河豚毒素的提取、及河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂的制作方法

专利名称：：河豚毒素的提取、及河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及河豚毒素的制法，另外还涉及河豚毒素用于杜冷丁等麻醉药物的原料药制剂。二
背景技术：
：河豚毒素(Tetrodotoxin简称TTX)是从河豚鱼卵巢或肝脏中提取分离的一种非蛋白小分子化合物，其分子式CH17N308,分子量为319.27。河豚毒素是专一性很强的细胞膜钠离子通道阻滞剂，可阻断神经传导，从而起到镇痛、戒毒的作用。临床用于内科、外科、皮肤科等领域。河豚毒素的提取分离，最早为日本田原氏于1909年从河豚鱼卵巢中提取得到河豚毒素粗品结晶，并确立了其化学结构。1972年日本学者岸义人小组化学合成了河豚毒素。我国1982年北京防化院和河北水产研究所，1984年大连海洋渔业公司、青岛、天津等地相继在河豚毒素提取分离方面获得成功，目前各种提取方法大都采用平田后腾法，即原液提取一树脂交换一活性炭吸附一粗品结晶一苦味酸盐精制。活性炭吸附流程所用活性炭为动物性活性炭，分散性吸附法。河豚毒素损耗量很大，而且用化学法，苦味酸盐精制，每100kg河豚卵巢河豚毒素收率最多1.0—1.2g。河豚毒素的临床应用，早在30年代日本人能三共株式会社已经将河豚毒素纯度为0.2—1.0(g/ml)的粗制品(推算当时商品每支含量为35.7mg/ml)用于镇痛。镇痉、镇静的治疗。日本学者项乃義将5河豚毒素注射液(粗品)用于鸦片类吸毒者的脱瘾治疗。阿片类药依赖是人类在吸食注射毒品后，会产生一种欣欲、亢奋的感觉。当染上"毒瘾后会不惜一切手段寻找毒品，以满足这种精神和生理上的需要。戒毒是一个非常痛苦的过程，许多吸毒者之所以最后放弃戒毒，是因为无法忍受停止毒品后出现的戒断反应。目前市场上用于戒毒药品的主要有美沙酮、LAAM、石丙甲羟二羟、吗啡酮和钠洛酮，而目前临床使用的戒毒药美沙酮自身具有成瘾性，使戒毒者在戒除毒瘾后，又不觉的染上了另一种药瘾，河豚毒素注射液作为新研究的戒毒药，却不具有成瘾性，而且脱瘾时间快速，只需要4一7天实为可推广的脱瘾药物。如国际专利WO95/29903提供"氨基氢化喹唑啉化合物及其衍生物戒除药物依赖的新用途"，将河豚毒素溶于pH4—5醋酸液，制成河豚毒素含量为5—300Ug/ml的注射液。中国专利CN96119454.5提供一种用于戒毒镇痛药剂及其制法，河豚毒素溶于PH4—5醋酸溶液中，制成含量为0.5—10.0ug/ml加入0.0125普鲁卡因复方注射针剂。中国专利98102072.0将河豚毒素溶于1%醋酸液中制成河豚毒素含量为0.001—0.45ug/ml注射液针剂。中国专利CN1459286A提供一种"用于戒毒、镇痛的河豚毒素呼吸道给药制剂"，将原料药制成气雾剂、喷雾剂。中国专利CN1353990A提供"用于镇痛、麻醉或治疗药物依赖性的制剂"河豚毒素含量为5—100ug/ml的注射液针剂。中国专利200410102449.2提供"河豚毒素衍生物的制备和戒毒、镇痛用途"将河豚毒素溶于酒石酸中，制成含量为l一10ug/ml的注射液。上述发明对河豚毒素临床应用研究起到积极作用。