将糖蜜与水I: I混匀，用浓硫酸(5mol/L)将其pH调至2.0，于100°C加热20min，并用15%的石灰乳中和处理，总糖质量为600g/L，葡萄糖和果糖各占50%。在大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)生成草酰こ酸，在此过程中没有ATP的生成,但是在Bacillus subtilis中，磷酸烯醇式丙酮酸是通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)生成草酰こ酸的，在此过程中有ATP的生成，并且Millard等在大肠杆菌中过量表达E. colippc和pck,研究发现过量表达ppc可以使琥拍酸作为混合酸发酵的主要产物，且产量较出发菌株提高3. 5倍，而过量表达pck对发酵结果没有影响，但在ppc缺陷菌株中，pck的过量表达能够提高琥珀酸的产量，这是由于PPC的Km比PCK小100倍，因此只有在ppc缺陷菌株中，pck的过量表达才能够提高琥珀酸的产量。
发明内容
本发明的目的在于提供了一株高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等单糖，并且高效利用各种比例混合糖以及纤维素水解液生长并产丁ニ酸重组菌株及其构建方法，并利用该菌株厌氧发酵生产丁ニ酸，达到菌株的构建方法简单方便，构建得到的菌株发酵方法简单可行，易于エ业化，产酸能力强的目的，从而大大降低生产成本，提高经济效益。为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案一、本发明提供一株产丁ニ酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli) BA305，其保藏号编号为 CCTCC NO M 2012102。ニ、本发明所述的大肠埃希氏菌BA305的构建方法，其特征在于以缺乏乳酸脱氢酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性的菌株大肠杆菌为出发菌株，利用同源重组技术敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因和磷酸转运系统(PTS)中的ptsG基因，并过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)后，得到高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等单糖，并且高效利用各种比例混合糖以及纤维素水解液生长并产丁ニ酸的大肠埃希氏菌BA305。重组菌株大肠埃希氏菌BA305的代谢途径如图I所示。进ー步地,所述的具体构建步骤如下(I)以缺乏乳酸脱氢酶基因(ldhA)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)活性的E. coliNZNlll菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因和PTS转运系统中的ptsG基因，得到同时缺乏ldhA、pf IB、ppc和ptsG的感受态菌株；(2)纯化扩增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(pck)基因，构建得到过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表达质粒；(3)将步骤(2)所述的质粒导入步骤(I)得到的感受态菌株，获得阳性转化子；(4)利用步骤(3)的阳性转化子过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等单糖，以及各种比例混合糖和纤维素水解液的能力，得到高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等单糖，并且高效利用各种比例混合糖以及纤维素水解液生长并产丁ニ酸的大肠埃希氏菌BA305。三、利用本发明所述的大肠埃希氏菌BA305发酵生产丁ニ酸的方法，其特征在于采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。进ー步地,具体步骤如下。将大肠埃希氏菌BA305按l%(v/v)接种量接种入有氧阶段发酵培养基中有氧培养，当有氧培养菌体OD6tltl至0. 4 0. 6用0. 3mM的IPTG诱导至0D_=3吋，按接种量10%转接至厌氧阶段发酵培养基中厌氧发酵。其中所述的有氧阶段发酵培养基是现有技术中有氧培养产丁ニ酸大肠杆菌的常规培养基；所述的厌氧阶段发酵培养基中的碳源包括但不限于葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、果糖或者其组合；还包括玉米芯水解液、稻草秸杆水解液、糖蜜水解液或者甘蔗渣水解液。本发明的有益效果在于首先，本发明以缺乏乳酸脱氢酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性的菌株大肠杆菌NZNlll为出发菌株，利用同源重组技术敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因和PTS转运系统中的ptsG基因，并过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，使其高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等单糖，并且高效利用各种比例混合糖以及纤维素水解液生长并产丁ニ酸。