专利名称：一种酶活性及热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种谷氨酰胺转氨酶，特别是ー种酶活性及热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶。
背景技术：
微生物谷氨酰胺转胺酶(蛋白质-谷氨酸-谷氨酰胺转胺酶，Microbial Transglutaminase, EC2. 3. 2. 13简称MTG)其生物学功能是直接改变蛋白质本身以及蛋白质所附着的细胞、组织等的结构与功能性质的特性，提高蛋白质的营养价值。因此，MTG在食品、纺织、生物制药等领域有着广泛的应用前景。但由于MTG自身的一些缺陷如比酶活、热稳定性等因素，限制了 MTG的应用范围。因此基于已得到的MTG在大肠杆菌中的表达平台，利用氨基酸缺失和饱和突变，对MTG进行分子改造，以期得到酶学性质更适合エ业应用的 MTG。
发明内容
为改善MTG比酶活低，热稳定性差的现状，本研究通过对MTG的N端氨基酸进行缺失，从而降低底物与MTG活性中心的结合阻力，提高MTG对底物的亲和能力。对得到比酶活提高的突变株继续利用饱和突变，改变MTG内部氨基酸之间的极性作用，继而提高MTG比酶活和热稳定性。本研究提供一种新的改造思路，结合理性设计和饱和突变，提高改造效率，并得到了比酶活和热稳定都提高的突变株。在前期研究中，本研究室筛选出一株新的产谷氨酰胺转胺酶的菌株(Streptomyces hygroscopicus CCTCC NO. M203062),通过基因克隆方法，得到了 MTG基因序列及其上下游序列，含MTG自身的启动子和终止子(Genebank EU477523 )，并实现了 MTG和其酶原区在大肠杆菌中的高效表达(Liu S，Zhang D, Wang M, Cui ff, ChenK, Liu Y, Du G, Chen J, Zhou Z (2011)The pro-region of Streptomyces hygroscopicustransglutaminase affects its secretion by Escherichia coll. FEMb Microbiol Lett324(2) :98-105)。基于大肠杆菌构建平台，我们对MTG成熟酶N端氨基酸进行缺失和饱和突变，得到了酶学性质较好的突变株。本发明所用到的培养基LB 培养基胰蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaCl 10g/L, pH 7. O ；TB 培养基蛋白胨 12g/L，酵母膏 24g/L，甘油 8g/L，17mmol/L KH2PO4, 7 2mmo I/LK2HPO4。本发明中谷氨酰胺转胺酶活力的測定比色法测定酶活以N- a -CBZ-GLN-GLY为作用底物，L-谷氨酸-Y单羟胺酸做标准曲线。I个单位谷氨酰胺转胺酶酶活定义为37C时每分钟催化形成I μ mol L-谷氨酸-Y单羟胺酸的酶量(U/mL)。试剂A :IOOmg 的 N a -CBZ-GLN-GLY 溶解于 2mL 0. 2moL/L 的 NaOH 溶液中，加入O. 2mol/L pH6. O 的 Tris-HC 缓冲液 4mL，0. lmol/L 羟胺 2mL，0. Olmol/L 的还原型谷胱甘肽2mL,并调节pH至6. O。试剂 B 3mol/L 的 HCL, 12%TCA, 5%FeCL3 按 I : I : I 混合。配制0-4 μ mol/mL的L-谷氨酸-Y -单异羟肟酸标准溶液。取ImL试剂A与O. 4mL不同浓度的L-谷氨酸-Y -单异羟肟酸标准溶液混合，37°C水浴10分钟。加O. 4mL试剂B終止反应，在525nm比色，绘制出标准曲线。以O. 4mL经适当稀释的酶液代替标准溶液，在相同条件下保温和比色，从标准曲线求出酶活。以100C加热10分钟的离心后的上清液为空白。酶活力(u/mL) = (6. 8548XOD525-O. 0164) X 稀释倍数本发明以MTG在大肠杆菌中的高效表达为改造平台，对MTG成熟酶N端氨基酸进行缺失和饱和突变，得到了酶学性质较好的突变株，比酶活提高I. 85倍，热稳定性提高2. 7倍。改造后的酶更适合エ业应用，可降低生产成本，提高生产效率。
图IS. hygroscopicus来源MTG晶体结构模拟图2TGase N端缺失发酵上清(A)和纯化蛋白SDS-PAGE(B)图3饱和突变株发酵上清酶活和热稳定性检测表IMTG发酵上清酶活和TGase酶学性质表2MTG突变株酶学性质
具体实施例方式实施例I :吸水链霉菌来源MTG晶体结构模拟以已报道的S. mobaraensis的TGase晶体结构为模板，在swiss-model网站(http: // swissmodel. expasy. org/)模拟 S. hygroscopicus TGase 的晶体结构，如图 I 所
/Jn ο实施例2 :高活性突变株的获得(Dell-4)I、利用定点突变试剂盒(TaKaRa)，分别缺失N端的7个氨基酸(Asp UAla 2、Ala
3、Asp 4、Glu 5、Arg 6、Val 7)，缺失ー个氨基酸命名为Del I，以此类推，缺失前七个氨基酸命名为Dell-7，转化子由上海生エ进行测序。2、将测序正确的质粒，转化E. coli BL 21，挑选转化子接种到LB液体培养基中，37°C，培养12h，转接到TB培养基中，接种量为3%。菌体长到OD6tltl为2时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到20°C，培养48h。3、收集发酵上清，检测发酵上清酶活，并对样品进行His-镍柱纯化，纯化蛋白电泳如图2所示。 4、对纯化的蛋白的比酶活和Km值进行測定，结果如表I所示。实验结果表明Del1，比酶活有提高，但Del 1-2酶活明显降低，当缺失到Del l_3、Del 1_4的酶活得到明显提高，而缺失到Del 1-5,Del 1_6酶活降低，到Del 1_7则检测不到酶活。对缺失后的序列在swiss-model中模拟晶体结构，如图3所示，由于是N端氨基酸的缺失，TGase结构基本没变，但是对于N端loop结构的位置影响比较大，Del UDel 1-3, Del 1-4, Del 1_5的N端都有活性中心上游转移到了ー侧，而Del 1-2的loop则仍在活性中心上游，且更靠近活性中心，同时检测Km值，Del 1-2的Km值偏大，说明缺失N端1_2影响了 TGase与底物的结
合能力，而Del 1-3、Del 1-4的Km值和对照相比偏小，说明N端由活性中心上游转移到一
侦牝有助于底物的结合。表I MTG发酵上清酶活和TGase酶学性质
权利要求
1.一种酶活性及热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ IDNO. I所示。
2.权利要求I所述的谷氨酰胺转氨酶，其特征在于还可以为第一位的氨基酸由E突变为D。
3.制备权利要求I所述谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于以含有S.hygroscopicusTGase的载体为材料，利用定点突变试剂盒获得SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列，突变后的载体转化大肠杆菌，发酵纯化后获得权利要求I所述的酶活性及热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶。
全文摘要
本发明公开了一种酶活性提高的谷氨酰胺转氨酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明以MTG在大肠杆菌中的高效表达为改造平台，对MTG成熟酶N端氨基酸进行缺失和饱和突变，得到了酶学性质较好的突变株，比酶活提高1.85倍，热稳定性提高2.7倍。改造后的酶更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。
文档编号C12R1/55GK102660515SQ201210145179
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者刘松, 堵国成, 张东旭, 陈坚, 陈康康, 马建龙 申请人:江南大学