专利名称：一种热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种谷氨酰胺转氨酶，特别是一种热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶。
背景技术：
微生物谷氨酸胺转胺酶(TransglutaminaseEC 2. 3. 2. 13 全称 R-glutaminyl-peptide: amine- y -glutayle-transferase简称MTG)它能够通过催化蛋白质分子间或分子内形成e- ( Y-谷氨酰基)赖氨酸共价键，引起蛋白质分子内、分子间发生交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解。TGase具有的独特催化功能，使其在食品、纺织、生物制药等领域有着广泛的应用前景。但由于MTG自身的一些缺陷如热稳定性等因素，限制了 MTG的应用范围。因此基于已得到的MTG在大肠杆菌中的表达平台，通过在C端添加有助于热稳定性的标签，对MTG进行分子改造，以期得到酶学性质更适合工业应用的MTG。
发明内容
为改善MTG热稳定性差的现状，本研究通过在MTG的C端氨基酸添加标签，从而增强C端氨基酸与TGase其他部位氨基酸之间的相互作用，提高MTG的热稳定性。本研究提供一种新的改造思路，通过在TGase C端添加有助于热稳定性的标签，得到了热稳性提高的突变株，在前期研究中，本研究室筛选出一株新的产谷氨酰胺转胺酶的菌株(Streptomyceshygroscopicus CCTCC M203062)，通过基因克隆方法，得到了 MTG基因序列及其上下游序列，含MTG自身的启动子和终止子(Genbank :EU477523)，并实现了 MTG和其酶原区在大肠杆菌中的高效表达(Liu S，Zhang D, Wang M, Cui ff, Chen K，Liu Y, Du G, Chen J, ZhouZ(2011)The pro-region of Streptomyces hygroscopicustransglutaminase affectsits secretion by Escherichia col1. FEMS Microbiol Lett 324(2) :98-105)。基于大肠杆菌构建平台，我们通过在MTG成熟酶C端添加标签，所述标签氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO. 2所示，其中优选SEQ ID NO. 1，得到了酶学性质较好的突变株。产谷氨酰胺转胺酶的基因工程菌或转基因细胞系也为本发明要求保护的范围。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种构建所述产谷氨酰胺转胺酶基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤I)采用化学全合成或PCR方法克隆编码改造后谷氨酰胺转氨酶的基因；2)将步骤I)获得的基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体；3)将步骤2)获得的重组表达载体转化E. coli E. coli BL 21得到基因工程菌。所述表达载体为pET-22b (+)。本发明还提供一种应用上述基因工程菌发酵生产角蛋白酶的方法，以所述谷氨酰胺转氨酶基因工程菌为生产菌株，370C，培养12h，转接到TB培养基中，接种量为3% ;菌体长 到OD6tltl为2时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到20°C，培养48h。本发明所用到的培养基
LB 培养基胰蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaCl 10g/L, pH 7. O ；TB 培养基蛋白胨 12g/L，酵母膏 24g/L，甘油 8g/L，17mmol/L KH2PO4, 7 2mmo I/LK2HPO4。本发明中谷氨酰胺转胺酶活力的测定比色法测定酶活以N- a -CBZ-GLN-GLY为作用底物，L-谷氨酸-Y单羟胺酸做标准曲线。I个单位谷氨酰胺转胺酶酶活定义为37° C时每分钟催化形成I μ mol L-谷氨酸-Y单羟胺酸的酶量(U/mL)。试剂A :1OOmg 的 N a -CBZ-GLN-GLY 溶解于 2mL O. 2moL/L 的 NaOH 溶液中，加入O. 2mol/L pH6. O 的 Tris-HC 缓冲液 4mL，0. lmol/L 羟胺 2mL，0. 01mol/L 的还原型谷胱甘肽2mL,并调节pH至6. O。
试剂B 3mol/L 的 HCL, 12%TCA, 5%FeCL3 按1:1 :1 混合。配制0-4 μ mol/mL的L-谷氨酸-Y -单异羟肟酸标准溶液。取ImL试剂A与0. 4mL不同浓度的L-谷氨酸-Y -单异羟肟酸标准溶液混合，37° C水浴10分钟。加0. 4mL试剂B终止反应，在525nm比色，绘制出标准曲线。以0. 4mL经适当稀释的酶液代替标准溶液，在相同条件下保温和比色，从标准曲线求出酶活。以100° C加热10分钟的离心后的上清液为空白。酶活力(u/mL) = (6.8548X0D525-0.0164) X稀释倍数本发明以MTG在大肠杆菌中的高效表达为改造平台，在MTG成熟酶C端添加标签，得到了酶学性质较好的突变株，热稳定性分别提高2. 5倍和3倍。改造后的酶更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。