这种通过分子生物学手段提高菌株ATP生物合成能力，高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等单糖，使菌株能够高效利用各种比例混合糖以及纤维素水解液代谢生长，大量提高丁ニ酸的产量及生产能力的方法未见公开，而这种应用将大大推进丁ニ酸产业的进步和发展。其次，利用本发明所述的菌株大肠埃希氏菌BA305的发酵结果表明新构建的重组大肠杆菌大肠埃希氏菌BA305能够高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等单糖，并且高效利用各种比例混合糖以及纤维素水解液发酵，并大量积累丁ニ酸，相比出发菌株，不能利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等单糖，各种比例混合糖和纤维素水解液发酵，没有丁ニ酸积累的特征，其产酸特征变化巨大。最后，厌氧发酵过程中产大量诸如こ酸等对菌株有毒害作用的副产物，因此考虑两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段进行产酸发酵。也可以选择性地采用膜分离技木，达到分离菌体的目的，再进而用于厌氧发酵。
图IEscherichia coli BA305 的代谢途径。图2实施例I的线性DNA片段的电泳鉴定图。图3实施例I的同源重组阳性重组子的电泳鉴定图。、
图4实施例2的线性DNA片段的电泳鉴定图。图5实施例2的同源重组阳性重组子的电泳鉴定图。图6质粒pTrc99a-pck的双酶切电泳鉴定图。本发明的微生物的分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli) BA305,其保藏日期为2012年4月8日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称为CCTCC，地址为中国 武汉 武汉大学，保藏编号=CCTCC NO M 2012102。
具体实施例方式下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。本发明的生物材料的来源的说明I、本发明所述的安普霉素抗性基因的来源是PIJ773，南京师范大学邵蔚蓝教授惠赠。2、本发明所述的能够诱导表达\重组酶的质粒的来源是pKD46，购自Introvegen 公 ロJ。3、本发明所述的能够诱导产生FLP重组酶的质粒的来源是pCP20，购自丄ntrovegen 公 ロJ。4、本发明所述的Bacillus subtilis基因组的来源是购自中国典型培养物保藏中心。5、本发明所述的表达质粒用pTrc99a的来源是购自Introvegen公司。6、出发菌株E. coli NZNlll的感受态菌株的来源有两处(I)Biotechnol Bioeng, 2001，74:89 95。申请人首先通过查阅到该生物材料的上述文献出处，并联系了发表人系美国芝加哥大学的David P. Clark教授，并邮件请求其赠与该生物材料，并免费获得了该生物材料；且申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料；(2)该生物材料还在中国专利(申请号96198547. X，申请日1996. 10. 31，授权日2003年I月I日，授权公告号CN1097632C)的专利文献中公开并获得授权。7、本发明的引物的设计及合成自行设计并外包金斯瑞生物技术公司合成。实施例I本实施例说明利用同源重组技术敲除出发菌株NZNlll中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因，得到消除安普霉素抗性菌株的过程。I、利用LB培养基，于37°C、有氧条件下培养大肠杆菌NZNlll至OD6tltl=O. 4 0. 6，制备成电转感受态。2、将质粒pKD46电转入感受态的大肠杆菌NZNlll。电击条件为200 Q，25 y F，电击电压2. 3kV，电击时间4 5ms。电击后迅速将菌体加入预冷ImL的SOC培养基，150r/min、30°C培养Ih之后涂布于带氨苄青霉素(amp)的LB培养基平板筛选出阳性转化子大肠杆菌 NZNlll (pKD46)。3、在LB培养基中加入IOmM的L-阿拉伯糖，于30°C下诱导质粒pKD46表达出入
重组酶，制成电转感受态。4、以两侧带有FRT位点的安普霉素抗性基因为模板，利用高保真PCR扩增系统，以质粒PIJ773为模板，并设计两端带有PPC同源片段的扩增引物，扩增出线性DNA同源片段，引物序列如下
