专利名称：罗氏沼虾性别特异分子标记、及其筛选方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，本发明涉及罗氏沼虾雌性基因组特异序列，具体的说，是罗氏沼虾性别特异分子标记、及其筛选方法和应用。
背景技术：
罗氏沼奸(Macrobrachium rosenbergii ),素有淡水奸王之称,原产地集中在厄瓜多尔沿岸，是目前世界上养殖量最高的三大虾种之一，其壳薄体肥，肉质鲜嫩，味道鲜美，营养丰富。1976年自日本引进中国以来，已在南方IO多个省(市、区)推广养殖，经济效益可观，在我国的淡水养殖中占有重要地位。罗氏沼虾雌雄异体，雄性的生长速率相比于雌性高出10-20%，意味着在生活史的同一阶段，雄性能达到更大的规格。由于雌雄两型性的存在，对其性别进行控制，培育单性群体，可以有效提高单位面积的养殖产量。因此，对罗氏沼虾性别决定机制的探索一直都是 国际上研究的热点和难点。虽然科学家们对于寻找甲壳动物性染色体做出了大量的努力，但由于虾蟹类在进化上的原始性，有丝分裂中期染色体在形态上多呈点状，且数目众多，导致核型分析困难，故在包括罗氏沼虾在内已报道的虾蟹类染色体研究中，均未发现性染色体的存在，性别决定机制仍然是一个谜。获得虾蟹类稳定的性别标记不仅可以帮助我们确定性染色体的有无、揭开性别决定机制的谜团，更可以进一步建立单性养殖的系统，提高养殖产量。近年来，分子标记技术越来越广泛地被应用于奸蟹类性别相关的研究中。利用AFLP (amplified fragmentlength polymorphism)技术已经获得了日本对奸、斑节对奸和中国明对奸的连锁图谱,但性别连锁的标记尚未有报道。(Stephen S Moore, Vicki Whan, Gerard P Davis, KerenByrne,David J. S Hetzel,Nigel Preston. The development and application of geneticmarkers for the Kuruma prawn Penaeus japonicus. Aquaculture. 1999,173 :19-32 ；KateWilson, YutaoLi, Vicki Whan Sigrid Lehnert, Keren Byrne, Stephen Moore, SiripornPongsomboon, Anchalee Tassanakajon， George Rosenberg， Elizabeth Bailment， ZahraFayazi, Jennifer Swan, Matthew Kenway, John Benzie. Genetic mapping of the blacktiger shrimp Penaeus monodon with amplified fragment length polymorphism.Aquaculture. 2002，204 :297-309 ;王伟继，孔杰，董世瑞，等.中国明对虾AFLP分子标记遗传连锁图谱的构建.动物学报，2006，52:575-584)。Li也构建了一个日本对虾的连锁图谱，其中在母系连锁图谱中有一个推测的性别标记，但Li也提出基于连锁不平衡(或称为基因关联)，此推测的标记不一定与性别差异基因相连锁。(Li，Y.，Byrne, K Miggiano, E.，Whan, V. , Moore, S.，Sandy Keys, Crocos P. , Preston N. and Lehnert，S. Genetic mappingof thekuruma prawn Penaeus japonicus using AFLP markers. Aquaculture.2003,219，143-156)。Perez构建了一个南美白对虾性别特异的连锁图谱。(FranklinPerez, Constanza Erazo，Mariuxi Zhinaula，Filip Volckaert, Jorge Calderon.Asex-specific linkage map of the white shrimp PenaeusCLitopenaeus)vannameibasedon AFLP markers. Aquaculture. 2004,242 :105_118)。同样地，Zhang 也构建了南美白对虫下的连锁图谱，在雌性连锁图谱中有一个性别相关的微卫星标记。(Liusuo ZhanR,Changjian Yang,Yang Zhang,Li Li,Xiaoming Zhang,Qingli Zhang and Tianhai Xiang.A genetic linkage map of Pacific white shrimp(Litopenaeus vannamei)sex-linkedmicrosatellite markers and high recombination rates. Genetica,2007 Volume 131，1,37-49,)但是这些通过遗传连锁图谱发现的性别连锁标记没有在其他的个体中进行验证，且很难分辨种群中没有亲缘关系的两性个体。