MgCl₂胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法

专利名称：MgCl₂胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法
技术领域：
本发明涉及链霉菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶技术领域，具体涉及一种添加MgCl2提高发酵法制备谷氨酰胺转氨酶的方法。
背景技术：
谷氨酸胺转氨酶(Transglutaminase,简称TGase, EC 2.3.2.13, R-glutaminyl-peptide:amnie- Y -glutamyl-transferase)又名转谷氨酰胺酶,它通过催化蛋白质中的谷氨酸残基上的甲酰胺与赖氨酸残基上的ε -氨基进行酰基转移反应，使蛋白质在分子内或分子间形成交联。 在二十世纪八十年代，Ikura等人报道了谷氨酰胺转氨酶对食物蛋白质的交联作用。他们用哺乳动物源谷氨酰胺转氨酶交联几种食物蛋白质，如酪蛋白、大豆蛋白等。这些蛋白的交联，提高了其产品的功能性，如凝胶性、溶解性和乳化性等。然而，由于其高昂的价格和低效的利用率限制了它在食品工业上的应用。从链霉菌中成功分离到微生物源谷氨酰胺转氨酶是促进其在食品工业上应用的一个里程碑。它使得这种酶可以大规模地生产，并且被商业利用。由于链霉菌谷氨酰胺转氨酶底物的催化特性，以及它在食品、纺织和医药行业中的广阔应用前景，受到了国内外学者的广泛关注，在亚洲的日本、台湾，欧洲的丹麦、荷兰、法国、德国、爱尔兰以及巴西等国家均投入了大量的人力、物力、财力进行研究，并取得了突飞猛进的进展。谷氨酰胺转氨酶的来源主要有3种:一是从动物的组织或体液中提取，例如牛、猪或鱼等，由于动物组织种类有限、来源稀少、含量低、组织特异性又极高，而且分离精制过程复杂，价格十分昂贵；在欧洲，商业化的凝血因子XIII (谷氨酰胺转氨酶的一种)主要通过宰杀牛或猪等动物来获得，但由于血液中的谷氨酰胺转氨酶通常需要凝血酶激活才具有活性，故很少应用于食品工业中。二是以大肠杆菌、棒状杆菌和链霉菌等为宿主，用基因工程手段来生产此酶。基因工程菌表达效果较差，远不能达到原有水平；虽然有些报道产量较高，但某些国家对基因工程产品限制比较严格。三是直接筛选产谷氨酰胺转氨酶的微生物，通过发酵法来生产。由于此方法技术可行、成本较低、生产不受出发材料和季节限制，最有可能进行大规模生产和广泛应用。但是目前食品级谷氨酰胺转氨酶来源单一、产量较低、价格昂贵，限制了其在食品工业上的应用。国内外提高微生物谷氨酰胺转氨酶产量的报导大多集中在优化发酵条件，改善培养基组成等方面。虽然这些研究都取得了一些成果，但是此酶的产量仍然较低。目前商业化的产品主要由日本味之素等公司生产。国内用微生物发酵法生产谷氨酰胺转氨酶尚处于起步阶段，产量较低。

发明内容
针对现有谷氨酰胺转氨酶的制备方法存在的问题，本发明提供一种MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法。
本发明的发明目的是通过如下技术方案实现的:
采用茂原链霉菌为发酵菌株，经斜面培养和种子培养后，接种在发酵培养基中经液体发酵制备谷氨酰胺转氨酶，通过在发酵培养基中添加MgCl2,发酵96 h，最终实现了提高谷氨酰胺转氨酶产量的目标。具体技术方案如下:
1、菌种及培养基:
(I)菌种:
茂原链霉菌印iOffiiFce1S mobaraense) DSM40587:购于日本 NBRC。(2)斜面培养基(g/L):高氏一号培养基。(3)种子培养基(g/L):聚蛋白胨20，可溶性淀粉20，磷酸氢二钾2，磷酸二氢钾2，酵母粉2，无水硫酸镁2，pH 7.0。(4)初始发酵培养基(g/L):聚蛋白胨30，可溶性淀粉10，果糖10，磷酸氢二钾2，酵母粉2，无水硫酸镁1，pH 7.0。2、谷氨酰胺转氨酶酶活的测定方法:
