一种泥螺寡肽在抗肺癌中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及泥螺酶解寡肽的应用，具体涉及一种泥螺寡肽在抗肺癌药物中的应 用。
【背景技术】
[0002] 泥螺（Bullactaexarata)，俗称"吐铁"、"黄泥螺"、"梅螺"等，属软体动物门、腹足 纲、后鳃亚纲、头楣目、阿地螺科、泥螺属，为太平洋西岸海水及咸淡水特产的种类，由贝壳 和软体两部分组成，含有丰富的蛋白质、钙、磷、铁和维生素等成分，寡肽物质丰富，在我国 广泛分布于东海和黄海两侧的长江，是一种常见的水产品。
[0003] 恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康和生命的疾病，发病率越来越高，目前已有的 化疗药物虽对大多数肿瘤有一定的疗效，但选择性差、毒副反应大、耐药性等问题依然非常 明显。因此，寻找高效、低毒、特异强的抗肿瘤药物仍势在必行。寡肽因其分子量小、无免疫 原性、活性高、副作用小，尤其是对多药抗性的肿瘤细胞系也有很好的抑制活性。海洋生物 寡肽是目前海洋生物活性物质研究的一个重要领域，一些生物活性寡肽常以非活性状态存 在于蛋白质中，这些蛋白质经过蛋白酶的水解作用，使得隐藏于其中的活性肽释放出来，有 可能发挥出比蛋白质更多的生物活性。例如：如邓伟等发现藻蓝蛋白酶解寡肽对人宫颈癌 HeLa细胞株的体外生长有明显的抑制作用；杨永芳等酶解紫贻贝所得的紫贻贝寡肽对前 列腺癌PC-3细胞和DU-145细胞有特异性的增殖抑制作用，并且对DU-145细胞的抑制作用 强于对PC-3细胞的增殖抑制作用；姚如永等研究泥蚶寡肽在0. 25-1. 0g·L1范围内，寡肽 能明显的抑制肺癌细胞A549和Ketr-3细胞的增殖，同时还能抑制细胞蛋白质的合成，并呈 明显的剂量依赖性。
[0004] 肺癌是对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，近年来许多国家都报道肺癌 的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女 性发病率占第二位，死亡率占第二位。研究泥螺酶解寡肽对肺癌H1299肿瘤细胞的抑制作 用，对研究泥螺寡肽在抗肺癌药物中的应用具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是在酶解泥螺组织获取泥螺寡肽的基础上，提供一种 泥螺寡肽在抗肺癌药物中的应用，尤其是抗肺癌H1299肿瘤细胞。
[0006] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种泥螺寡肽在抗肺癌H1299细 胞药物中的应用，其中药物的具体实现形态可为片剂、胶囊剂、颗粒剂或丸剂等。
[0007] 所述泥螺寡肽的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所述。
[0008] 上述泥螺寡肽通过以下步骤制得：新鲜泥螺洗净去壳，取泥螺组织捣碎，加入蒸馏 水匀浆，料液比为1: (3~4)，用盐酸溶液和氢氧化钠溶液将匀浆液的pH值调节为8~9， 加入0. 4~0. 5%匀浆液体积的胰蛋白酶，40~50°C保温水解7~9h，水解完成后95~ 100°C、10~15min进行灭酶，4°C下水解液于9500~10000r/min离心15~20min，取上清 液，经3kd超滤膜超滤获得分子量小于3kd的第一组分，将该第一组分经凝胶层析洗脱收集 最低峰获得第二组分，最后将该第二组分反相高效液相色谱分离获得所述泥螺寡肽。
[0009] 作为优选，所述凝胶层析条件如下：所述第一组分的浓度为48~50mg/mL、上样量 为3~4mL、速度为2. 5~3. 5ml/min，流动相为超纯水，280nm紫外检测。
