一种具有抗肺癌作用的寡肽及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及寡肽及其应用，尤其涉及一种具有抗肺癌作用的寡肽及其应用。
【背景技术】
[0002] 寡肽（也称小肽）是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。自从生物化学 家用人工方法合成小肽40多年以来，伴随着分子生物学，生物化学技术的飞速发展，寡肽 (小肽）的研究取得了惊人的，划时代的发展。
[0003]目前发现存在于生物体的小肽已有数万种，并且发现所有的细胞都能合成小肽， 并几乎所有也都受小肽的调节，它涉及激素，神经，细胞生长和生殖等各个领域。寡肽作为 动物消化道蛋白质的主要酶解产物，是迅速吸收的氨基酸供体，同时释放的肽具有活性作 用，能够调节机体的生命活动。多肽类药物的研究主要包括抗肿瘤多肽、抗菌性活性肽、多 肽导向药物、多肽疫苗、细胞因子模拟肽、诊断用多肽及其它药用小肽等方面。多肽类药物 的主要特点是用量小，生物活性强，对癌症、自身免疫性疾病、记忆力减退、精神失常、高血 压和某些心血管及代谢等疾病有显著的疗效。随着医学及生化技术的发展，多肽类药物将 成为21世纪重要的诊断、监测、预防和治疗药，具有广阔的前景。因此，研究和开展多肽药 物具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术，本发明要解决的问题是提供一种具有抗肺癌作用的寡肽及其应 用。
[0005] 本发明所述的具有抗肺癌作用的寡肽，其特征在于：该寡肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0006] 具体的，SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列描述是：
[0007] Arg Cys Cys Ser Gly Pro
[0008] 上述寡肽氨基酸数目为6个，不需任何修饰连接，为线性多肽，且人工合成方便； 试验证明其具有抑菌与抗癌细胞生长两种功能，同等浓度下对人正常细胞生长无抑制活 性，显示对人正常细胞无毒性。
[0009] 本发明所述寡肽在制备抗癌药物中的应用。
[0010] 实验显示：本发明所述寡肽能抑制肺癌、胃癌、宫颈癌细胞株的生长，提示其在癌 症临床治疗中具有重要的开发和应用价值。
[0011] 上述制备抗癌药物中的应用中，所述抗癌药物优选是抗肺癌药物。
[0012] 进一步的实验显示：本发明的寡肽对肺癌细胞株及人肺癌紫杉醇抗性株H460taxR 的生长有较明显的抑制作用，同等浓度下对人正常成纤维细胞生长无有影响，揭示本发明 的寡肽为制备治疗具有紫杉醇抗性的肺癌相关的药物奠定了基础并在肺癌临床治疗中具 有关阔的应用前景。
[0013] 本发明所述寡肽在制备抗菌药物中的应用。
[0014] 实验显示：本发明所述寡肽可以抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和霉菌等多种 致病菌的生长，为新型抗菌药物的研发提供了基础。
[0015] 上述制备抗菌药物的应用中，所述抗菌药物优选是抗革兰氏阴性菌药物。
[0016] 本发明提供的具有抗肺癌作用的寡肽为寻找新类型的抗癌药物进而解决耐药性 问题或克服化疗耐药性等问题开辟了一条有效途径，具有广阔的因应用前景。
【附图说明】
[0017] 图1.本发明所述寡肽对H460和NHFB细胞生长的抑制作用检测。
[0018] 图2.本发明所述寡肽对大肠杆菌生长的抑制作用检测。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1 :
[0020] 寡肽的设计与合成
[0021] 1、登陆国际主要抗菌肽数据库，网址如下：
[0022] (http : //aps. unmc. edu/AP/main.php ；http://penbase. immunaqua. com/ ； http://www. bbcm. univ. trieste. it/ ；http://www. imtech. res. in/raghava/antibp/)
[0023] 提取其中的抗菌肽的序列，分析其一级结构与活性的关系的对应关系，同时设计 人工短肽序列。
[0024] 2、利用蛋白质分析数据库http://www. expasy. org/，分析已知活性的多肽序列与 设计的寡肽序列的二级结构的相似度，结合其它物理化学参数预测进行设计序列的修正。
[0025] 3、寡肽序列送至生物公司合成或利用自动多肽合成仪合成全序列。HPLC检测纯度 要大于96%，同时通过质谱检测确定寡肽合成质量。样品以冻干状态保存。
[0026] 4、对合成后的寡肽进行抑菌及抗癌功能检测筛选。
[0027] 5、通过功能检测，最终获得具有抑菌及抗癌双重功能的寡肽序列，即本发明中所 述的寡肽，其氨基酸序列为Arg Cys Cys Ser Gly Pro。