此外，Zhang等使用25对AFLP引物和16对SAMPL引物获得了 2110条条带，但在南美白对虾(Penaeus chiniensis)中并没有筛选获得性别特异的标记(Liusuo Zhang, Xiaoyu Kong, Ziniu Yu, Jie Kong, Limei Chen. Asurvey of genetic changes and search for sex-specific markers by AFLP and SAMPLin a breeding program of Chinese shrimp. Journal of ShellfisheriesResearch,2004,Vol. 23, No. 3,897-901)。Khamnantong等尽管采用256对引物组合筛选了斑节对虾6-10个DNA池，获得了 6个性相关的候选片段，但是PCR结果表明在雌雄基因组中都有阳性扩增，且这些片段与性染色体并不连锁(Bavornlak Khamnamtong, Supaporn Thumrungtanakit,Sirawut Klinbunga, Takashi Aoki, Ikuo Hirono, Piamsak Menasvet, Identification ofSex-specific Expression Markers in the Giant Tiger Shrimp (Penaeus monodon). Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 2006，39 : 1，37-45)。另外，对蟹类性别标记的研究也尚未取得十分可靠的结果。邱涛用对中华绒螯蟹雌雄群体和个体进行RAro分析，虽然获得了雄性特异的候选标记，但是并未进一步验证(邱涛，陆仁后，项超美，张菁，谢浩.用RAro技术识别中华绒螯蟹雌雄差异.水产学报，1998，2，175-177)。王艺磊利用AFLP技术筛选出锯缘青蟹的雌雄差异片段，证明了雌雄基因组间存在着DNA序列上的差异，但是没有将这些差异片段形成真正的分子标记(王艺磊，戴军，姚扬烈，张子平.利用AFLP技术筛选锯缘青蟹雌雄差异DNA片段.中国水产科学.2004年，4，286-290)。基于此，本发明通过分离罗氏沼虾性别特异分子标记，从而进行罗氏沼虾个体的雌雄分子鉴定和性别决定机制研究。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种罗氏沼虾性别特异分子标记的筛选方法。本发明的目的在于，提供一种罗氏沼虾性别特异分子标记。本发明的目的在于，提供一种罗氏沼虾性别特异分子标记的应用。
本发明的目的在于，提供一对特异SCAR引物。本发明克服了目前罗氏沼虾早期雌雄鉴定的困难，该分子标记可以在罗氏沼虾生长发育早期，外观上不能确定其性别时进行准确、稳定的检测，有利于单性养殖系统的建立。本发明主要包括罗氏沼虾DNA的提取，AFLP分析，性别特异片段的克隆，特异性引物的设计，以及性别特异片段可行性的验证等。本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现作为本发明的第一方面，一种罗氏沼虾性别特异分子标记的筛选方法，其特征在 于，包括以下步骤
I罗氏沼虾性别特异分子标记筛选；I. I罗氏沼虾DNA的提取；I 2基因组DNA的AFLP分析；I. 3性别特异分子标记的筛选。2罗氏沼虾性别特异分子标记克隆及其测序；2. I罗氏沼虾性别特异AFLP片段的回收、扩增、纯化；2. 2罗氏沼虾性别特异AFLP片段的克隆；2. 3罗氏沼虾性别特异AFLP片段的序列分析；获得罗氏沼虾性别特异分子标记为MaroF300，其序列为 SEQ ID NO :23。3罗氏沼虾性别特异分子标记的验证；3. I罗氏沼虾性别特异分子标记的SCAR验证。进一步，一种罗氏沼虾性别特异分子标记的筛选方法，具体包括以下步骤I罗氏沼虾性别特异分子标记筛选；I. I罗氏沼虾DNA的提取I. I. IDNA的提取基因组DNA的提取参照《分子克隆实验指南》，用蛋白酶K和苯酚从动物细胞中分离高分子质量DNA的提取方法；取罗氏沼虾肌肉组织约0. 2g，剪碎后加入500ul裂解液(10mmol/LTris-Cl (pH