70年代末期以来，吸扎毒的现行在我国又死灰复燃，阿片类物质依赖己成为严重社会问题，我们北方地区主要以杜冷丁依赖比较多，杜冷丁属于中枢性镇痛麻醉药物，较强的成瘾性，一旦成瘾有较强的心里渴求，获得欢快振奋感，称之心里依赖，逐渐发展躯体依赖。对于杜冷丁依赖患者的治疗往往以其他成瘾性小的A片类物质进行递减替代疗法。这种疗法以小毒替代大毒的现象。有很大的弊端，如美沙酮。他是中枢吗啡多体激动剂，也易产生依赖性，而且疗程时间较长。因而寻找一种起效快、控制症状彻底过度平稳，无毒副作用的药物势在必行。而河豚毒素注射液，有较强的镇痛作用，抑制或减轻戒断症状的出现。目前文献中报导河豚毒素注射液(水针剂)和河豚毒素注射(冻干剂)一般都是由原药和稳定剂组成，稳定剂有枸橼酸盐或右旋糖酐双糖类。但上述配方的制剂稳定性很差，较长时间存放后，易产生差向异构化，使河豚毒素随时间的增长而逐步降低其含量，影响药效的发挥，治疗效果差。
发明内容本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种河豚毒素的提取，提取方法简单易操作，收率大大提高。另外提供一种河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂，稳定性最佳，储存期限长，疗效好。本发明为实现上述目的所采用的技术方案是河豚毒素的提取，包括原液提取、树脂交换和洗脱步骤，第一步原液提取取菊黄东方豚卵巢，切成l一2cm片状小块，用0.1%—0.5%HAC溶液浸泡、搅拌，48小时后用甩干机甩干得原液，加热至沸腾，立即停止加热，除去凝固蛋白，原液冷却后用50—80目筛初滤，再经白陶土——纸浆过滤，得浅黄色透明原液，卵渣继续分次浸泡24小时，重复上述步骤收集滤液，共取得原液20L，用氨水调制PH5—7，加1一5%正丁醇或1—2%甲醛防腐，常温放置备用；7第二步树脂交换树脂为D152阳性大孔丙烯酸弱酸性树脂，经常法处理转NH4型，双柱两次交换，A柱为玻璃柱内下层装树脂，上层装硅藻土；B柱为玻璃柱内下层装中性氧化铝，上层装树脂；A柱原液上树脂柱进行交换，流速100—120ml/min，树脂交换后期用小鼠毒性跟踪，当小鼠显中毒反应时，表明树脂交换己达饱和程度，停止原液上柱，用去离子水冲洗至流出液无色，茚三酮试验阴性止，收集有毒馏分流出液；B柱将A柱所收集的有毒馏分，用氨水调PH值为7，开始上柱，流速30—50ml/min，当流出液PH7时，小鼠毒性跟踪显毒性反应时，停止上柱，用去离子水(200L)冲洗柱，收集强毒馏分；第三步洗脱-A柱交换后的A柱用12%的HAC液洗脱，流速30—40ml/min，当流出液PH7，小鼠毒性跟踪显毒性反应时，分步收集有毒馏分，毒素高峰在PH6.5—4.5之间；B柱将A柱树脂洗脱所得的有毒馏分，用氨水调PH6—7，上柱，用10y。HAC洗脱，流速50ml/min，流出液PH7，小鼠跟踪显毒性反应时，分步收集强毒馏分，弱毒部分做下次浸泡用，合并交换和洗脱收集的强毒馏分，置于0—5'C冷藏存放备用。所述河豚毒素的提取还包括结晶步骤，在洗脱后进行第四步结晶将B柱树脂交换和洗脱的强毒馏分，分次真空减压浓縮，-IO'C放置24小时后，取出融化解冻并加8%氨水调PH8—9，震动搅拌，析出白色沉淀物，滤取沉淀物，沉淀物用蒸馏水反复洗涤3-5次，用2%~~5%HAC液溶解，.滤除不溶物杂质，溶液中加8y。