[0010] 作为优选，所述反相高效液相条件如下：选用Zorbax SB-C18(4.6X250,5um);柱 温为20°C;流动相为1 %TFA和乙腈；梯度洗脱：从开始到30min结束，乙腈浓度从0变化 到40%，洗脱速度为1.OmL/min;进样体积为50ul，紫外检测波长分别为214nm、280nm。
[0011] 进一步，6~14mg/ml所述泥螺寡肽作用于H1299细胞24~36h后，对肺癌H1299 细胞的增殖抑制率为21. 3~74. 3%，且增殖抑制率与泥螺寡肽的浓度呈正相关。
[0012] 再进一步，6~14mg/ml所述泥螺寡肽作用于H1299细胞24h后，对肺癌H1299细 胞的早期凋亡和晚期凋亡的影响率分别为15~19. 74%和33~36. 43%，且增殖抑制率与 泥螺寡肽的浓度呈正相关
[0013] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明利用泥螺为原料，通过酶解提取泥螺 寡肽，泥螺为一种低值贝类，在我国广泛分布，来源广，成本低，并且本发明中泥螺寡肽的提 取方法温和易控，工艺简单，操作方便。本发明中的泥螺寡糖可对肺癌H1299肿瘤细胞显著 抑制，其中对H1299细胞的增殖抑制率可达21. 3~74. 3%，对肺癌H1299细胞的早期凋亡 和晚期凋亡的影响率分别为15~19. 74%和33~36. 43%，可见具有显著地抗肿瘤活性。 泥螺寡肽具有良好的开发前景，对泥螺寡糖的抗肺癌H1299肿瘤细胞的研究可为抗肺癌药 物的开发研究提供理论支持。
【附图说明】
[0014] 图1为实施例1中第一组分的凝胶层析图谱；
[0015] 图2为实施例1中第二组分的高效液相色谱图；
[0016] 图3为实施例4中泥螺寡肽对肺癌H1299肿瘤细胞的增殖抑制作用与作用时间和 作用浓度关系折线图；
[0017] 图4为图3的柱状图；
[0018] 图5为实施例4中不同浓度的泥螺寡肽作用于与H1299细胞后的HE染色图，A:对 照组，B:6mg/ml，C: 10mg/ml，D: 14mg/ml;
[0019] 图6为实施例4中不同浓度的泥螺寡肽作用于与H1299细胞后的Α0/ΕΒ双染荧光 图，A:对照组，B:6mg/ml，C: 10mg/ml，D: 14mg/ml;
[0020] 图7为实施例4中不同浓度的泥螺寡肽作用于与H1299细胞后的Annexin V-FITC/PI染色结果图，A-1:对照组，A_2:6mg/ml，A_3:10mg/ml，A_4:14mg/ml。
【具体实施方式】
[0021] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0022] 实施例1 :泥螺寡肽的制备
[0023] (1. 1)原料处理
[0024] 取新鲜泥螺，将泥螺去壳、浙干后匀浆备用。
[0025](1. 2)泥螺酶解工艺
[0026] 用高速组织捣碎机将泥螺组织捣碎匀浆，精密称取匀浆液，用0.lmol/L的盐酸 溶液和〇.lmol/L的NaOH溶液调pH值，加入胰蛋白酶酶解数小时，酶解条件为酶解温度 45°C，pH为8. 7,料液比1:4,酶解时间8h，加酶量0. 48%。100°C下灭酶15min，4°C下离心 15min(10000r/min)，取上清液浓缩备用。
[0027] (1. 3)泥螺多肽的分离纯化
[0028] 首先选用超滤法对泥螺多肽酶解液进行分离，超滤膜分别选用10kd，5kd，3kd，分 别截留到分子量l〇-5kd、5-3kd和小于3kd三个组分，冷冻干燥后分别配成20mg/mL的浓 度，用MTT法测定各个组分对肺癌H1299的抑制率。选出活性最高的第一组分（分子量小 于3kd)，选用SephadexG-25凝胶层析，装柱后用去离子水平衡，浓度为50mg/mL、上样4mL、 速度为3ml/min，流动相为超纯水，280nm紫外检测，凝胶层析曲线如图1所示，收集最高洗 脱峰冷冻干燥成粉末，检测对H1299细胞的增殖抑制率，并绘制曲线得出IC5。，将活性最高 的第二组分大量收集冷冻干燥进行高效液相色谱分析获取泥螺寡肽。