8.0),0. lmol/L EDTA (pH 8. 0),0. 5% (m/V) SDS，20ug/mg 无 DNase 的胰 RNase，蛋白酶K (20mg/ml)至终浓度100ug/ml)，50° C裂解3小时至澄清。加等体积饱和酚，缓慢摇匀IOmin,于4°C 12000rpm离心15min ;吸取上清液并重复此步骤2次；加入0. 2倍体积10mol/L醋酸氨以及2倍体积的无水乙醇，低温静置30min左右，离心收集沉淀；用70%的乙醇洗涤沉淀两次，并彻底晾干；加入30ul TE溶液置于4°C直至DNA完全溶解；提取基因组DNA后，用分光光度计检测其0D260/0D280值，并用0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检测；其中，所述基因组DNA的浓度应不低于200ng/iil，基因组DNA的纯度要求0D260/0D280 值在 I. 7-1. 9 之间。I 2基因组DNA的AFLP分析基因组DNA的AFLP分析主要包括如下步骤第一步对DNA模板进行酶切，第二步是将双链接头连接到酶切片段上，第三步是进行预扩增，第四步是进行选择性扩增，第五步是电泳分析。I. 2. I酶切反应选取10个罗氏沼虾雄性个体与10个罗氏沼虾雌性个体各200ng分别进行酶切，所选取的个体应满足0D260/0D280比值在I. 7-1. 9之间，且经电泳检测完整性好无降解。
选用酶切组合为EcoRI/Msel，建立IOiil反应体系10XBuffer lyl;基因组DNA 200ng ;内切酶各4个单位；补无菌去离子水到10 ill。37°C酶切5h，65°C 20min灭活。I. 2. 2连接接头双链接头的制备终浓度为5pmol/ U I的EcoRI接头(SEQ ID NO :1 2)和终浓度为 50pmol/u I 的 Msel 接头(SEQ ID NO :3 4)如表 I ；反应条件为95°C，IOmin;75°C，Imin ;7(TC 2min,69. 8°C 2min,69. 6°C 2min，分别设置温度降落 0. 6°C, 33cycles ;50°C 19min ;50°C lmin, 49. 5°C Imin, 49°C lmin,分别设置温度降落 I. 5°C，14cycles ；10°C^连接接头建立20 ill连接体系，包括10 X Buffer 2 yl，酶切片段10 iil，EcoRI、Msel双链接头各I. 5u I, T4连接酶0. 5iil (I. 5U)，补去离子水到20 yl，16°C连接过夜。I. 2. 3 预扩增 建立25ii I 的反应体系10XPCR Buffer 2. 5 u I ；25mM MgCl2 I. 5u I ；2. 5mMdNTP 2 iil，预扩增引物的序列为SEQ ID NO :5 6 (表I)各I yl，Taq DNA聚合酶I. 5U，连有接头的DNA模板I ill，补无菌水到25 ill。反应程序为72°C延伸 2min ;94°C 5min ；94°C 30s, 56°C lmin，72°C lmin，20 个循环；最后72°C延伸IOmin0然后用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切与预扩增结果。I. 2. 4选择性扩增将预扩增产物用无菌去离子水稀释100倍作为选择扩增的模板，采用64对选择性扩增引物组合的序列为SEQ ID NO :7 22 (表2)，64对选择性扩增引物组合(即8个E序列引物与8个M序列引物两两组合，所述引物合成自上海生工生物工程有限公司)。反应体系同预扩增，即反应体系为10XPCR Buffer 2. 5 ；25mMMgCl2 I. 5u I ；
2.5mM dNTP 2 yl，8个E序列引物与8个M序列引物两两组合(浓度为IOuM)(表2)各I yl，Taq DNA聚合酶I. 5U，连有接头的DNA模板I y I，补无菌水到25 yl。反应程序94°C预变性2min ;94°C 30s,65°C 30s,72°C 90s，13 个循环，每个循环复性温度降 0. 7°C ;然后 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 90s，25 个循环；最后 72°C延伸 lOmin。I. 2. 5电泳分析用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。6%的变性胶的配方尿素21g，40%的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺(19 I)
7.5ml, IOXTBE 5ml, 10 % APS 450 u I, TEMED 35 y 1，去离子水 20. 5ml，溶解后体积为50ml。电泳液为I XTBE，恒功率65W预电泳30min，然后上样，上样之前往PCR产物中加入载样缓冲液(98%去离子甲酰胺9. 8ml, IOmMEDTA 0. 2ml,0. 25%溴酚蓝0. 025g，0. 25%二甲苯青0. 025g) 10iil，95°C变性5min，然后迅速插到冰上放置lOmin，取6^1上样。电