NH4水调PH8一9，0—5度冷藏放置24小时，取出再进行上述重结晶2-3次，得河豚毒素粗品结晶。所述第四步结晶粗品结晶经高效液相色谱分离纯化得纯品河豚8毒素结晶，经高效相色谱分析，纯度为99%。所述第二步树脂交换:B柱中性氧化铝经180度活化处理2小时，冷却后湿法上柱，氧化铝先上柱，然后树脂上柱，使氧化铝在柱的下层。本发明制得的河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂，lml制剂中含有河豚毒素0.01-0.49yg/ml，含有河豚毒素20-40倍重量份的稳定剂硫酸软骨素。所述lml制剂由下述原料配制而成河豚毒素0.48yg0.5%枸橼酸0.002ml硫酸软骨素9.6yg注射用水余量。所述用于杜冷丁类药物依赖的制剂的制备方法取河豚毒素溶于0.5%枸橼酸溶液中，硫酸软骨素溶于注射用水，两溶液混合后加入注射用水，调PH值4—6，充分搅拌均匀，经除菌过滤、超滤，在无菌条件下计量灌装入安瓶中，半开塞送冷冻干燥机-40度预冷，打开冷井制冷，温度降至-55度时启动真空泵，真空泵在5帕以下，维持24小时，然后升温在30度维持14小时压塞、扎盖。本发明河豚毒素提取方法经过反复研究，克服了活性炭仍有部分不可逆的吸附作用的不足问题，不采用活性炭吸附的流程，直接用两次树脂交换，两次树脂交换的A柱内径大于B柱，高度小于B柱，A柱内装树脂，在树脂上层加硅藻土，在原液树脂交换中往往会在柱的上部有菌团的形成，使原液通过树脂柱流速减慢，甚至树脂柱有阻塞现象的发生，本发明A柱树脂上层加硅藻土后，可随时分步清除菌团，提高了流速。B柱内上层装树脂，树脂下层装中性氧化铝，中性氧化铝对生物碱的分离，具有较好的分离作用，提高了河豚毒素的9分离效果，从而提高了产品的收率和纯度，减除了活性炭吸附工艺流程，提高了收率5—10%。本发明河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂，有效剂量选用合理，配料稳定剂硫酸软骨素，起到稳定作用更显著，与同类产品相比贮藏期限更长，保证产品疗效。本发明制剂用于脱瘾治疗，具有起效快，控制症状彻底，过度平稳，易接收等特点，是一种杜冷丁类药物依赖脱瘾治疗较理想的药物。具体实施例方式下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明不限于具体实施例。实施例1河豚毒素的提取，包括原液提取、树脂交换和洗脱步骤，第一步原液提取取菊黄东方豚卵巢100kg，切成l一2cm片状小块，用0.1%—0.5MHAC溶液100L浸泡、搅拌，48小时后用甩干机甩干得原液，直火加热至沸腾，立即停止加热，除去凝固蛋白，原液冷却后用50—80目尼龙网初滤，再经白陶土——纸浆过滤，得浅黄色透明原液，卵渣继续分次浸泡24小时，重复上述步骤收集滤液，共取得原液20L，用氨水调制PH5—7，力口1—5%正丁醇或1—2%甲醛防腐，常温放置备用；第二步树脂交换树脂为D152阳性大孔丙烯酸弱酸性树脂，经常法处理转NH4型，双柱两次交换，树脂交换柱分为A、B两柱，A柱为玻璃制内径9cm、高100cm,柱内下层装入树脂5kg，，将0.3—0.5kg硅藻土装入树脂上层。