上游带同源臂引物H1-P1，下划线为同源片段5， -ATGAACGAACAATATTCCGCATTGCGTAGTAATGTCAGTATGCTCGGCATTCCGGGGATCCGTCGACC-3 。下游带同源臂引物H2-P2，下划线为同源片段5， -AGCACGAGGGTTTGCAGAAGAGGAAGATTAGCCGGTATTACGCATACCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3 。反应体系带同源臂的上下游引物(lOOpmol/ii L)各0. 5 ii L ;模板DNA(100ng/U L)0. 5u L ；10Xbuffer 5u L ；dNTPs (IOmM)各 I y L ;DMS0 (100%) 2. 5 y L ;Pyrobest DNA聚合酶(2. 5U/ u L) I u L ；ddH20 36/35. 5 u L ;总体积 50u L0反应条件94°C, 2min ； (94 °C 45sec ；50 °C 45sec ；72 °C 90sec ; 10 个循环)；(94°C 45sec ；50°C 45sec ；72°C 90sec ;15 个循环)；72°C，5min。线性DNA片段的鉴定如图2。5、电转线性DNA片段至已诱导表达入重组酶的大肠杆菌NZNlll(pKD46)感受态，并涂布于带安普霉素的LB平板筛选出阳性重组子，并进行了 PCR鉴定，电泳图如图3所示。6、阳性重组子制成感受态后倒入能诱导表达FLP重组酶的质粒pCP20，于42°C热激表达FLP重组酶后即可消除安普霉素抗性。利用ー对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的均极为已经敲除抗性的菌株。实施例2本实施例说明利用实施案例I得到的已敲除ppc基因的菌株，再次利用同源重组技术敲除PTS转运系统中ptsG基因，得到消除安普霉素抗性菌株的过程。I、利用LB培养基，于37°C、有氧条件下培养已实施案例I得到的已敲除ppc基因的菌株至OD6qq=O. 4 0. 6，制备成电转感受态。2、将质粒pKD46电转入此感受态细胞中。电击条件为200 Q，25 y F，电击电压
2.3kV，电击时间4 5ms。电击后迅速将菌体加入预冷ImL的SOC培养基，150r/min、30°C培养Ih之后涂布于带氨苄青霉素(amp)的LB培养基平板筛选出阳性转化子大肠杆菌NZNlll/ A ppc(pKD46)。3、在LB培养基中加入IOmM的L-阿拉伯糖，于30°C下诱导质粒pKD46表达出入
重组酶，制成电转感受态。4、以两侧带有FRT位点的安普霉素抗性基因为模板，利用高保真PCR扩增系统，以质粒PIJ773为模板，并设计两端带有ptsG基因同源片段的扩增引物，扩增出线性DNA同源片段，引物序列如下上游带同源臂引物H1-P1，下划线为同源片段5， -ATGTTTAAGAATGCATTTGCTAACCTGCAAAAGGTCGGTAAATCGCTGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3，。下游带同源臂引物H2-P2，下划线为同源片段5， -TTAGTGGTTACGGATGTACTCATCCATCTCGGTTTTCAGGTTATCGGATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3，。
反应体系带同源臂的上下游引物(100pmol/ii L)各0. 5 ii L ;模板DNA(100ng/U L)0. 5u L ；10Xbuffer 5u L ；dNTPs (IOmM)各 I y L ;DMS0 (100%) 2. 5 y L ;Pyrobest DNA聚合酶(2. 5U/ u L) I u L ；ddH20 36/35. 5 u L ;总体积 50u L0反应条件94°C, 2min ； (94 °C 45sec ；50 °C 45sec ；72 °C 90sec ; 10 个循环)；(94°C 45sec ；50°C 45sec ；72°C 90sec ;15 个循环)；72°C，5min。线性DNA片段的鉴定如图4。5、电转线性DNA片段至已诱导表达X重组酶的大肠杆菌NZNlll/A ppc (pKD46)感受态，并涂布于带安普霉素的LB平板筛选出阳性重组子，并进行了 PCR鉴定，电泳图如图5所示。6、阳性重组子制成感受态后倒入能诱导表达FLP重组酶的质粒pCP20，于42°C热 激表达FLP重组酶后即可消除安普霉素抗性。利用ー对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的均极为已经敲除抗性的菌株。实施例3本实施例说明构建过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表达质粒，能够高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等单糖，并且高效利用各种比例混合糖以及纤维素水解液发酵，并大量积累丁ニ酸，得到菌株大肠埃希氏菌BA305的方法。I、构建过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表达质粒，其过程包括(I)合成带有SacI和XbaI酶切位点的引物，上游引物5’-CGAGCTCATGAACTCAGTTGATTTGACCG-3’ ；下游引物5，-GCTCTAGAGCATTCCGTCAATTAAAACAAG-3，。(2)以Bacillus subtilis基因组为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为94°C,5min ；(94°C 45s, 53°C 45s, 72°C 100s，35 个循环);72°C，IOmin。纯化扩增出的 pck基因后，表达质粒用pTrc99a分别用SacI和XbaI双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pck。质粒pTrc99a-pck的双酶切电泳鉴定如图6所示。(3)将质粒pTrc99a_pck导入实施案例2中同时缺乏ldhA、pflB、ppc和ptsG的感受态菌株，获得的阳性转化子即为本发明的新构建菌株Escherichia coliBA305。