基于内吗啡肽2或Biphalin的棕榈酰化修饰的阿片肽类似物及其合成和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一类阿片肽类似物的合成，尤其涉及一类基于阿片肽内吗啡肽2、 Biphalin通过棕榈酰化修饰而构建的全新阿片肽类似物及其合成方法；本发明同时还涉 及该类阿片肽类似物在镇痛药物制备中的应用，属于医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 疼痛是一种令人不快的感觉和情绪上的感受，伴随有现存的和潜在的组织损害， 可导致整体生活质量下降1986，3:S1-226)。目前，包括吗啡、杜冷丁和芬太尼等在 内的阿片类镇痛药物是临床应用最广泛的镇痛药物。并且，经过长期的临床实践和应用，阿 片类镇痛药物已被证实在多种急性和慢性疼痛治疗中均具有高效的镇痛活性，已成为临床 中、重度疼痛治疗的一线药物。阿片类镇痛药物主要是通过y-阿片受体来介导其镇痛作 用的1997，386:499-502)。因此，针对阿片受体类的新药研究和开发一直是镇痛 药物研发中"热点"。大量的研究表明，阿片肽也能通过作用于阿片受体而介导高效的镇痛 活性。而多肽药物普遍具有高效、低作用剂量、低副作用的优点，阿片肽在镇痛新药研发中 具有广泛的应用前景。
[0003] 已有的研究发现，内吗啡肽2和Biphalin这两种阿片肽均具有高效的镇痛的作 用。内吗啡肽2(EM-2，Tyr-Pr〇-Phe-Phe-NH2)是1997年从哺乳动物牛脑组织中分离出来 的y-阿片受体的内源性配体，对y-阿片受体具有很高的亲和力和特异选择性，并广泛分 布于人中枢神经系统（CNS)中。相关药理学活性研究表明，在热板实验、甩尾实验、福尔马林 痛实验模型及抗痛敏模型中，EM-2都能产生有效的中枢镇痛作用。而且，低剂量的EM-2在 神经痛模型中就能产生镇痛作用。而Biphalin( [Tyr-(劝Ala-Gly-Phe-NH]2)是Lipkowski 等人于1982年发现的一种高效镇痛的阿片肽，它是内源性阿片肽脑啡肽的类似物。进一步 药理学活性研究表明，Biphalin可显著地增强其镇痛活性。其在体内和体外实验中作用的 效价大于吗啡，中枢和腹腔注射时都能引起极其高效的镇痛作用。因此，以阿片肽内吗啡肽 2和Biphalin可作为化学模板，通过进一步的化学修饰来提高其生物利用度，以用于镇痛 新药的研发。
[0004] 目前，阿片肽可通过化学的修饰来提高其受体选择性，而获得具有优势构象的阿 片肽类似物，这些化学修饰手段主要为非天然氨基酸的引入、环化、脂化、糖基化等（ifed K. 2012，32 (3): 536-80)。脂化修饰不仅可提高多肽分子的脂溶性，还能显著地增 强其稳定性，有效防止多肽分子被体内水解酶所降解，同时，还影响了药物的吸收、分布、排 泄和生物利用度，所以脂化修饰是多肽药物的化学修饰和结构优化中的有效策略之一。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对内吗啡肽2、Biphalin两种阿片肽类在镇痛剂量范围内伴随 一些副作用且稳定性差等弱点，提供了一种基于内吗啡肽2或Biphalin的棕榈酰化修饰的 阿片肽类似物，以增强其镇痛活性。
[0006] 本发明的另一目的是提供一种上述基于内吗啡肽2或Biphalin的棕榈酰化修饰 的阿片肽类似物的化学合成方法。
[0007] 本发明还有一个目的，就是提供上述阿片肽类似物的镇痛活性及在制备镇痛药物 中的应用。
[0008] 一、棕榈酰化阿片肽类似物 本发明棕榈酰化阿片肽类似物，是基于具有高效镇痛活性的阿片肽内吗啡肽2或Biphalin，通过棕榈酰化修饰化学构建而成的一类全新的阿片肽类似物。其结构式如下：
化合物簾。
[0009] (二）棕榈酰化阿片肽类似物的合成 本发明阿片肽类似物的合成，是以高效阿片配体内吗啡肽2或Biphalin为化学模板， 在保留其关键"药效团"的前提下，在其C末端连接3个Lys(多个Lys是为了提高溶解性)， 再通过C末端第一个Lys侧链氨基上化学连接一个Y-Glu，然后经棕榈酸酰化修饰而获得。 其具体合成工艺如下： (1)树脂的预处理：将Rink-Amide-MBHA树脂在二氯甲烷中搅拌，使树脂充分溶胀后减 压抽干溶剂。
[0010] (2)脱除Fmoc保护基：在溶胀、抽干溶剂的树脂中，加入六氢吡啶（Piperidine)、 1，8-二氮杂环^^一碳-7-烯（DBU)及DMF的混合溶液，搅拌反应:T5min后抽干，重复3次， 最后加DMF洗涤，茚检，得到脱除Fmoc基团保护的树脂；混合溶液中，六氢吡啶、1，8-二氮 杂环i^一碳-7-烯、DMF的体积比为1:1:98。