B柱为玻璃制内径7cm、高120cm，柱内装树脂3.5kg，中性氧化铝750g，中性氧化铝经180度活化2小时湿法上柱，首先将750g中性氧化铝上柱，然后装入树脂3.5kg使氧化铝在B柱的下层，树脂在B柱的上层；10A柱原液上树脂柱进行交换，流速100ml/min，树脂交换后期用小鼠毒性跟踪，当小鼠显中毒反应时，表明树脂交换已达饱和程度，停止原液上柱，用去离子水冲洗至流出液无色，茚三酮试验阴性止，收集有毒馏分流出液；B柱将A柱所收集的有毒馏分7.5L，用氨水调PH值为7，开始上柱，流速50ml/min，当流出液PH7时，小鼠毒性跟踪显毒性反应时，停止上柱，用去离子水(200L)冲洗柱，收集强毒馏分；第三步洗脱A柱用12Q/。的HAC液洗脱，流速40ml/min，当流出液PH7，小鼠毒性跟踪显毒性反应时，分步收集有毒馏分100ml/份，毒素高峰在PH6.5—4.5之间，其收集有毒馏分7.5L;B柱将A柱树脂洗脱所得的有毒馏分，用氨水调PH6—7，上柱，用10。/。HAC洗脱，流速50ml/min，流出液PH7，小鼠跟踪显毒性反应时，分步收集强毒馏分100ml/份，弱毒部分做下次浸泡用，共收集强毒馏分3.2L，置于冰箱0—5'C冷藏存放备用；第四步结晶将B柱树脂交换和洗脱的强毒馏分，分次真空减压浓縮至200ml，-l(TC放置24小时后，取出融化解冻并加8%NH4水调PH8—9，震动搅拌，析出白色沉淀物，滤取沉淀物，沉淀物用蒸馏水反复洗涤5次，用2%—5%HAC液溶解，滤除不溶物杂质，溶液中加8c/。NH4水调PH8—9，0—5度冷藏放置24小时，取出后再进行上述重结晶3次，得河豚毒素粗品结晶3.82g，粗品结晶经高效液相色谱(HPLC)分离纯化得纯品河豚毒素结晶2.38g，经高效相色谱(HPLC)分析，纯度为99%。实施例2采用实施例1制得的河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂，由下述原料按重量份比配制而成1000支注射制剂，每支lml:河豚毒素480ug0.5%枸橼酸2ml硫酸软骨素960ug注射用水余量。具体制备方法为取河豚毒素溶于0.5%枸橼酸溶液中，硫酸软骨素溶于注射用水，两溶液混合后加入注射用水，调PH值4—6，充分搅拌均匀，经除菌过滤、超滤，在无菌条件下计量灌装入安瓶中，半开塞送冷冻干燥机-40度预冷，打开冷井制冷，温度将至-55度时启动真空泵，真空泵在真空度5帕以下，维持24小时，然后升温在30度维持14小时压塞、扎盖。表1:不同河豚毒素注射液和河豚毒素冻干剂在常温下稳定性试<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>河豚毒素注射液(水针剂)和河豚毒素冻干剂，在常温下进行稳定性试验，按时取样，HPLC检测河豚毒素含量。稳定性试验表明河豚毒素醋酸液和枸橼酸液注射液随着储藏时间增长，河豚毒素含量逐渐下降，河豚毒素加硫酸软骨素作为稳定剂，其含量随时间增长基本无大变化，因此硫酸软骨素作为稳定剂阻止了河豚毒素差向异构化，在常温条件下保持稳定。一、河豚毒素(TTX)急性毒性实验选取18—22克小白鼠50只，随机分为5组，每组10只。将TTX分别配成浓度为2Ug/ml、1ug/ml、0.78Ug/ml、0.4yg/ml、0.2ug/ml的溶液。每只小白鼠肌肉注射TTX溶液0.4ug/10克，左右后腿各一半，饲养观察10天，记录动物死亡数。