实施例4本实施例说明大肠埃希氏菌BA305与出发菌株利用木糖发酵产酸能力的对比。大肠埃希氏菌BA305能够高效利用木糖发酵，并大量积累丁ニ酸，采用两阶段发酵方式，其特征在于按l%(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD6tltl至0. 6左右用0. 3mM的IPTG诱导至0D_=3左右吋，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48h。有氧阶段培养基为LB+Amp (氨苄青霉素50 U g/mL)。厌氧阶段培养基为LB+木糖(30g/L) +碱式碳酸镁0. 6g+Amp (氨节青霉素50ii g/mL)+0. 3mM IPTG。发酵结果见表I。表IEscherichia coli BA305与出发菌株发酵产酸的结果比较
权利要求
1.一株产丁ニ酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌BA305 (Escherichiacoli BA305)，其保藏编号为 CCTCC NO :M2012102。
2.权利要求I所述的大肠埃希氏菌BA305的构建方法，其特征在于以缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的菌株大肠杆菌为出发菌株，利用同源重组技术敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和磷酸转移酶系统的PtsG基因后，过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶后，得到大肠埃希氏菌BA305。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于具体构建步骤如下 (1)以缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的E.coli菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和磷酸转移酶系统的PtsG基因，得到同时缺乏.ldhA、pf IB、ppc和ptsG的感受态菌株； (2)纯化扩增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，构建得到过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表达质粒； (3)将步骤(2)所述的质粒导入步骤(I)得到的感受态菌株，获得阳性转化子； (4)利用步骤(3)的阳性转化子过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，恢复其在厌氧条件下代谢，得到的菌株即大肠埃希氏菌BA305。
4.利用权利要求I所述的大肠埃希氏菌BA305发酵生产丁ニ酸的方法，其特征在于采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于将大肠埃希氏菌BA305按体积比1%接种量接种入有氧阶段发酵培养基中有氧培养，当有氧培养菌体0D_至0. 4 0. 6用0. 3mM的IPTG诱导至0D_=3吋，按接种量体积比10%转接至厌氧阶段发酵培养基中厌氧发酵。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的厌氧阶段发酵培养基的碳源为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、果糖或者其组合。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的厌氧阶段发酵培养基的碳源为玉米芯水解液、稻草秸杆水解液、糖蜜水解液或者甘蔗渣水解液。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，涉及一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法。本发明的产丁二酸基因工程菌菌株分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BA305，其保藏号编号为CCTCC NOM2012102。其构建过程主要包括失活或敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和磷酸转运系统中的ptsG基因，并过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，使重组大肠杆菌能够高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等单糖，同时高效利用各种比例混合糖以及纤维素水解液生长，大幅度提高了丁二酸的合成效率。其发酵方法采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。
文档编号C12N15/70GK102643775SQ20121014317
公开日2012年8月22日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者刘嵘明, 吴明科, 姜岷, 曹伟佳, 梁丽亚, 陈可泉, 韦萍, 马江锋 申请人:南京工业大学