一种从蚯蚓血清中纯化乙酰胆碱酯酶的方法

专利名称：一种从蚯蚓血清中纯化乙酰胆碱酯酶的方法
技术领域：
本发明涉及こ酰胆酯酶的萃取方法，特别涉及ー种从蚯蚓血清中纯化こ酰胆碱酯酶的方法。
背景技术：
こ酰胆碱酯酶是生物神经传导中的ー种关键酶，在神经传导中起着至关重要的功能。该酶降解こ酰胆碱，終止神经递质对于突触后膜兴奋刺激作用，保证神经信号分子在生物体内的正常的传导。こ酰胆碱酯酶上有着有机磷和氨基甲酸酯类化合物的作用位点，当这两类化合物与こ酰胆碱酯酶结合后，就会造成酶催化部位的磷酰化和氨基甲酰化，使其对こ酰胆碱的こ酰化作用无法进行，从而破坏了正常的神经传导作用。酶的失活从而引起生物的中毒，利用这ー原理可以起到杀虫的效果。こ酰胆碱酯酶的活性受抑制程度与农药的量呈现线性关系，因而可用AChE的活性受抑制程度来检测果蔬中的残留农药量。因此，高灵敏度、高纯度的こ酰胆碱酯酶批量制备成为酶抑制法研究的重点问题。こ酰胆碱酯酶的来源很多，动物的肝状，脑部，血液中均存在较丰富的该酶源，有学者分别用猪肝、麦麸、鲫鱼脑、蚯蚓和鸡血来提取こ酰胆碱酯酶，从提取得到酶的活性和大規模操作的方便程度，用蚯蚓为酶源有较大的优势。丁诗华等(应用与环境生物学报，1997，3，246-251)采用Triton X-100蚯蚓血清抽提液经PEG2000-磷酸钾缓冲液处理、离子交换层析及凝胶过滤后，获得电泳纯的胆碱醋酶。但该方法纯化提取过程复杂，纯化倍数低，未实现酯酶的分离。现有《一种从动物血液中提取こ酰胆碱酯酶的制备方法》(专利申请号为02134464)包括如下步骤将大白鼠、鸡、鸭、牛、狗、黄鳝鱼、鳗鱼的血液于温室下凝固，冷冻、取其上清液，上清液离心分离，得到こ酰胆碱酯酶的粗提取液，用硫酸铵沉淀法纯化，用透析法脱硫酸铵，酶液浓缩干燥，得到纯化的こ酰胆碱酯酶制品。现有从蚯蚓血清中提取こ酰胆碱酯酶的方法为丁诗华等(应用与环境生物学报，1997，3，246-251)在蚯蚓血清中加入磷酸钠缓冲溶液充分匀浆，采用Triton X-100抽提液经PEG2000-磷酸钾缓冲液处理、离子交换层析及凝胶过滤后，获得电泳纯的胆碱醋酶。该方法过程复杂，纯化倍数低，未实现酯酶的分离，会减弱酶的活力。

发明内容
本发明要解决的技术问题是针对上述现状，g在提供一种成本低、操作方便、实用性较强的从蚯蚓血清中纯化こ酰胆碱酯酶的方法。为解决该技术问题，本发明采用的技术方案如下ー种从蚯蚓血清中纯化こ酰胆碱酯酶的方法，蚯蚓预处理将蚯蚓放置清水中24h，排除体内的粪便，将其储存在4°C冰箱中待用；用pH8. 0,0. lmol/L的磷酸缓冲溶液，在冰水浴条件下匀浆，制成匀浆液，在4°C下离心(lOOOOr/min) 20min得粗酶提取液，保存在冰箱中。100 μ L粗酶提取液中加入表面活性剂Triton X-114(0. 09%, w/v)溶液和O. 6mLPH4. I柠檬酸缓冲溶液用二次水定容到IOmL充分振荡并摇匀。将其上述溶液放置在水浴温度为35°C恒温水槽中平衡9min，而后将其取出，以4000r/min离心5min，分层后将其上层溶液倾倒，下层即为纯化后こ酰胆碱酯酶制品。本发明提供的是蚯蚓血清こ酰胆碱酯酶的纯化萃取方法，其酶来源便宜广泛，并且灵敏度高，制备エ艺简单稳定，生产成本低。该方法使用温和的试剂Triton X-114来萃取血清中的こ酰胆碱酯酶，与层析凝胶法相比，对酶的活力无影响，并且能够保持酶的全结构，有利于酶结构研究；再者该方法利用蚯蚓血清中こ酰胆碱酯酶的等电点来实现酶的分离和纯化，能够将其他的蛋白酶和酯酶分离出去,使酶的纯化倍数较高。Triton X-114是ー种非离子型表面活性的，产品名称Triton X-114/曲拉通X-114,别名辛基苯基聚氧こ烯醚,4-(1, I, 3, 3-Tetramethylbutyl)eyelohexy1-polyetnylene glycoi。