结果lug/ml浓度下肌肉注射的小鼠全部死亡，而0.4ug/ml以下浓度肌肉注射小鼠全部未死亡，LD50浓度范围在1"g/ml至U0.4ug/ml之间。选取18—22克的小白鼠150只，随机分为5组，每组30只，雌雄各半。TTX溶液给药剂量分为20ug/ml、18yg/kg、16.2ug/kg、14.58Pg/kg、12.56ug/kg，小白鼠肌肉注射后，饲养观察10天，记录动物死亡数，随时挑出死亡动物。统计结果如表2:表2:TTX肌肉注射LD50实验结果:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>183010015.43516.2307011.18314.583033.39.75112.56306.676.962求得LD50=15.18+1.085wg/kg二、河豚毒素注射液30天亚急性毒性试验方法和结果选取健康SD大白鼠120只，随机分成四组，每组30只，雌雄各半并分笼词养，每天定时给水换饲料，搞好动物饲养卫生。连续30天肌肉注射TTX注射液，于四肢肌肉依次注射。TTX注射液高、中、低三个剂量组剂量分别为5.2"g/kg、3ug/kg、2.2Pg/kg。对照组注射等量盐水0.2ml/100g，给药期间，每3天称动物体重一次，观察记录动物的活动状况及尿液粪便情况。给药30天后，取血30天后，取血液测试红细胞、白细胞及血红蛋白量并进行白细胞分类计数。测试血液谷丙转氨酶(SGPT),谷草转氨酶(SGOT)活性及血液尿素氮(BUN)含量，来评价动物肝、肾功能的状况，对动物进行大体解剖，称取心、肝、脾、肺、肾等主要脏器重量，并对心、肝、肺、肾、脑、子宫、睾丸等几种主要脏器进行组织学切片，光学显微镜观察。评价器官有无病理变化。1、给药过程中动物活动状况及体重变化TTX注射液高、中、低剂量组肌注30天，中、低剂量组动物活动正常，尿液和粪便与对照组比较无显著性差异。动物体重与对照组比较也无显著变化；TTX注射液高剂量组在肌注3天，有一只雌性鼠死亡，肌注第7天有一只雄性鼠死亡。观察死亡症状，是属于毒性致死，主要器官无明显变化。2、对血液血象的影响TTX注射液高、中、低三个剂量组连续给药30天后动物血液红14细胞数、白细胞及血红蛋白含量与对照组比较无显著差异。3、对白细胞分类的影响TTX注射液三个剂量组分别连续给药30天，对各种类型白细胞无显著性影响。4、对血液SGP!ASGOTABUN等生化指标的影响TTX注射液高、中、低三个剂量组连续给药30天，血液中SGPT、SGOT、活性和BUN含量与对照组比较，无显著性差异，实验结果表明，在现有剂量下，TTX注射液对肝、肾功能无显著性影响。5、动物大体解剖及主要脏器的影响TTX注射液高、中、低三个剂量组连续肌注30天后，经对动物大体解剖观察，动物主要脏器包括心、肝、肺、肾、脑、子宫、睾丸、胃肠，均未见异常症理现象。实验证明，TTX注射液肌注30天，在一定剂量范围内不会产生慢性毒性反应。.三、TTX注射液成瘾性试验1、小鼠竖尾试验体重14—16克小鼠40只，随机分成四组分别给SC吗啡15—20mg/kg，TTX0.1—2.6ng/kg。观察24小时内小鼠活动情况，吗啡组小鼠出现S形竖尾反应、兴奋、跑动，而TTX组小鼠无竖尾反应，外观和未注射前几乎无区别。8小时后重复以上试验，吗啡组小鼠竖尾现象更为明显。而TTX组仍无竖尾现象。证明TTX不属于吗啡类药物，无成瘾性。