一种从发酵液中连续提取谷氨酰胺转氨酶的方法
【专利摘要】一种从发酵液中连续提取谷氨酰胺转氨酶的方法，属于生物工程领域。发酵结束后发酵罐中通入无菌压缩空气，将发酵液从发酵罐中导出到陶瓷复合膜设备，除去菌体和杂质后的发酵液导入膜分离设备，超滤浓缩。以上各设备间以带流量控制阀门的管路相连接，设定参数后可连续运行，无需人员参与。浓缩后发酵液加入辅料后依次经溶剂沉淀、离心分离、再次加入辅料、真空干燥的步骤，得到谷氨酰胺转氨酶酶粉。本发明的优点是工艺合理连续、设备简单、操作简便、成本低廉，易于工业放大。本发明解决了不需要传统提取中盐析、透析、离子交换柱分离等步骤，易于工业化应用的技术问题。
【专利说明】一种从发酵液中连续提取谷氨酰胺转氨酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种从发酵液中连续提取谷氨酰胺转氨酶的方法，属于生物工程领域。
【背景技术】
[0002]谷氨酰胺转胺酶(蛋白质一谷氨酸一谷氨酰胺转移酶，Transglutaminase,简称TG, EC2.3.2.13)，又称转谷氨酰胺酶，是一种催化蛋白质或多肽中谷氨酰胺残基的酰基转移反应的转移酶。由于能催化许多蛋白质进行共价交联聚合，改善各种蛋白质的功能特性，在食品工业、纺织工业和医药工业上具有广泛的应用前景及优势，被认为是用于生产新型蛋白食品的最重要酶种之一，引起了国内外研究者的高度重视和兴趣。谷氨酰胺转氨酶在食品工业加工过程中的主要功能包括:(I)对各种食品蛋白质进行改性，保护赖氨酸不发生各种化学反应，包封类脂质和脂溶性物质；(2)形成抗热和抗水薄膜，胶凝蛋白质时避免进行热处理；(3)提高弹性和持水能力；(4)改变可溶性和各种功能性质，从而生产出营养价值较高并含有人体所必需氨基酸的食品蛋白。
[0003]TG是一种胞外酶，发酵结束后，除去菌体，得到的上清液即含有谷氨酰胺转胺酶。由于该酶液的成分比较复杂，需进一步纯化。可用的纯化技术有:离子交换、凝胶层析、高效液相色谱等等。如Geber等人对纯化谷氨酰胺转胺酶的提取分离过程进行改进。在发酵液被离心和过滤之后，一次性通过一个强酸性(Fractogel EMD S03-)离子交换剂树脂，就可以得到纯化了 128倍的谷氨酰 胺转胺酶，酶活的平均回收率可达60%。
[0004]但本领域技术人员可知，上述离子交换、高效液相色谱等方法虽然具有选择性较强，分离效果好的优势。但由于酶活性损失大，收率不高，且对设备要求高，操作复杂。且上述方法的分离过程不可连续，操作所需人员劳动量大，操作周期长，导致最终所得成品酶活低，故上述方法均不适用于规模化生产。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种从发酵液中连续提取谷氨酰胺转氨酶的方法，整个过程高速率物理分离，连续高效，酶活性损失小，收率高。且设备简单，占地小，操作对人员要求小，可适用于规模化生产。
[0006]本发明采用的技术方案为:
一种从发酵液中连续提取谷氨酰胺转氨酶的方法，包括如下步骤:
1)往发酵液中通入无菌压缩空气，使罐内压力维持在0.05MP ;将发酵液从发酵罐中导出到陶瓷复合膜，陶瓷复合膜的膜分离精度为50nm，发酵液液进出速度为80L/h ；
2)将步骤I)经陶瓷复合膜分离得到的分离液导入膜分离设备，进行超滤浓缩，膜截留分子量为6000，控制酶液温度4~0℃。
[0007]3)溶剂沉析:将步骤2)超滤得到的超滤浓缩液加1%辅料(w/w),以120rpm的速度搅拌5min后，以80rpm的速度继续搅拌并以500mL/min的通量加入1.5倍(V/V)于浓缩液体积的溶剂沉析4h，温度4~10°C。
[0008]4)离心分离:将步骤3)溶剂沉析后的混合液离心，分离出酶泥；
5)真空干燥:称取酶泥重量，加入1% (w/w)的辅料，搅拌混匀后进行真空干燥即得谷氨酰胺转氨酶酶粉。
[0009]步骤3)所述的辅料为环糊精或大豆蛋白。
[0010]步骤4)所述的离心条件为:4000rpm离心10min,温度控制在0~4°C。
[0011]步骤5)所述的辅料为环糊精、大豆蛋白、乳酸钙中的一种或多种。
[0012]步骤5)所述的真空干燥真空度为-800mmHg，温度3(T40°C。
[0013]发酵结束后发酵罐中通入无菌压缩空气，使罐内产生稳定的正压，将发酵液从发酵罐中导出到陶瓷复合膜设备，采用陶瓷复合膜设备除去菌体和杂质，比之传统的离心和板框压滤方法,处理效率高且杂质去除率高。除去菌体和发酵残留原料等杂质后的发酵液导入膜分离设备，进行超滤浓缩，同时除去分子量在6000以下的小分子色素和残留的无机盐等杂质。经过陶瓷复合膜设备处理的发酵液，杂质少，可减缓膜分离设备的堵塞，进一步加快膜分离设备的处理效率并延长分离膜的使用寿命。浓缩后发酵液加入辅料后依次经溶剂沉析、离心分离、再次加入辅料、真空干燥的步骤，得到谷氨酰胺转氨酶酶粉。