图I从蚯蚓血清中提取纯化こ酰胆碱酯酶的流程图。图2浊点萃取纯化出的こ酰胆碱酯酶经SDS-凝胶电泳图。I为Marher ；2为こ酰胆碱酯酶经纯化后所得到电泳图；3为粗提取的こ酰胆碱酯酶电泳图。
具体实施例方式參见图1，ー种从蚯蚓血清中纯化こ酰胆碱酯酶的方法I)蚯蚓预处理将购买的蚯蚓洗净后放入清水中24h，使其排净体内的粪便，储存在4 C冰箱中待用；2)蚯蚓血清的粗提取以磷酸缓冲液(pH8. 0,0. lmol/L)为制备粗提取液的溶液，按照匀浆液比为1:1 (蚯蚓质量(g)/磷酸缓冲液体积(mL))制成的匀浆液，在4°C下离心(10000r/min)20min弃去上清液，得到的就是粗酶提取液，保存在冰箱中。；3)浊点萃取过程取用IOmL的离心管，而后加入100 μ L蚯蚓血清的粗提取液即粗酶提取液，再加入表面活性剂Triton X-114(0. 09%, w/v)溶液和0. 6mL pH4. I柠檬酸缓冲溶液来调节溶液的PH值，用二次水定容到IOmL充分振荡并摇匀。4)将第3)步得到的溶液放置在水浴温度为35°C恒温水槽中平衡9min，而后将其取出，以4000r/min的速度下离心5分钟，分层后将其上层溶液倾倒出去，下层溶液即为こ酰胆碱酯酶纯化提取液。纯化程度的测定こ酰胆碱酯酶的纯化程度可以用SDS-凝胶电泳图来加以测定，如图2所示。图2中I为Marher ;2为こ酰胆碱酯酶经纯化后所得到电泳图；3为粗提取的こ酰胆碱酯酶电泳图。从图2可以看出，没有经过纯化的酶原液经SDS-凝胶电泳检测有多条谱带，经过浊点萃取纯化后的电泳图中谱带条数主要有两条，相对应的分子量分别在50-60KDa和110-120KDa，符合こ酰胆碱酯酶的分子量，说明こ酰胆碱酯酶液可达到电泳纯。本发明成功地分离纯化出了保持原有酶活性的こ酰胆碱酯酶。从蚯蚓血清中得到的こ酰胆碱酯酶通过凝胶电泳方法分析可知，它有两种不同分子量的蛋白质，分别在50-60KDa和110_120KDa，这也符合ー些文献的报道。总之，本方法具有能从蚯蚓血清中快速方便的提取こ酰胆碱酯酶、且纯度较高和保持酶活性等优点，是分离提纯动物体内こ酰胆碱酯酶的ー种重要的方法。权利要求
1. 一种从蚯蚓血清中纯化乙酰胆碱酯酶的方法，其特征在于包括如下步骤 1)蚯蚓预处理将蚯蚓放置清水中24h，排除体内的粪便，将其储存在4°C冰箱中待用； 2)蚯蚓血清的粗提取以磷酸缓冲液(pH8.0，0.lmol/L)为制备粗提取液的溶液，按照匀浆液比为1:1[蚯蚓质量(g)/磷酸缓冲液体积(mL)]制成的匀浆液，在4°C下离心(10000r/min) 20min得粗酶提取液； 3)浊点萃取过程取用IOmL的离心管，而后加入100μ L粗酶提取液，再加入表面活性剂Triton X-114 (O. 09%, w/v)溶液和O. 6mL pH4. I柠檬酸缓冲溶液用二次水定容到IOmL充分振荡并摇勻； 4)将第3)步得到的溶液放置在水浴温度为35°C恒温水槽中平衡9分钟，而后将其取出，在4000r/min的离心机中离心5分钟，分层后将其上层溶液倾倒，下层即为纯化后乙酰胆碱酯酶。
全文摘要
一种从蚯蚓血清中纯化乙酰胆碱酯酶的方法，将蚯蚓放置清水中24h，排除体内的粪便，将其储存冰箱中待用；用磷酸缓冲溶液，在冰水浴条件下匀浆，制成匀浆液，离心得粗酶提取液，保存在冰箱中。100μL粗提取液中加入表面活性剂Triton X-114溶液和柠檬酸缓冲溶液用二次水定容到10mL充分振荡并摇匀。将其上述溶液放置在水浴温度为35℃恒温水槽中平衡9min，而后将离心，分层后下层即为纯化后乙酰胆碱酯酶制品。本发明提供的是蚯蚓血清乙酰胆碱酯酶的纯化萃取方法，其酶来源便宜广泛，并且灵敏度高，制备工艺简单稳定，生产成本低。
文档编号C12N9/18GK102660516SQ201210144988
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者仲淑贤, 张改梅, 李娜, 潘小欧, 陈建荣 申请人:浙江师范大学