另取小鼠40只，随即分组，分别SC吗啡和TTX，然后进行交叉试验。吗啡组从20mg/kg逐渐增至25天后的45mg/kg，TTX组从0.1ug/kg增至2.6ug/kg，吗啡组均有竖尾现象，而TTX组则无。25天后原吗啡组小鼠改用TTX2.6ug/kg，动物无竖尾，而将TTX组改用15吗啡45mg/kg则小鼠出现竖尾现象。2、小鼠跳跃反应试验采用纯种小鼠30只，每组10只，A组SC吗啡2.5mg/kg，B组TTX0.5ug/kg和等体积生理盐水NS(C组)，第一天注射5次，(注射时间为9:00、10:00、11:00、13:00、15:00)第二天注射2次(注射时间为9:00、11:00)，剂量递增。在末次给药2小时iP烯丙吗啡50mg/kg，观察小鼠10分钟内小鼠跳跃反应，可见吗啡组在iP烯丙吗啡后出现跳跃反应。采用纯种小鼠体重10—24克，分别分为A、B、C组，每组30只，A组每天皮下注射盐酸吗啡剂量为80mg/kg，连续注射20天，B组每天皮下注射TTX0.5ug/kg，连续注射20天，C组为生理盐水对照组，于最后一次给药后6小时，给各组小鼠注射烯丙吗啡50mg/kg，然后将小鼠入塑料筒(25*5cm)观察小鼠反应，并记录60分钟内小鼠的跳跃反应。吗啡组小鼠(A)在给药后显得很兴奋，跑动频繁，竖尾现象明显，注射烯丙吗啡后，小鼠出现明显跳跃反应。TTX组(B)小鼠给药后，外观同时对照，无竖尾反应，在注射烯丙吗啡后均不见跳跃反应。试验结果表明，TTX明显区别于盐酸吗啡组，说明TTX无药物依赖性。3、猴成瘾试验恒河猴8只体重2.58—4.85kg，取4只每日各注射TTX(皮下)两次，剂量由0.5ug/kg开始，在50天内逐渐增至最大耐受量7.5ug/kg，然后按此剂量分别维持到52天、68天、和第94天，4只猴的累计注射剂量分别为1:8、4.2、6.1、7.3"g/kg。第64天和93天，分别停止给猴注射TTX，观察24小时，结果猴的外观行为、食欲与停药前无异常，在给药第28天、54天、58天和69天分别停药，20小时后皮下注射烯丙吗啡5—10mg/kg，均未见猴外观出现戒断症状。另4只猴分别皮下注射吗啡两次，始量为6mg/kg，于第2天递增至28mg/kg，然后按此剂量维持，30天后猴已对吗啡产生依赖，停止注射吗啡48小时后，猴子外观出现明显戒断综合症，表现有在笼内烦躁不安，翻滚，时而趴卧笼底，乱抓，嚎叫、呕吐，全身发抖等。此时给猴注射(皮下)烯丙吗啡，上述症状更为明显，此时给猴皮下注射TTX0.5—2.5Pg/kg，上述症状明显减弱或消失。这表明TTX具有抵抗吗啡戒断综合症的药的作用。四、河豚毒素治疗杜冷丁类药物依赖临床治疗观察1、对象和方法所有观察对象是自愿戒毒患者。30例均符合CCMD—2R，DSM—III，精神活性物质所致精神障碍一阿片依赖诊断标准。男性20人，女性10人，年龄20—30岁12人、31—40岁16人，40岁以上2人。使用方法肌肉静注22人，杜冷丁和海洛因混合使用者8人。吸毒时间1年以下10人，1—2年6人，2年以上14人。瘾量1000mg以下8人，1000—3000mg以上19人，3000mg以上3人。详见表3。河豚毒素注射液每支含量0.48yg/ml。用药方法根据扎毒的时间长短及戒断症状反应的轻重，及瘾量的大小，采取不同的给药方法及药用量。