泳到适合位置停止。银染电泳结束后待其温度降至室温，揭掉短玻璃板，放入0. I %硝酸银染色15min，取出在蒸馏水中冲洗2-3次，放入显色液(20g氢氧化钠，0. 4g无水碳酸氢钠，蒸馏水900ml, IOml甲醒)中显色至条带清晰可见,取出胶板停止显色反应；I. 3性别特异分子标记的筛选采用64对选择性扩增引物组合的序列为SEQ ID NO :7 22 (表2)卿8个E序列引物与8个M序列引物两两组合，所述引物合成自上海生工生物工程有限公司；对罗氏沼虾个体的基因组DNA进行了 AFLP分析，通过对比分析筛选出一对引物产生了一条性别特异的DNA片段，所述性别特异的DNA片段在雄性个体基因组DNA中不存在，所述性别特异的DNA片段即为性别特异分子标记。进一步，所述性别特异的DNA片段由引物E5-M2扩增所得长度为300bp的雌性特异DNA片段，命名为MaroF300，其序列为SEQ ID NO :23。2罗氏沼虾性别特异分子标记克隆及其测序性别特异AFLP片段是由引物E5M2扩增所得，再经回收、扩增、纯化及克隆、测序。2. I罗氏沼虾性别特异AFLP片段的回收、扩增、纯化；
2. I. I回收用干净无污染的刀片切下性别特异AFLP片段，切碎后加入20 Ul无菌去离子水，650C水浴温育40min，离心回收上清液作为模板。2. I. 2扩增采用E5与M2选择性引物组合扩增，建立体系与反应条件同选择扩
士豳
>曰o即采用E5 (SEQ ID N0:16)与 M2 (SEQ ID NO :9)选择性扩增引物(表 2)。反应体系10X PCR Buffer 2. 5 u I ；25mM MgCl2 I. 5u I ；2. 5mM dNTP2 u 1，E5 弓 I物与M2引物(表I)各I iil，Taq DNA聚合酶I. 5U，含有性别特异片段的DNA模板I yl，补无菌水到25 u I0反应程序94°C预变性2min ;94°C 30s,65°C 30s, 72°C 90s，13 个循环，每个循环复性温度降 0. 7°C ;然后 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 90s，25 个循环；最后 72°C延伸 lOmin。2. I. 3纯化反应完毕后，取5 ill PCR产物在I. 5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，回收目的条带，经普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司)纯化。2. 2罗氏沼虾性别特异AFLP片段的克隆；2. 2. I连接使用T-载体试剂盒(天根生化科技有限公司)经pGM-T载体连接，建立10 ill反应体系，包括纯化产物5 u 1，pGM-T载体I iil，IOXbuffer Iu 1,T4 DNA连接酶I U I，补无菌去离子水至10 V- I，16°C连接过夜。2. 2. 2转化连接产物转化至受体菌株大肠杆菌DH5 a (天根生化科技有限公司)，进行菌落PCR验证，选取阳性克隆。步骤2. 2. 2中PCR的引物为E5与M2 (浓度为IOuM)。反应体系为IOXPCR Buffer 2. 5 u I ；25mM MgCl2 I. 5u I ；2. 5mM dNTP2 u 1，预扩增引物E5与M2 (表I)各I yl，Taq DNA聚合酶I. 5U，补无菌水到25 yl，并加入待验证的菌落模板。反应程序为94°C预变性 2min ;94°C 30s,56°C 30s,72°C 90s，30 个循环，最后72°C延伸 lOmin。2. 3罗氏沼虾性别特异AFLP片段的序列分析将阳性克隆扩大培养，然后进行测序(上海鼎安生物科技有限公司)；获得罗氏沼虾性别特异分子标记为MaroF300，其序列为SEQ ID NO :23。3罗氏沼虾性别特异分子标记的验证3. I罗氏沼虾性别特异分子标记的SCAR验证根据罗氏沼虾性别特异分子标记(MaroF300) (SEQ ID NO :23)的测序结果，经过Primer Premier5. O设计软件优化，设计出一对特异SCAR弓丨物Scar202F与Scar202R :其序列为 SEQ ID NO 24 (F :5，-GGGCAATGATGACTGACT-3，)，SEQ ID NO :25 (R 5’ -TTAGCGCCTGATGGTATG-3’)。
