专利名称：一种黄牛fbxo32基因单核苷酸多态性及作为分子标记的检测方法
技术领域：
本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种检测黄牛FBX032基因单核苷酸多态性的方法。
背景技术：
单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP(coding SNP,cSNP)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注。然而随着科学的发展，很多研究表明位于基因内含子中的SNP会影响基因的转录效率从而间接 的影响基因的功能，所以内含子的多态性也引起了关注。单核苷酸多态性是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据。近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、直接测序技术和PCR-RFLP等，但SSCP操作繁琐、耗时长，结果易造成误判；而直接测序技术成本又较高。因此，把构建DNA池进行测序和PCR-RFLP结合在一起的方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了 SSCP费用昂贵、繁琐操作、假阳性率高的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。FBX032蛋白是F-box蛋白家族的成员，是泛素蛋白连接酶复合体组成之一。目前，对于FBX032基因的研究多在人类和小鼠上，主要在肌肉的代谢过程以及相关疾病发生机理等方面做了大量研究。国内外尚未见关于牛FBX032基因遗传变异的研究。中国黄牛FBX032基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因位点的功能研究及其遗传变异与经济性状(如体斜长和日增重等性状)关联的研究仍是空白。由于FBX032基因功能涉及日增重等生长性状，本发明提供的检测方法为FBX032基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
发明内容
本发明解决的问题在于利用PCR-RFLP和ACRS-PCR-RFLP方法检测黄牛FBX032基因的多态性，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。本发明是通过以下技术方案来实现—种黄牛FBX032基因单核苷酸多态性及作为生长性状分子标记的检测方法，以包含FBX032基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2、P3为引物，PCR扩增黄牛FBX032基因部分片段；用限制性内切酶Haelll、HaeIII, BfaI分别消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛FBX032基因第22830位、第44675位、第53423位的单核苷酸多态性。所述的引物对Pl为上游引物5'CAGGTCCCCGTCCATCAGTC 3'下游引物5'GGAAGCGTTTCCAGCCATCGGC 3'所述的引物对P2为 上游引物5'GGCCCTGTCTGCCATTTATCT 3'下游引物5'TTCCATCCACTCACATTCCCT 3'所述的引物对P3为上游引物5'CCAAACAGTCACCGCATCTCC 3'下游引物5'AGGGCCTGCATCAGTCTTACC 3'所述的PCR扩增反应程序为94°C 预变性 5min ；34 个循环94°C变性 30s，Tni (分别为 66°C，58. 5°C，64. 7°C )退火 30s，72°C延伸30s ；72 延伸 IOmin。所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛FBX032基因第22830位的单核苷酸多态性为AA基因型表现为长度为131bp的一条带；AG基因型表现为长度分别为131bp、IlObp和2Ibp的三条带；GG基因型表现为长度分别为IlObp和2Ibp的两条带。第44675位的单核苷酸多态性为TT基因型表现为长度为331bp的一条带；TC基因型表现为长度分别为331bp、257bp和74bp的三条带；CC基因型表现为长度分别为257bp和74bp的两条带。第53423位的单核苷酸多态性为GG基因型表现为长度为587bp的一条带；AG基因型表现为长度分别为587bp、450bp和137bp的三条带；AA基因型表现为长度分别为450bp和137bp的两条带。本发明根据FBX032基因的序列设计引物，分别以6种黄牛品种构建的基因组DNA池为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，测序后得到黄牛FBX032基因的部分序列，与NCBI公布的序列进行比较发现在第22830位、第44675位、第53423位存在单核苷酸多态性。针对上述三处SNP多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，通过设计特定的弓I物进行PCR扩增，并用特定的限制性内切酶酶切PCR产物鉴定，能够简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。本发明对6个黄牛品种的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP位点与南阳牛部分生长性状(体重和日增重等)进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高黄牛生长性状的分子标记。
图I为黄牛FBX032基因酶切电泳结果图，其中图la、lb、lc、分别为黄牛FBX032基因包含第22830位、第44675位、第53423位的多态位点PCR产物的酶切电泳结果。
图2为黄牛FBX032基因SNP多态性测序结果图，其中图2a、2b、2c分别为黄牛FBX032基因包含第22830位、第44675位、第53423位多态位点的测序结果图，不同颜色的曲线代表不同的碱基(蓝线表示C碱基的测序峰，红线代表T碱基的测序峰；黑线代表G碱基的测序峰；绿线代表A喊基的测序峰)。图3为黄牛FBX032基因部分DNA序列图，其中图3a、3b、3c分别为黄牛FBX032基因包含第22830位、第44675位、第53423位的多态位点的DNA片段图。
具体实施例方式本发明利用PCR-RFLP和ACRS-PCR-RFLP方法对黄牛FBX032基因第22830位、第44675位、第53423位的单核苷酸多态性进行检测和关联分析，下面对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明