一般采取每晚一次性给lml河豚毒素制剂肌肉注射给药，河豚毒素注射液加50%葡萄糖20ml静脉注射，个别的戒断症状重的采取二次/日的给药方法，或辅助给小剂量的镇静药，如安定和抗焦虑剂多虑平等。2、观察方法进行病史调查，体格检查。治疗前后各查一次血尿便常规、肝功、心电图，尿液毒物检测，纳洛酮促瘾试验。戒断症状观察量表，参考北京药物依赖研究中心所制定的阿片依赖戒断反应观察量表。不良反应观察除每日测量体温，呼吸、心率、血压外还要观察治疗药物不良反应。纳洛酮促瘾试验治疗前和治疗后各做一次。3、观察结果治疗时尿液毒物检测30例全部阳性，给河豚毒素注射液后均转为阴性。治疗时纳洛酮促瘾试验30例均呈阳性，用河豚毒素注射液治疗七天后，经复查均呈阴性。戒断症状变化情况(1)、精神状态及行为活动方面焦虑不安，好争吵闹事，困倦.失眠，消失时间最短1天，最后6—7天，平均1一9天。(2)躯体症状头痛、肌肉痛、骨痛、消失时间最短1天，最长3天，平均1一2天。(3)植物神经系统症状哈欠、出汗、汗毛竖立。交感神经系统症状，流涕、流泪，食欲不振、恶心呕吐、腹泻、胃肠痛(副交感神经系统)，消失时间最短1—2天，最长7—8天，平均4—8天。观察表明河豚毒素对缓解肌肉痛、骨痛、有明显的镇痛作用。辅助镇静药安定片和小剂量的抗焦虑药，能抑制和縮短焦虑、不安，失眠等症状的出现，对其他戒断症状寒战，乏力、食欲不振、恶心、呕吐、也有改善的作用。(详见表4)不良反应观察出有个别病人在肌肉注河豚毒素注射液后感觉面部疼痛和恶心，改静脉注射后症状小时。再未见其他不良反应。4、讨论通过30例杜冷丁依赖患者应用河豚毒素制剂注射脱瘾治疗，收到很好效果。它具有脱瘾快、治疗时间短戒断瘾小时快，病18人无痛苦、无明显副作用。表3:观察对象特点与基本数据性别男22人女8人用毒方法肌注22人肌注和静注10人用毒种类杜冷丁23人杜冷丁和海洛因7人年龄20—30岁12人31岁一40岁16人40岁以上2人脱瘾年限一年以下ll人1一2年9人2年以上10日瘾量1000mg以下9人1000—3000mgl9人3000mg以上2人表4:戒断症状变化情况戒断症状消失时间平均天数消失时间最长天数消失时间最短天数精神症状4—9天8天2天植物神经症状1—8天7天l天躯体症状3天6天l天19权利要求1、河豚毒素的提取，包括原液提取、树脂交换和洗脱步骤，第一步原液提取取菊黄东方豚卵巢，切成1—2cm片状小块，用0.1％—0.5％HAC溶液浸泡、搅拌，48小时后用甩干机甩干得原液，加热至沸腾，立即停止加热，除去凝固蛋白，原液冷却后用50—80目筛初滤，再经白陶土——纸浆过滤，得浅黄色透明原液，卵渣继续分次浸泡24小时，重复上述步骤收集滤液，共取得原液20L，用氨水调制PH5—7，加1—5％正丁醇或1—2％甲醛防腐，常温放置备用；第二步树脂交换树脂为D152阳性大孔丙烯酸弱酸性树脂，经常法处理转NH4型，双柱两次交换，A柱为玻璃柱内下层装树脂，上层装硅藻土；B柱为玻璃柱内下层装中性氧化铝，上层装树脂；A柱原液上树脂柱进行交换，流速100—120ml/min，树脂交换后期用小鼠毒性跟踪，当小鼠显中毒反应时，表明树脂交换已达饱和程度，停止原液上柱，用去离子水冲洗至流出液无色，茚三酮试验阴性止，收集有毒馏分流出液；B柱将A柱所收集的有毒馏分，用氨水调PH值为7，开始上柱，流速30—50ml/min，当流出液PH7时，小鼠毒性跟踪显毒性反应时，