[0014]本发明的具体操作步骤如下:
1)除去菌体和杂质:将谷氨酰胺转氨酶发酵液导入陶瓷复合膜设备除去菌体和杂质。
[0015]2)超滤浓缩:将经陶瓷复合膜分离得到的分离液导入膜分离设备，进行超滤浓缩，膜截留分子量为6000，以循环水控制酶液温度4~10。
[0016]3)溶剂沉析:将超滤得到的超滤浓缩液加1%辅料(w/w),电动搅拌以120rpm的速度搅拌5min后，以500mL/min的通量加入1.5倍(V/V)于浓缩液体积的溶剂沉析4h，温度4~10。。。
[0017]4)离心分离:将溶剂沉析后的混合液离心，分离出酶泥。
[0018]5)真空干燥:称取酶泥重量，加入1% (w/w)的辅料，搅拌混匀后进行真空干燥即得谷氨酰胺转氨酶酶粉。
[0019]步骤1)所用的陶瓷复合膜设备购自江苏久吾高科技股份有限公司，所用的陶瓷复合膜设备购自江苏久吾高科技股份有限公司，JWCM19*30，膜管外径30mm，通道直径4.0mm,通道数量19，膜的分离精度为50nm。50nm的精度可完全截留菌体和大分子杂质并使酶分子完全通过，综合考虑陶瓷复合膜设备和超滤膜的处理能力，设定其处理液进出速度为80L/h。
[0020]步骤2)所用的超滤膜截留分子量为6000，谷氨酰胺转氨酶的分子量为38000，可以被100%截留，同时除去小分子色素和无机盐等杂质。设定其处理液进出速度为80L/h。
[0021]有益效果
本发明解决了传统谷氨酰胺转氨酶提取中需要离子交换，步骤繁琐不利于放大的问题。所述的一种连续的从发酵液中提取谷氨酰胺转氨酶的方法不仅可以在实验室小试中方便的实施，而且很适合于放大应用于工业化生产。 [0022]本发明中所述的连续的膜分离方法，整个过程为高速率物理分离，连续高效，处理量可达80L/h，且可通过增加膜的处理面积扩大处理量。处理后酶活性损失小，收率达87%，高于传统谷氨酰胺转氨酶提取方法中的酶活收率。且设备简单，占地小，在合理的参数设定下可24小时连续处理，过程对人员要求小，可适用于规模化生产。
【具体实施方式】
[0023]本领域技术人员可知，本发明中所述连续膜分离方法，几乎适用于所有菌种及发酵原料发酵所得的发酵液的分离，且对绝大多数分泌型蛋白酶产品发酵液的分离也适用，本发明所述工艺适用范围广，实用性好。
[0024]所用的陶瓷复合膜设备购自江苏久吾高科技股份有限公司，JWCM19*30，膜管外径30mm，通道直径4.0mm，通道数量19，膜管长度600mm，膜的分离精度为50nm。
[0025]实施例1
本实施例的发酵液是通过如下方法得到:
本实施例中所用发酵菌株为吸水链霉菌NYU-70(CCTCC M 2014121)。菌株经种液培养基培养富集后以1/3的接种量接种至发酵培养基，发酵罐设定转速为220rpm，温度为30°C，pH7.2，发酵周期为6 4小时。
[0026]发酵结束，谷氨酰胺转氨酶发酵液中酶活为15.9U/ml，将发酵液以80L/h的流速导入陶瓷复合膜设备除去菌体和杂质，陶瓷复合膜设备的膜分离精度为50nm。将经陶瓷复合膜分离得到的分离液以80L/h的流速导入膜分离设备，进行超滤浓缩，膜截留分子量为6000，以循环水控制酶液温度6±2°C。将超滤得到的超滤浓缩液以SOrpm的速度搅拌并以500mL/min的通量加入1.5倍(V/V)于浓缩液体积的溶剂沉析4h，温度6±2°C。将溶剂沉析后的混合液4000rpm离心10min，离心温度控制在0°C分离出酶泥。称取酶泥重量，进行真空干燥真空度为-SOOmmHg，保持温度不超过35±2°C。即得谷氨酰胺转氨酶酶粉，酶活收率为76.3%。
[0027]本实施例所述的培养基配方(％为质量百分比):
种液培养基为:甘油1.5，葡萄糖I，鱼粉蛋白胨2，酵母膏0.5，无水硫酸镁0.2，磷酸氢二钾0.2，磷酸二氢钾0.2，轻质碳酸钙5，pH7.2
发酵培养基为:甘油2，葡萄糖1.5，酵母膏0.1，硫酸铵0.5，磷酸二氢钾0.2，pH7.2，中和剂为氢氧化钠，由发酵罐自动控制添加。
[0028]实施例2
本实施例的发酵液是通过同实施例1中相同的方法得到。
[0029]发酵结束，谷氨酰胺转氨酶发酵液中酶活为15.9U/ml，将发酵液以80L/h的流速导入陶瓷复合膜设备除去菌体和杂质，陶瓷复合膜设备的膜分离精度为50nm。将经陶瓷复合膜分离得到的分离液以80L/h的流速导入膜分离设备，进行超滤浓缩，膜截留分子量为6000，以循环水控制酶液温度6±2°C。将超滤得到的超滤浓缩液加1%大豆蛋白(w/w)，电动搅拌以120rpm的速度搅拌5min后，以80rpm的速度继续搅拌并500mL/min的通量加入