采用分光光度法37 1:下测定。吸取50 μ L发酵液，加入0.5mL试剂A，37 1:水浴保温IOmin,加入0.5mL试剂B，终止反应，500nm比色。试剂A:1OOmg 的 N-CBZ-Gln-Gly 溶解于 2mL、0.2mol/L 的 NaOH，依次加入 0.2mol/L、pH 6.0的Tris-HCl缓冲液4mL，0.lmol/L的羟胺2mL，0.01mol/L的还原型谷胱甘肽2mL，并调节pH至6.0。试剂B:3mol/L盐酸、12%三氯乙酸、5%FeCl3.6H20 (溶解于0.lmol/L的盐酸)按1:1:1的比例混合。I单位谷氨酰胺转氨酶活性(U)定义为:37°C，pH 6.0的条件下反应，每分钟产生浓度为Iymol的单羟肟酸所需的酶量。3、培养方法:
用5mL无菌生理盐水将培养7 d的斜面孢子洗下，接种于100 mL种子培养基中，30 °C、200 r/min培养48 h后，按10%的接种量添加到发酵培养基中，30 °C >200 r/min条件下采取提高谷氨酰胺转氨酶产量的培养方式培养。将培养好的发酵液经板框过滤器过滤或压滤，再经0.22 μ m滤膜的微过滤装置过滤，制成无细胞的酶液，添加载体保护剂充分混溶，或这些保护剂与无细胞酶液充分混合再经0.22 μ m滤膜的微过滤装置过滤除菌。采用低温喷雾干燥或冷冻干燥制成干粉。或通过超滤、凝胶层析、离子交换层析、透析后再经冻干制成医药级酶制剂。4、上述提高谷氨酰胺转氨酶产量的培养措施:
所涉及的提高谷氨酰胺转氨酶产量的培养方式为在初始发酵培养基中添加0.1-0.2mo I/LMgCl 2,发酵96 h发酵液中谷氨酰胺转氨酶活力达4.3 U/mL。而未为添加MgCl2在发酵120 h时酶活力达最大(2.lU/mL)。MgCl2不但促进了酶的产量，而且发酵周期缩短24h。5、医药级酶制剂制备方法:
(I)超滤
将上述的无细胞酶液进行超滤，超滤条件为采用截流分子量为30kDa的超滤膜，将无细胞的酶液浓缩为初始体积的1/5。
(2)凝胶层析
将浓缩液加入到预先用50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0)平衡的S印hadex G75柱中，并用相同缓冲液进行洗脱，流速为0.25 mL/min，检测波长为了 280nm，收集有活性的部分；
(3)离子交换层析:
将收集到的全部活性部分加入到预先用50 mmol/L、pH 6.0磷酸盐缓冲液平衡的SPsepharose High Performance (HP) (1.6X 10 cm)层析柱中，用含 0_0.25mol/L 氯化钠的相同缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为3 mL/min，检测波长为了 280nm，收集活性部分。6、载体保护剂添加:
上述所涉及的保护剂以无细胞的酶液计蔗糖1_2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%。载体保护剂经100°C、1小时烘干，无菌条件下混料机充分混溶；或这些保护剂与无细胞酶液充分混溶再经0.22 μ m滤膜的微过 滤装置过滤除菌。7、低温喷雾干燥或冷冻干燥制成干粉:
将载体添加保护剂后，采用低温喷雾干燥方法干燥，条件为进风温度80°C，出风温度55-600C。或者采用真空冷冻干燥机干燥，冻干机冷井温度为_60°C，真空度为0.05MPa。本发明采用MgCl2胁迫促进茂原链霉菌生产谷氨酰胺转氨酶，本法得到的酶经纯化后热稳定性和PH稳定性均高于吸水链霉菌合成的谷氨酰胺转氨酶，它在食品加工、纺织行业和组织支架制备行业中具有很大的潜力。所用的MgCl2价格低廉，操作简单，易于实施，显著提高了谷氨酰胺转氨酶的产量，在其它培养条件相同的情况下，本发明比不添加MgCl2的对照例产量提高约100%，并且缩短了发酵周期，达到发酵法制备谷氨酰胺转氨酶的先进水平。
具体实施例方式具体实施方式
一:在发酵起始时，向培养瓶中添加MgCl2使其终浓度为0.20 mol/L。300C >200 r/min条件下培养96 h，发酵液中酶活力由0.6U/mL上升到3.8U/mL。将培养好的发酵液经板框过滤器过滤或压滤，再经0.22 μ m滤膜的微过滤装置过滤，制成无细胞的酶液。载体保护剂蔗糖1_2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%经100°C、1小时烘干，无菌条件下与无菌酶液充分混溶；或无细胞酶液与载体保护剂蔗糖1_2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%充分混溶，再经0.22 μ m滤膜的微过滤装置过滤除菌，采用低温喷雾干燥方法干燥，条件为进风温度80°C，出风温度55-60°C，或者采用真空冷冻干燥机干燥，冻干机冷井温度为_60°C，真空度为0.05MPa。