停止上柱，用去离子水(200L)冲洗柱，收集强毒馏分；第三步洗脱A柱用12％的HAC液洗脱，流速30—40ml/min，当流出液PH7，小鼠毒性跟踪显毒性反应时，分步收集有毒馏分，毒素高峰在PH6.5—4.5之间；B柱将A柱树脂洗脱所得的有毒馏分，用氨水调PH6—7，上柱，用10％HAC洗脱，流速50ml/min，流出液PH7，小鼠跟踪显毒性反应时，分步收集强毒馏分，弱毒部分做下次浸泡用，共收集强毒馏分置于0—5℃冷藏存放备用。2、根据权利要求1所述的河豚毒素的提取，其特征是还包括结晶步骤，在洗脱后进行第四步结晶将B柱树脂交换和洗脱的强毒馏分，分次真空减压浓縮，-10°。放置24小时后，取出融化解冻并加8M氨水调PH8—9，震动搅拌，析出白色沉淀物，滤取沉淀物，沉淀物用蒸馏水反复洗涤3-5次，用2°/。一5%HAC液溶解，滤除不溶物杂质，溶液中加8。/oNH4水调PH8—9，0—5度冷藏放置24小时，取出再进行上述重结晶2-3次，得河豚毒素粗品结晶。3、根据权利要求2所述的河豚毒素的提取，其特征是第四步结晶粗品结晶经高效液相色谱分离纯化得纯品河豚毒素结晶，经高效相色谱分析，纯度为99%。4、根据权利要求.1-3任一所述的河豚毒素的提取，其特征是第二步树脂交换B柱中性氧化铝经180度活化处理2小时，冷却后湿法上柱，氧化铝先上柱，然后树脂上柱，使氧化铝在柱的下层，树脂在柱的上层。5、根据权利要求1-3任一所述河豚毒素的提取制得的河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂，其特征是lml制剂中含有河豚毒素0.01-0.49Pg/ml，含有河豚毒素20-40倍重量份的稳定剂硫酸软骨素。6、根据权利要求5所述的河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂，其特征是lml制剂由下述原料配制而成河豚毒素0.48iig0.5%枸橼酸0.002ml硫酸软骨素9.6ixg注射用水余量。7、根据权利要求5所述河豚毒素用于杜冷丁类药物依赖的制剂，其特征是用于杜冷丁类药物依赖的制剂的制备方法取河豚毒素溶于0.5%枸橼酸溶液中，硫酸软骨素溶于注射用水，两溶液混合后加入注射用水，调PH值4一6，充分搅拌均匀，经除菌过滤、超滤，在无菌条件下计量灌装入安瓶中，半开塞送冷冻干燥机-40度预冷，打开冷井制冷，温度降至-55度时启动真空泵，真空泵在真空度5帕以下，维持24小时，然后升温在30度维持14小时压塞、扎盖。全文摘要本发明涉及河豚毒素的提取，另外还涉及河豚毒素的制剂。河豚毒素的提取，第一步原液提取取菊黄东方豚卵巢，HAC溶液浸泡取得原液；第二步树脂交换树脂为D152阳性大孔丙烯酸弱酸性树脂，经常法处理转NH4型，双柱两次交换，A柱为玻璃柱内下层装树脂，上层装硅藻土；B柱为玻璃柱内下层装中性氧化铝，上层装树脂；双柱交换后再进行第三步洗脱双柱洗脱后合并交换和洗脱收集的强毒馏分，结晶得河豚毒素粗品结晶。本发明河豚毒素提取方法提高了产品的收率和纯度。制剂贮藏期限更长，用于脱瘾治疗，具有起效快，控制症状彻底，过度平稳，易接收等特点。文档编号C07D491/00GK101475575SQ20091001030公开日2009年7月8日申请日期2009年2月5日优先权日2009年2月5日发明者王维国申请人:王维国