以SCAR弓丨物对罗氏沼虾基因组DNA进行PCR扩增PCR 的引物为 SCAR 引物 Scar202F 与 Scar202R (浓度为 IOuM)。反应体系为10XPCR Buffer 2. 5 u I ；25mM MgCl2 I. 5u I ；2. 5mM dNTP2 u 1，Scar202F与Scar202R引物各I ii 1，Taq DNA聚合酶I. 5U，雌雄个体DNA模板Iul，补无菌水到25 u I0反应程序为94°C 预变性 2min ;94°C 30s, 57 °C 30s, 72 °C 90s，30 个循环，最后72°C延伸 lOmin。作为本发明的第二方面，一种罗氏沼虾性别特异分子标记，其特征在于，所述分子标记为MaroF300，其序列为SEQ ID NO :23。作为本发明的第三方面，一种罗氏沼虾性别特异分子标记的应用，所述分子标记用于罗氏沼虾性别的鉴定。作为本发明的第四方面，一种罗氏沼虾遗传性别鉴定方法，包括以下步骤a.罗氏沼虾DNA的提取；b.使用弓丨物组合进行AFLP分析；c.电泳证实DNA条带的有无，在雌性罗氏沼虾中扩增出性别特异片段。其中，所述引物选用E5 (SEQ ID NO 16)与M2 (SEQ ID NO 9)选择性扩增引物，在雌性罗氏沼虾中扩增出300bp的性别特异片段。其中，所述弓I物选用SCAR引物，所述SCAR引物为Scar202F与Scar202R，其序列为SEQ ID NO :24和SEQ ID NO :25，在雌性罗氏沼虾中扩增出202bp的性别特异片段。以所述SCAR引物对罗氏沼虾基因组DNA进行PCR扩增，退火温度为57°C。作为本发明的第五方面，一对特异SCAR引物Scar202F与Scar202R :其序列为SEQID NO 24 F :5’ -GGGCAATGATGACTGACT-3’，SEQ ID NO 25R :5’ -TTAGCGCCTGATGGTATG-3’。本发明的有益效果本发明从罗氏沼虾基因组中分离出性别特异分子标记，为一段300bp的DNA片段，该分子标记稳定，可靠，可用于罗氏沼虾的性别检测。在罗氏沼虾生长发育早期，外观上不能确定其性别时，利用该分子标记可以准确检测罗氏沼虾的性别，有利于单性养殖系统的建立，从而提高产量。利用该分子标记，进行进一步研究，尝试该分子标记在染色体上定位，作为今后罗氏沼虾性染色体研究的基础研究，为探讨性别决定机制提供了有利的工具。
图I罗氏沼虾雌雄基因组DNA的AFLP的分析结果表示引物组合E5M2的扩增产物；M表示IOObp DNA分子量标准。图2罗氏沼虾性别特异分子标记(MaroF300)的核苷酸序列，两端的下划直线分别表示引物E5序列与M2序列，下划波浪线分别表示SCAR引物Scar202F与Scar202R序列。图3特异引物Scar202F与Scar202R对罗氏沼虾雌雄基因组DNA的SCAR验证结果。M为IOObp DNA分子量标准；Male为雄性个体，Female为雌性个体。
具体实施方式
、
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南》(科学出版社，第三版，2002年)中所述的条件或厂商提供的条件进行。实施例I、利用AFLP方法获得罗氏沼虾性别特异分子标记材料罗氏沼虾雌、雄各39只，购自上海浦东新区果园农贸市场，取罗氏沼虾尾扇处肌肉，迅速放入液氮中速冻，后置于-800C下保存备用。罗氏沼虾雌雄的鉴别罗氏沼虾雌雄异体，两性的特征可以用肉眼在外形上加以区别雌虾个体小于雄虾；成熟的雌虾卵巢发达，透过头胸甲可见雌虾橙黄色的卵巢。
雄性第二对步足特别长大，大大超过身体的长度，呈蔚蓝色；雄虾的第二游泳足的内肢内侧，除具一内附肢外，还有一棒状的雄性附肢，雌虾无雌性附肢。方法I罗氏沼虾性别特异分子标记筛选；I. I罗氏沼虾DNA的提取I. I. IDNA的提取基因组DNA的提取参照《分子克隆实验指南》。用蛋白酶K和苯酚从动物细胞中分离高分子质量DNA的提取方法。取罗氏沼虾肌肉组织约0. 2g，剪碎后加入500ul裂解液(10mmol/LTris-Cl (pH
8.0),0. lmol/L EDTA (pH 8. 0),0. 5% (m/V) SDS，20ug/mg 无 DNase 的胰 RNase，蛋白酶K (20mg/ml)至终浓度100ug/ml)，50° C裂解3小时至澄清。加等体积饱和酚，缓慢摇匀IOmin,于4°C 12000rpm离心15min ;吸取上清液并重复此步骤2次。加入0. 2倍体积10mol/L醋酸氨以及2倍体积的无水乙醇，低温静置30min左右，离心收集沉淀。用70%的乙醇洗涤沉淀两次，并彻底晾干。加入30ul TE溶液置于4°C直至DNA
完全溶解。提取基因组DNA后，用分光光度计检测其0D260/0D280值，并用0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检测。其中，所述基因组DNA的浓度应不低于200ng/ul，基因组DNA的纯度要求0D260/0D280 值在 I. 7-1. 9 之间。I 2基因组DNA的AFLP分析基因组DNA的AFLP分析主要包括如下步骤第一步对DNA模板进行酶切，第二步是将双链接头连接到酶切片段上，第三步是进行预扩增，第四步是进行选择性扩增，第五步是电泳分析。1.2. I酶切反应选取10个罗氏沼虾雄性个体与10个罗氏沼虾雌性个体各200ng分别进行酶切，所选取的个体应满足0D260/0D280比值在I. 7-1. 9之间，且经电泳检测完整性好无降解。选用酶切组合为EcoRI/Msel，建立IOiil反应体系10XBuffer lyl;基因组DNA 200ng ;内切酶各4个单位；补无菌去离子水到10 ill。37°C酶切5h，65°C 20min灭活。I. 2. 2连接接头