具体实施方式
二:在初始发酵液中添加0.15 mol/LMgCl2，发酵96h的酶活达
4.2U/mL,将培养好的发酵液经板框过滤器过滤或压滤，再经0.22 μ m滤膜的微过滤装置过滤，制成无细胞的酶液。载体保护剂蔗糖1_2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%经100°C、1小时烘干，无菌条件下与无菌酶液充分混溶；或无细胞酶液与载体保护剂蔗糖1_2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%充分混溶，再经0.22 μ m滤膜的微过滤装置过滤除菌，采用低温喷雾干燥方法干燥，条件为进风温度80°C，出风温度55-60°C，或者采用真空冷冻干燥机干燥，冻干机冷井温度为_60°C，真空度为0.05MPa。
具体实施方式
三:在初始发酵液中添加0.1 mol/L MgCl2，发酵120h酶活力达最大(4.3U/mL)，将培养好的发酵液经板框过滤器过滤或压滤，再经0.22 μ m滤膜的微过滤装置过滤，制成无细胞的酶液。载体保护剂蔗糖1_2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%经100°C、I小时烘干，无菌条件下与无菌酶液充分混溶；或无细胞酶液与载体保护剂蔗糖1_2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%充分混溶，再经0.22 μ m滤膜的微过滤装置过滤除菌，采用低温喷雾干燥方法干燥，条件为进风温度80°C，出风温度55-60°C，或者采用真空冷冻干燥机干燥，冻干机冷井温度为_60°C，真空度为0.05MPa。具体实施方法四:本实施方式与具体实施方式
一、二、三不同的是，通过超滤、凝胶层析、离子交换层析、透析后再经冻干制成医药级酶制剂，具体步骤如下:
(I)超滤
将上述的无细胞酶液进行超滤，超滤条件为采用截流分子量为30kDa的超滤膜，将无细胞的酶液浓缩为初始体积的1/5。(2)凝胶层析
将浓缩液加入到预先·用50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0)平衡的S印hadex G75柱中，并用相同缓冲液进行洗脱，流速为0.25 mL/min，检测波长为了 280nm，收集有活性的部分；
(3)离子交换层析
将收集到的全部活性部分加入到预先用50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0)平衡的SPsepharose High Performance (HP) (1.6X 10 cm)层析柱中，用含 0_0.25mol/L 氯化钠的相同缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为3 mL/min，检测波长为了 280nm，收集活性部分。即为所制备的电泳纯谷氨酰胺转胺酶。TGASE的回收率可以达到77.5%,TGASE的比酶活可以达到 17.33U/mg。
权利要求
1.一种MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法，采用茂原链霉菌为发酵菌株，经斜面培养和种子培养后，接种在发酵培养基中经液体发酵制备谷氨酰胺转氨酶，其特征在于:在发酵培养基中添加MgCl2，发酵96 h提高链霉菌谷氨酰胺转氨酶的产量。
2.根据权利要求1所述的MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于所述发酵培养基中添加0.1-0.2 mol/L的MgCl2。