[0011] (3)连接子Lys的缩合：将等摩尔比的N-(9-芴甲氧羰酰基）-N'_甲基三苯甲 基-L-赖氨酸Fmoc-Lys(Mtt) -〇H、N-羟基苯并三氮唑、0-苯并三氮唑-N，N，N'，N' -四甲基 脲-六氟磷酸盐完全溶解于DMF中混匀，再在混合溶液中加入二异丙基乙胺；混匀后加至步 骤（2)所得脱除Fmoc基团保护的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60min，抽干溶剂；用DMF 重复洗涤、抽干，茚检后按步骤（2)的工艺脱除Fmoc基团保护，得到脱除Fmoc保护基团的 肽树脂； Fm〇C-Lys(Mtt)-0H的加量为脱除Fmoc基团保护的树脂摩尔量的2~4倍；二异丙基乙 胺的加入量为Fmoc-Lys(Mtt) -0H摩尔量的2倍。
[0012] (4)主链延长：将步骤（3)所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤（2)、步骤（3) 的工艺，依次完成Fmoc_Lys(Boc)-〇H，Fmoc_Lys(Boc)-〇H，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Phe-OH或 Fmoc-Gly-〇H，Fmoc-Pro_OH或Fmoc-(劝Ala-〇H，Boc_Tyr(tBu)-OH的缩合和脱Fmoc基团保 护，并保留Boc-Tyr(tBu) -〇H的Boc保护基团，得到肽树脂Boc-Tyr(tBu) -Pro-Phe-Phe-Ly s(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Resin或Boc-Tyr(tBu)-(劝Ala-Gly-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc )-Lys(Mtt)-Resin。
[0013] (5)Lys侧链Mtt保护基团的脱除：将步骤（4)得到的肽树脂抽干溶剂后，加入体 积浓度1%~1. 5%三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，搅拌90~120s后抽干，重复50次；最后加入 DMF冲洗，得到脱除Lys侧链Mtt基团保护的肽树脂Boc-Tyr(tBu) -Pro-Phe-Phe-Lys(Boc )-Lys(Boc)-Lys-Resin或Boc-Tyr(tBu)-(劝Ala-Gly-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys-Res in〇
[0014] (6)Lys侧链的棕榈酰化修饰：将步骤（5)所得肽树脂按步骤（2)、步骤（3)的工艺 依次完成Fmoc-Glu-OtBu的缩合和脱Fmoc基团保护，茚检，得缩合和脱除Fmoc基团保护 的树脂；再将等摩尔比的棕榈酸、N-羟基苯并三氮唑、0-苯并三氮唑-N，N，N'，N' -四甲基 脲-六氟磷酸盐完全溶解于DMF中，混匀后加入二异丙基乙胺，混匀后加入到上述缩合和脱 除Fmoc基团保护的树脂，搅拌反应4~6小时，抽干，用DMF洗涤，得Lys侧链棕榈酰化的肽 树脂。上述棕榈酸的量为缩合和脱除Fmoc基团保护的树脂摩尔量的2~4倍；二异丙基乙胺 的加入量为棕榈酸摩尔量的2倍。
[0015] (7)肽链从树脂上的切割：将步骤（6)所得Lys侧链棕榈酰化的肽树脂用二氯甲 烧、甲醇交替洗涤，充分抽干溶剂后，加入切割剂，于室温下切割反应2~3小时；过滤，滤液 在不高于37°C的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10°C的乙醚析出沉淀，加水充分溶 解沉淀，分离除去水相中的乙醚；水相通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末。
[0016] (8)粗肽的脱盐和纯化：以体积浓度15~20%乙酸溶液为流动相，将粗肽固体粉末 过SephadexG25交联葡聚糖凝胶柱；利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得脱盐的肽化 合物；再用反相高效液相色谱柱对脱盐的肽化合物进行分离纯化，经分离后收集样品主峰， 即为目标产物。
[0017] 上述方法制备的产物经质谱和色谱分析检测，与设计的化合物结构一致。表明成 功合成了棕榈酰化修饰的阿片肽类似物化合物及化合物_ ;纯化后样品纯度为98%以上。
[0018] 三、棕榈酰化阿片肽类似物的镇痛实验 下面通过体内实验说明本发明设计合成的两种阿片肽类似物在痛觉调节方面的药理 学功能。在多种痛模型中，检测化合物和化合物i:这两种药物在侧脑室注射水平的镇痛活 性。实验过程中，环境温度控制在22 ± 1 °C;实验动物可自由进食、饮水。为了确保药物 注射位点的准确性，需要提前4天对实验所用小鼠进行侧脑室埋管手术。药物均用生理盐 水溶解，_2〇°C保存，使用前解冻。小鼠侧脑室每次注射4yl药物，然后用1yl生理盐水 冲洗管道。
[0019] 1、化合物i和化合物_在光热甩尾急性痛中的镇痛活性研究 本发明的化合物I:、化合物II和阴性对照生理盐水，通过侧脑室注射后，利用小鼠光热 甩尾实验进行体内痛觉调节作用的活性检测。