双链接头的制备终浓度为5pmol/iil的EcoRI接头(SEQ ID NO 1 2)和终浓度为 50pmol/u I 的 Msel 接头(SEQ ID NO 3 4)如表 I。反应条件为95°C，IOmin;75°C，lmin ;7(TC 2min,69. 8°C 2min,69. 6°C 2min，分别设置温度降落 0. 6°C, 33cycles ;50°C 19min ；50°C lmin, 49. 5°C lmin, 49°C lmin,分别设置温度降落 I. 5°C，14cycles ；10°C^连接接头建立20 ill 连接体系，包括10 X Buffer 2 yl，酶切片段10 iil，EcoRI、Msel双链接头各I. 5 u I, T4连接酶(I. 5U)0. 5iil，补去离子水到20 yl，16°C连接过夜。1.2. 3 预扩增建立25ii I 的反应体系10XPCR Buffer 2. 5 u I ；25mM MgCl2 I. 5u I ；2. 5mMdNTP 2 iil，预扩增引物的序列为SEQ ID NO :5 6 (表I)各I yl，Taq DNA聚合酶I. 5U，连有接头的DNA模板I ill，补无菌水到25 ill。反应程序为72°C延伸 2min ;94°C 5min ；94°C 30s, 56°C lmin，72°C lmin，20 个循环；最后72°C延伸IOmin0然后用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切与预扩增结果。1.2. 4选择性扩增将预扩增产物用无菌去离子水稀释100倍作为选择扩增的模板，采用64对选择性扩增引物组合的序列为SEQ ID NO :7 22 (表2)，64对选择性扩增引物组合(即8个E序列引物与8个M序列引物两两组合，所述引物合成自上海生工生物工程有限公司)。反应体系同预扩增，即反应体系10XPCRBuffer 2. 5 u I ；25mMMgCl2 I. 5u I ；
2.5mM dNTP 2 yl，8个E序列引物与8个M序列引物两两组合成为64对弓I物组合(浓度为10uM)，(表2)各liil，Taq DNA聚合酶I. 5U，连有接头的DNA模板I yl，补无菌水到25 yl。反应程序94°C预变性2min ;94°C 30s,65°C 30s, 72°C 90s，13 个循环，每个循环复性温度降 0. 7°C ;然后 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 90s，25 个循环；最后 72°C延伸 lOmin。1.2. 5电泳分析用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。6%的变性胶的配方尿素21g，40%的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺(19 I)
7.5ml, IOXTBE 5ml, 10 % APS 450 u I, TEMED 35 y 1，去离子水 20. 5ml，溶解后体积为50ml。电泳液为1\18￡，恒功率651预电泳301^11，然后上样，上样前在？0 产物中加入载样缓冲液(98%去离子甲酰胺9. 8ml, IOmM EDTAO. 2ml, 0. 25%溴酚蓝0. 025g，0. 25%二甲苯青0. 025g) 10111，951变性5111111，然后迅速插到冰上放置lOmin，取6iil上样。电泳
到适合位置停止。银染电泳结束后待其温度降至室温，揭掉短玻璃板，放入0. I %硝酸银染色15min，取出在蒸馏水中冲洗2-3次，放入显色液(20g氢氧化钠，0. 4g无水碳酸氢钠，蒸馏水990ml, IOml甲醒)中显色至条带清晰可见,取出胶板停止显色反应。2罗氏沼虾性别特异分子标记的克隆及其测序此性别特异AFLP片段是由引物E5M2扩增所得，再经回收、扩增、纯化、克隆及测序。2. I罗氏沼虾性别特异AFLP片段的回收、扩增、纯化；