3.根据权利要求1所述的MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于所述MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的具体步骤如下: 用5mL无菌生理盐水将培养7d的斜面孢子洗下，接种于IOOmL种子培养基中，30°C、200r/min培养48h后，按10%的接种量添加到发酵培养基中，在初始发酵培养基中添加 ·0.l-ο.2 mol/L MgCl2, 30°C、200r/min条件下采取提高谷氨酰胺转氨酶产量的培养方式培养，将培养好的发酵液经板框过滤器过滤或压滤，再经0.22 μ m滤膜的微过滤装置过滤，制成无细胞的酶液，添加经烘干灭菌的载体保护剂充分混溶，制成干粉或医药级酶制剂。
4.根据权利要求3所述的MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于所述载体保护剂为以无细胞的酶液计蔗糖1_2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%。
5.根据权利要求3或4所述的MgClJ#迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于所述载体保护剂经100°C、1小时烘干灭菌，无菌条件下与无细胞的酶液充分混溶。
6.根据权利要求3或4所述的MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于所述保护剂与无细胞酶液充分混溶，再经0.22 μ m滤膜的微过滤装置过滤除囷。
7.根据权利要求3所述的MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于采用低温喷雾干燥或冷冻干燥制成干粉。
8.根据权利要求7所述的MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于所述低温喷雾干燥的条件为进风温度80°C，出风温度55- 600C ;冷冻干燥采用真空冷冻干燥机干燥，冻干机冷井温度为_60°C，真空度为0.05MPa。
9.根据权利要求3所述的MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于通过超滤、凝胶层析、离子交换层析、透析后再经冻干制成医药级酶制剂。
10.根据权利要求9所述的MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于所述制备医药级酶制剂的具体要求如下: (1)超滤: 将上述的无细胞酶液进行超滤，超滤条件为采用截流分子量为30kDa的超滤膜，将无细胞的酶液浓缩为初始体积的1/5 ； (2)凝胶层析: 将浓缩液加入到预先用50 mmol/L.pH 6.0磷酸盐缓冲液平衡的S印hadex G75层析柱中，并用相同缓冲液进行洗脱，流速为0.25 mL/min，检测波长为了 280nm，收集有活性的部分； (3)离子交换层析: 将收集到的全部活性部分加入到预先用50 mmol/L、pH 6.0磷酸盐缓冲液平衡的SPsepharose High Performance层析柱中，用含0-0.25mol/L氯化钠的相同缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为3 mL`/min,检测波长为了 280nm,收集活性部分。
全文摘要
MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法，涉及链霉菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶技术领域。本发明采用茂原链霉菌为发酵菌株，经斜面培养和种子培养后，接种在发酵培养基中经液体发酵制备谷氨酰胺转氨酶，通过在发酵培养基中添加MgCl2，最终实现了提高谷氨酰胺转氨酶产量的目标，并添加保护剂制成低温喷雾干燥或冷冻干燥干粉。本发明所用的MgCl2价格低廉，能显著提高了谷氨酰胺转氨酶的产量，在其它培养条件相同的情况下，本发明比不添加MgCl2的对照例产量提高约100%，并且缩短了发酵周期。
文档编号C12N9/10GK103146661SQ20131007202
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月7日 优先权日2013年3月7日
发明者张兰威, 张莉丽, 张英春, 杜明, 冯镇, 单毓娟, 韩雪, 易华西, 焦月华, 李洪波 申请人:哈尔滨工业大学