1.5倍(V/V)于浓缩液体积的溶剂沉析4h，温度6±2°C。将溶剂沉析后的混合液4000rpm离心10min，离心温度控制在0°C分离出酶泥。称取酶泥重量，加入1% (w/w)的大豆蛋白，搅拌混匀后进行真空干燥，真空度为-SOOmmHg，保持温度不超过35±2°C。即得谷氨酰胺转氨酶酶粉，酶活收率为80.4%。
[0030]实施例3
本实施例的发酵液是通过同实施例1中相同的方法得到。[0031]发酵结束，谷氨酰胺转氨酶发酵液中酶活为15.9U/ml，将发酵液以80L/h的流速导入陶瓷复合膜设备除去菌体和杂质，陶瓷复合膜设备的膜分离精度为50nm。将经陶瓷复合膜分离得到的分离液以80L/h的流速导入膜分离设备，进行超滤浓缩，膜截留分子量为6000，以循环水控制酶液温度6±2°C。将超滤得到的超滤浓缩液加1%@-环糊精(《/?)，电动搅拌以120rpm的速度搅拌5min后，以80rpm的速度继续搅拌并500mL/min的通量加入
1.5倍(V/V)于浓缩液体积的溶剂沉析4h，温度6±2°C。将溶剂沉析后的混合液4000rpm离心lOmin，离心温度控制在4°C分离出酶泥。称取酶泥重量，加入1% (w/w)的β -环糊精和
0.1%的乳酸钙，搅拌混匀后进行真空干燥真空度为-SOOmmHg，保持温度不超过35±2°C。即得谷氨酰胺转氨酶酶粉，酶活收率为83.7%。
[0032]实施例4
本实施例说明不同处理速率对膜分离系统可连续运行时间及最终酶活收率的影响。本实施例所述方法中仅处理速率改变，其余方法和参数都与实施例3中相同。不同处理速率下可连续处理时间和最终酶活收率如表1.1所示。
[0033]表1.1不同处理速率下膜分离系统可连续运行时间及最终酶活收率
【权利要求】
1.一种从发酵液中连续提取谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于包括如下步骤: 1)往发酵液中通入无菌压缩空气，使罐内压力维持在0.05MP ;将发酵液从发酵罐中导出到陶瓷复合膜，陶瓷复合膜的膜分离精度为50nm，发酵液进出速度为80L/h ； 2)将步骤I)经陶瓷复合膜分离得到的分离液导入膜分离设备，进行超滤浓缩，膜截留分子量为6000，控制酶液温度?Ο? ； 3)溶剂沉析:将步骤2)超滤得到的超滤浓缩液加1%辅料(w/w)，以120rpm的速度搅拌5min后，以80rpm的速度继续搅拌并以500mL/min的通量加入1.5倍(V/V)于浓缩液体积的溶剂沉析4h，温度4~10°C ； 4)离心分离:将步骤3)溶剂沉析后的混合液离心，分离出酶泥； 5)真空干燥:称取酶泥重量，加入1%(w/w)的辅料，搅拌混匀后进行真空干燥即得谷氨酰胺转氨酶酶粉。
2.根据权利要求1所述的从发酵液中连续提取谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于:步骤3)所述的辅料为β-环糊精或大豆蛋白。
3.根据权利要求1所述的从发酵液中连续提取谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于:步骤3)所述的溶剂为无水 乙醇。
4.根据权利要求1所述的从发酵液中连续提取谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于:步骤4)所述的离心条件为:4000rpm离心10min,温度控制在(T4°C。
5.根据权利要求1所述的从发酵液中连续提取谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于:步骤5)所述的辅料为β-环糊精、大豆蛋白、乳酸钙中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的从发酵液中连续提取谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于:步骤5)所述的真空干燥真空度为-800mmHg，温度3(T40°C。
【文档编号】C12N9/10GK103966181SQ201410198961
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月13日 优先权日:2014年5月13日
【发明者】虞龙, 李玉燕, 李市场, 黄思思, 刘媛 申请人:虞龙