[0029] 将冷冻干燥好的第二组分用0.06%TFA的水溶解到0.6ml的离心管中，在 12000rpm，离心10min取上清液。高效液相条件：ZorbaxSB-C18(4.6X250,5um);柱温为 20°C;流动相为1 %TFA和乙腈；梯度洗脱：从开始到30min结束，乙腈浓度从0变化到40%， 洗脱速度为L〇mL/min;进样体积为50ul紫外检测波长分别为214nm、280nm。高效液相色 谱图如图2所述，分别收集洗脱峰A，即得泥螺寡肽。
[0030] 实施例2:泥螺寡肽氨基酸序列的测定
[0031]目标多肽的氨基酸序列分析采用N末端氨基酸降解检测方法测定。建立标准氨 基酸图谱：利用混合氨基酸标准品（PTH-AA)，在常规条件下运行生成一张标准品色谱图， 对混合氨基酸标品的保留时间进行校正，生成标准方法文件。样品前处理：将纯样品离心 后取上清液备用；将聚凝胺（P〇lybrene)15ul加到玻璃纤维膜（GlassFiberDisk)上氮 气吹干；上机将玻璃纤维膜预处理，即运行5个循环将足量纯样品点加到预处理后的玻璃 纤维膜上，氮气吹干。上机检测：将加好样品的玻璃纤维膜用PTFE滤膜封置于蛋白测序仪 PPSQ-31A的反应器里，设定检测氨基酸数及其他参数。
[0032] 本实施例中，收集经高效液相色谱分离的泥螺寡肽，经检测该肽的氨基酸序列如 SEQIDNO. 1 所述。
[0033] 实施例3 :Η1299细胞的培养与传代
[0034] (3. 1)细胞复苏
[0035] 从液氮罐中取出存放的Η1299细胞株，快速的放入37°C恒温水浴锅中进行融化， 待融化后进入无菌工作室进行操作，用灭菌好的吸管将细胞株吸入离心管，加入2mL的F12 营养液或RPMI1640营养液，lOOOrpm离心10min，去上清液，加入4ml的营养液，反复吹打使 细胞成为单个细胞。然后用吸管将细胞均匀的吸入到2个25mL的培养瓶中，放入5%C02、 37°C的恒温培养箱培养，次日换液倒掉未贴壁的死亡细胞。
[0036](3. 2)细胞培养
[0037]将人肺癌细胞H1299接种到分别含有10 %胎牛血清（体积分数）FBS和双抗（青 霉素G100IU/mL、链霉素100IU/mL)的F12和1640营养液中，放置于37°C、5%C02的恒温培 养箱中培养，细胞贴壁生长，每1天换液一次，待细胞长满培养瓶的80 %左右时进行传代。 按照1 : 2的比例进行传代，收集对数生长期细胞进行实验。
[0038] (3· 3)细胞传代
[0039] 先将长满细胞的培养瓶从恒温培养箱中取出放到无菌操作台上。传代时，先倒掉 瓶中的营养液，去除不贴壁生长的死细胞，用〇. 25%胰蛋白酶/0. 02%EDTA消化液混合消 化，不同细胞消化的时间不同，一般消化时间为3-5min;显微镜下观察细胞，当细胞间隙明 显变大且细胞变圆变亮时，说明细胞已经消化完毕，去掉消化酶液。在培养瓶中加入2. 5mL 左右的营养液，反复吹打消化好的贴壁细胞使之成为单个细胞，一般情况下一瓶细胞传2 瓶，将传代好的细胞置于37°C、5%C02的培养箱中进行培养。
[0040] (3. 4)细胞冻存
[0041] 显微镜下观察，当细胞长到培养瓶的80%左右，选细胞形态好的进行冻存，倒去培 养液，加入消化液对细胞进行消化，镜下观察细胞间隙明显时倒掉消化酶，再向培养瓶中加 入3mL左右的营养液，反复吹打使之成为单个细胞，吸入离心管内，lOOOrpm，离心lOmin，小 心的吸弃