具体实施例方式实施例1:吸水链霉菌来源MTG晶体结构模拟以已报道的S. mobaaensis的TGase晶体结构为模板，在swiss-model网站(http://swissmode1. expasy. org/)模拟 S. hygoscopicus TGase 的晶体结构。实施例2 :热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶是在Genbank EU477523公布的谷氨酰胺转氨酶编码基因基础上，其C端加上氨基酸标签，其中标签氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO. 2所示，其中优选SEQ ID NO.1。实施例3 :热稳定性提高突变株的获得(linker9、linkerl3)1、采用化学全合成或PCR方法克隆编码谷氨酰胺转氨酶的基因Genbank EU477523，在MTG C端添加不同种类的有助于提高热稳定性的标签，改造后的谷氨酰胺转氨酶的基因克隆到载体。2、将测序正确的质粒，转化E. coli BL 21，挑选转化子接种到LB液体培养基中，37。。，培养12h，转接到TB培养基中，接种量为3%。菌体长到OD600为2时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到20°C，培养48h。3、收集发酵上清，检测发酵上清酶活，并对样品进行His-镍柱纯化。4、对纯化后MTG的比酶活和Km值进行测定，结果如表I所示。实验结果表明，当在MTG成熟酶C端添加linker6时MTG的比酶活无明显改变，其热稳定性提高2. 5倍。在C端添加linkers时MTG的比酶活明显下降，其热稳定性提高3倍。说明在MTG成熟酶C端添加有助于提闻热稳定性的标签有助于提闻MTG的热稳定性。
表IMTG突变株酶学性质。
标签Specific activity (U/mg) ti 2 (miη)
权利要求
1.一种热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶，其特征在于在Genbank EU477523公布的谷氨酰胺转氨酶编码基因基础上，其C端加上氨基酸标签，所述标签氨基酸序列如SEQ ID NO.1 或 SEQ ID NO. 2 所示。
2.权利要求1所述的谷氨酰胺转氨酶，其特征在于所述氨基酸标签优选SEQID NO.1。
3.一种获得权利要求1所述谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于以Genbank EU477523 公布的谷氨酰胺转氨酶编码基因为出发序列，在其C端添加氨基酸标签。
4.产权利要求1所述谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌或转基因细胞系。
5.权利要求4所述产谷氨酰胺转氨酶基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤1)采用化学全合成或PCR方法克隆编码权利要求1所述编码谷氨酰胺转氨酶的基因；2)将步骤I)获得的基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体；3)将步骤2)获得的重组表达载体转化E.coli E. coli BL 21得到基因工程菌。
6.权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述表达载体为pET-22b(+)。
7.应用权利要求4所述基因工程菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于以所述谷氨酰胺转氨酶基因工程菌为生产菌株，37°C，培养12h，转接到TB培养基中，接种量为 3% ;菌体长到0D_为2时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到20°C，培养48h。
全文摘要
本发明公开了一种热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶，以MTG在大肠杆菌中的高效表达为改造平台，在MTG成熟酶C端添加有助于提高热稳定性的标签，其中优选IGCIILT，得到了酶学性质较好的突变株，热稳定性提高2.5倍和3倍。改造后的酶更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。
文档编号C12N15/70GK102994469SQ201210581790
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者陈坚, 刘松, 堵国成, 陈康康, 王广圣 申请人:江南大学