2. I. I回收用干净无污染的刀片切下性别特异AFLP片段，切碎后加入20 Ul无菌去离子水，650C水浴温育40min，离心回收上清液作为模板。2. I. 2扩增用E5 (SEQ ID NO : 16)与M2 (SEQ ID NO :9)选择性引物组合扩增放大，建立体系与反应条件同选择扩增，即采用E5 (SEQ ID N0:16)与 M2 (SEQ ID NO :9)选择性扩增引物(表 2)。反应体系10XPCRBuffer 2. 5 u I ；25mM MgCl2 I. 5u I ；2. 5mM dNTP2 u 1，E5 与M2引物各I iil，Taq DNA聚合酶I. 5U，含有性别特异片段的DNA模板I yl，补无菌水到25 u I。反应程序94°C预变性2min ;94°C 30s,65°C 30s, 72°C 90s，13 个循环，每个循环 复性温度降 0. 7°C ;然后 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 90s，25 个循环；最后 72°C延伸 lOmin。2. I. 3纯化反应完毕后，取5 U I PCR产物在I. 5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，回收目的条带，经普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司)纯化。2. 2罗氏沼虾性别特异AFLP片段的克隆2. 2. I连接使用T-载体试剂盒(天根生化科技有限公司)经pGM-T载体连接，建IOiU反应体系，包括纯化产物5 iil，pGM-T载体I ill，10Xbuffer Iu I, T4 DNA连接酶I V- I，补无菌去离子水至10 V- I，16°C连接过夜。2. 2. 2转化连接产物转化至受体菌株大肠杆菌DH5 a (天根生化科技有限公司)，进行菌落PCR验证，选取阳性克隆。步骤2. 2. 2中PCR的引物为E5与M2 (浓度为IOuM)。反应体系为IOXPCR Buffer 2. 5 ii I ;25mM MgCl2 I. 5 y I ;2. 5mM dNTP2 y 1，E5 弓I物与M2引物各I ii 1，Taq DNA聚合酶I. 5U，补无菌水到25 U 1，并加入待验证的菌落模板。反应程序为94°C 预变性 2min ;94°C 30s，56°C 30s, 72 °C 90s，30 个循环，最后72°C延伸 lOmin。2. 3罗氏沼虾性别特异AFLP片段的序列分析将阳性克隆扩大培养，然后进行测序(上海鼎安生物科技有限公司)；获得罗氏沼虾性别特异分子标记为MaroF300，其序列为SEQ ID NO :23。对罗氏沼虾雌雄基因组DNA进行筛选后得到一条性别特异AFLP片段(简称性别特异片段)，在试供的10个雌性个体中可检测到此性别特异AFLP片段，而在10个雄性个体中未能检测到此性别特异AFLP片段(图1)，图I为引物E5M2对罗氏沼虾雌雄基因组DNA的AFLP的扩增结果。此性别特异AFLP片段特异片段是由引物E5M2组合扩增所得，经回收、扩增、纯化及克隆、测序结果表明性别特异AFLP片段长度为262bp，包含两端的E5M2引物长度为300bp (图2)，图2为性别特异AFLP片段(MaroF300)的序列，两端的下划线分别表示E5序列与M2序列，此序列为SEQ ID NO 23 (图2)具有与E5与M2相同的核苷酸序列。该性别特异AFLP片段(MaroF300)，称为罗氏沼虾性别特异分子标记(MaroF300)。表IAFLP接头及引物序列(合成自上海生工生物工程有限公司)
权利要求
1. 一种罗氏沼虾性别特异分子标记的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤 I罗氏沼虾性别特异分子标记筛选； I. I罗氏沼虾DNA的提取； I. 2基因组DNA的AFLP分析； 1.3性别特异分子标记的筛选。
2.根据权利要求I所述的分子标记，其特征在于，所述筛选方法，具体包括以下步骤 I罗氏沼虾性别特异分子标记筛选； I. I罗氏沼虾DNA的提取 I. I. IDNA的提取基因组DNA的提取，用蛋白酶K和苯酚从动物细胞中分离高分子质量DNA的提取方法； 提取基因组DNA后，用分光光度计检测其OD值，并用0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检测； I. 2基因组DNA的AFLP分析 基因组DNA的AFLP分析主要包括如下步骤第一步对DNA模板进行酶切反应，第二步是将双链接头连接到酶切片段上，第三步是进行预扩增，第四步是进行选择性扩增，第五步是电泳分析； I.2. I酶切反应 选取10个罗氏沼虾雄性个体与10个罗氏沼虾雌性个体各200ng分别进行酶切，所选取的个体应满足0D260/0D280比值在I. 7-1. 9之间，且经电泳检测完整性好无降解； 选用酶切组合为EcoRI/Msel，建立IOyl反应体系10XBuffer Iul ;基因组DNA200ng ;内切酶各4个单位；补无菌去离子水到IOiU ;37°C酶切5h，65°C 20min灭活； I.2. 