的解释而不是限定。a、黄牛FBX032基因含第3外显子、第8内含子和第10内含子PCR引物的设计以NCBI所公布的牛序列(NC_007312. 4)为参考，利用Primer 5. O设计能够扩增分别包含黄牛FBX032基因第3外显子、第8内含子和第10内含子的PCR引物。扩增第3外显子的引物为上游引物5'CGACCCTCTACCGTGCGTTCC 3'下游引物5'GGGCTCCCTCCTCACCCTGTT 3'扩增第8内含子的引物为上游引物5'GGCCCTGTCTGCCATTTATCT 3'下游引物5'TTCCATCCACTCACATTCCCT 3'扩增第10内含子的引物为上游引物5'CCAAACAGTCACCGCATCTCC 3'下游引物5'AGGGCCTGCATCAGTCTTACC 3'以上述引物对黄牛基因组扩增，分别扩增包含黄牛FBX032基因(NC_007312. 4)第3外显子、第8内含子和第10内含子的DNA片段，对扩增的片段进行测序鉴定后发现在第3外显子存在一处SNP(NC_007312. 4 22830A > G)，在第8内含子存在一处SNP (NC_007312. 4 44675T > C)，在第 10 内含子存在一处 SNP (NC_007312. 4 53463G > A)。经过分析，以上第3外显子处SNP不存在天然酶切位点，因此，通过设计引物Pl对该处SNP引入HaeIII酶切位点。b、以引物P进行PCR扩增待测黄牛的FBX032基因片段I、黄牛样本的采集本发明具体以7个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表I :表I黄牛样本的采集
权利要求
1.一种黄牛FBX032基因单核苷酸多态性及作为分子标记的检测方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)以包含FBX032基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2、P3为引物，PCR扩增黄牛FBX032基因部分片段， 所述的引物对Pl为 上游引物5' CAGGTCCCCGTCCATCAGTC 3' 下游引物5' GGAAGCGTTTCCAGCCATCGGC 3' 所述的引物对P2为 上游引物5' GGCCCTGTCTGCCATTTATCT 3' 下游引物5' TTCCATCCACTCACATTCCCT 3' 所述的引物对P3为 上游引物5' CCAAACAGTCACCGCATCTCC 3' 下游引物5' AGGGCCTGCATCAGTCTTACC 3' 上述引物对在FBX032基因(NCBI參考序列号NC_007312. 4)中的位置如下 Pl :上游引物322bp 341bp ;下游引物431bp 452bp ； P2 :上游引物738bp 758bp ;下游引物1049bp 1069bp ； P3 :上游引物53299bp 53319bp ;下游引物53855bp 53875bp ； (2)以限制性内切酶HaeIII、HaeIII、BfaI分别消化PCR扩增产物之后； (3)对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛FBX032基因(NCBI參考序列号NC_007312. 4)第22830位、第44675位、第53423位的单核苷酸多态性。
2.根据权利要求I所述的检测黄牛FBX032基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为 94°C预变性5min ；34 个循环94°C变性 30s, T111 (分别为 66°C, 58. 5°C,64. 7V )退火 30s，72°C延伸 30s ；72°C延伸 lOmin。
3.根据权利要求I所述的检测黄牛FBX032基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶的质量浓度分别为3. 5%、2. O%、2. O%。
4.根据权利要求I所述的检测黄牛FBX032基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛FBX032基因第22830位的单核苷酸多态性为AA基因型表现为长度为131bp的一条带；AG基因型表现为长度分别为131bp、IlObp和21bp的三条带；GG基因型表现为长度分别为IlObp和21bp的两条带。
5.根据权利要求I所述的检测黄牛FBX032基因单核苷酸多态性的方法，第44675位的单核苷酸多态性为TT基因型表现为长度为331bp的一条带；TC基因型表现为长度分别为331bp、257bp和74bp的三条带；CC基因型表现为长度分别为257bp和74bp的两条带。
6.根据权利要求I所述的检测黄牛FBX032基因单核苷酸多态性的方法，第53423位的单核苷酸多态性为GG基因型表现为长度为587bp的一条带；AG基因型表现为长度分别为587bp、450bp和137bp的三条带；AA基因型表现为长度分别为450bp和137bp的两条带。
7.根据权利要求I至6中任意一项权利要求所述的检测黄牛FBX032基因单核苷酸多态性的方法在鉴定不同黄牛群体多态性中的诊断应用。
8.根据权利要求7所述的诊断应用，其特征在干，鉴定不同黄牛多态性，黄牛FBX032基因第22830位和第53423位的SNP作为在黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，第44675位的CC基因型为提高黄牛体斜长、胸围、坐骨端宽和日增重的候选分子遗传标记。
全文摘要
本发明公开了一种黄牛FBXO32(F-boxprotein 32)基因单核苷酸多态性及作为分子标记的检测方法。以包含FBXO32基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P(P1、P2、P3)为引物，PCR扩增黄牛FBXO32基因；用限制性内切酶HaeIII、HaeIII、BfaI分别消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛FBXO32基因(NCBI参考序列号NC_007312.4)第22830位、第44675位、第53423位的单核苷酸多态性。本发明提供的检测方法为FBXO32基因的单核苷酸多态性与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
文档编号C12N15/11GK102816836SQ20121014225
公开日2012年12月12日 申请日期2012年5月9日 优先权日2012年5月9日
发明者陈宏 , 王爱兰, 蓝贤勇 申请人:西北农林科技大学