2连接接头 双链接头的制备终浓度为5pm0l/iil的EcoRI接头(SEQ ID NO 1 2)和终浓度为50pmol/u I 的 Msel 接头(SEQ ID NO :3 4); I.2. 3预扩增建立 25ii I 的反应体系10XPCR Buffer 2. 5 u I ；25mM MgCl2 I. 5u I ；2. 5mM dNTP2iil，预扩增引物的序列为SEQ ID NO :5 6，各I iil，TaqDNA聚合酶I. 5U，连有接头的DNA模板Iu 1，补无菌水到25u I ； 然后用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切与预扩增结果； I.2. 4选择性扩增 将预扩增产物用无菌去离子水稀释100倍作为选择扩增的模板，采用64对选择性扩增引物组合的序列为SEQ ID NO 7 22，64对选择性扩增引物组合，即8个E序列引物与8个M序列引物两两组合； I.2. 5电泳分析 用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测； 银染电泳结束后待其温度降至室温，揭掉短玻璃板，放入0. I %硝酸银染色15min，取出在蒸馏水中冲洗2-3次，放入显色液中显色至条带清晰可见，取出胶板停止显色反应； I.3性别特异分子标记的筛选 采用64对选择性扩增引物组合的序列为SEQ ID NO :7 22，即8个E序列引物与8个M序列引物两两组合，所述引物合成自上海生工生物工程有限公司；对罗氏沼虾个体的基因组DNA进行了 AFLP分析，通过对比分析筛选出一个引物对产生了一条性别特异的DNA片段，所述性别特异的DNA片段在雄性个体基因组DNA中不存在，所述性别特异的DNA片段即为性别特异分子标记。
3.根据权利要求2所述的分子标记，其特征在于，所述基因组DNA的浓度应不低于200ng/iil，基因组DNA的纯度要求0D260/0D280值在I. 7-1. 9之间。
4.根据权利要求2所述的分子标记，其特征在于，步骤I.2. I中，罗氏沼虾个体DNA0D260/0D280比值在I. 7-1. 9之间，且经电泳检测完整性好无降解的个体。
5.根据权利要求2所述的分子标记，其特征在于，步骤I.3中，所述性别特异的DNA片段由引物E5-M2扩增所得长度为300bp的雌雄特异DNA片段，命名为MaroF300，其序列为SEQ ID NO :23。
6.一种如权利要求I所述的罗氏沼虾性别特异分子标记，其特征在于，所述分子标记为 MaroF300，其序列为 SEQ ID NO :23。
7.—种如权利要求6所述的罗氏沼虾性别特异分子标记的应用，所述分子标记用于罗氏沼虾性别的鉴定。
8.—种如权利要求I 7任一项所述的罗氏沼虾遗传性别鉴定方法，包括以下步骤 a.罗氏沼虾DNA的提取； b.使用引物组合进行AFLP分析； c.电泳证实DNA条带的有无，在雌性罗氏沼虾中扩增出性别特异片段。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述引物选用E5与M2选择性扩增引物，其序列为SEQ ID N0:16与SEQ ID NO :9，在雌性罗氏沼虾中扩增出300bp的性别特异片段。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述引物选用SCAR引物，所述SCAR引物为Scar202F与Scar202R，其序列为SEQ ID NO 24和SEQ ID NO :25，在雌性罗氏沼虾中扩增出202bp的性别特异片段。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述SCAR引物对罗氏沼虾基因组DNA进行PCR扩增，退火温度为57°C。
12.一对特异 SCAR 引物，为 Scar202F 与 Scar202R，其序列为 SEQ ID NO:24 和 SEQ IDNO :25。
全文摘要
本发明公开了一种罗氏沼虾性别特异的分子标记，在罗氏沼虾基因组中，分离了一段300bp的DNA片段，其序列为SEQ ID NO23，可用于罗氏沼虾性别的检测。性别特异分子标记的筛选方法，包括罗氏沼虾DNA的提取，AFLP分析，性别特异片段的克隆，特异性引物的设计，以及性别特异片段可行性的检测等。本发明筛选到了罗氏沼虾雌性特异的分子标记，建立了罗氏沼虾遗传性别鉴定方法，所获得的分子标记可以在罗氏沼虾生长发育早期，外观上不能确定其性别时进行准确、稳定的检测，有利于单性养殖系统的建立，从而提高产量。在罗氏沼虾基因组中获得的此雌性特异片段，为其在染色体上的定位提供了必要条件。
文档编号C12N15/11GK102719531SQ20121014261
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月9日 优先权日2012年5月9日
发明者丘高峰, 吕慧锋, 江学慧 申请人:上海海洋大学