[0028] 实施例2 :
[0029] 本发明所述寡肽体外抑癌活性
[0030] 2. 1材料与试剂
[0031] 1)本发明所述寡肽，上海生工生物工程技术服务有限公司合成
[0032] 2) H460细胞（人非小细胞肺癌株系）、H460taxR细胞（人肺癌细胞H460株系，抗紫 杉醇）、NHFB细胞（人正常成纤维细胞株系）、Hela细胞（人宫颈癌细胞），SGC-7901细胞 (人胃癌细胞株系），中国科学院细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
[0033] 3) RPMI1640培养基，为美国GIBCO公司产品
[0034] 4) DMEM培养基，为美国HyClone公司产品
[0035] 5)新生小牛血清，为杭州四季青公司产品
[0036] 6)二甲基亚砜（DMSO)，四甲基偶氮唑（MTT)为上海生工生物工程技术服务有限公 司，其它药品试剂为国产分析纯。
[0037] 2. 2 实验
[0038] 1)用稀释液（无菌PBS或无菌水或者相应的细胞培养基）将本发明所述寡肽稀释 至ImM的初始测量浓度，过滤除菌，分装后-20°C冻存。
[0039] 2)培养各种细胞：将已经复苏的癌细胞株与正常细胞株分别用相应的培养液进 行传代培养。细胞培养条件：37°C，5%二氧化碳，饱和湿度。其中癌细胞于含10%小牛血 清的RPMI 1640培养液中（含lOOU/mL青霉素和链霉素）培养，细胞每2 - 3天传代1次； 正常细胞于DMEM培养基中培养，4-5天传代一次。细胞生长呈80 %左右融合状态时，采用 胰酶消化的方法消化分离细胞，用相应的培养基制备单细胞悬液并调整合适的细胞浓度， 分瓶传代。实验时用对数生长期细胞。
[0040] 3)细胞已贴壁后，弃去孔中原培养基，实验组分别加入含有梯度稀释（在初始浓 度基础上以10倍体积稀释）寡肽的100 μ L培养基。阴性对照组加入含有同等浓度稀释液 的同体积培养基，CO2恒温培养箱中培养48h。
[0041] 4)显微镜下观察细胞生长状态，然后每孔加入20 μ I (5mg/mL) MTT溶液。培养4h。
[0042] 5)小心吸尽孔中液体，每孔加入150 μ I DMS0,置于水平摇床上轻摇lOmin，以使 紫色结晶充分溶解于DMSO中。
[0043] 6)使用Model680酶标仪测定每孔在570nm处的吸光值，记录数据。
[0044] 7)利用sigmaplotlO和Excel软件分析处理数据。
[0045] 结果显示，本发明的寡肽在小于ImM浓度下能抑制肺癌、胃癌、宫颈癌细胞株的生 长，抑制效果浓度依赖性较小。在〇. ImM和〇. 1 μΜ的低浓度时肺癌细胞株H460的存活率 都为70%左右，同等浓度下人正常成纤维细胞存活率为110%左右。显微镜观察可见癌细 胞生长速率降低，细胞质中出现空泡和颗粒增多。结果见附图1。
[0046] 实验证实：本发明的寡肽对肿瘤细胞特别是对肺癌细胞具有选择性杀伤能力，有 望直接用于制备肺癌治疗的药物，或者开发为联合化疗的临床药物，应用前景可观。
[0047] 实施例3 :
[0048] 利用液体生长抑制法检测本发明所述寡肽的抑菌活性
[0049] 3.1材料、试剂
[0050] 1)氨节青霉素（Amp)为solarbio公司产品，一次性滤器，为美国PALL公司产品， 其它药品试剂为国产分析纯。
[0051] 2)选用革兰氏阳性菌：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn)、金 黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Rosenbach)、藤黄微球菌（Micrococcus Iuteus)、 苏云金芽抱杆菌（Bacillus thuringiensis)、巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium);革 兰氏阴性菌：大肠杆菌（Escherichia coli)、弧菌（Vibrio)、肺炎克氏杆菌（Klebsiella pneumoniae);真菌：前病镜刀菌（Fusarium solani)、尖抱镜刀菌（Fusarium oxysporum)、 瓜类炭疽病菌（Colletetrichum lagenarium)、苹果炭疽病菌（Gloeosporium album)棉花 黄萎病菌（Verticillium dahliae)进行测试。山东大学微生物国家重点实验室微生物菌 种室提供。
[0052] 3)封闭液：0. 4% BSA(w/v)，0. 02%冰醋酸，配制后过滤除菌。
[0053] 4) PB液体培养基
[0054] 胰蛋白胨（Tryptone) l〇g/L
[0055] 氯化钠（NaCl) 5g/L PH 7. 4-7. 6
[0056] 3. 2 实验
[0057] 1)向无菌96孔酶标板所使用的孔中加入200 μ L封闭液，室温封闭24h。
[0058] 2)用PB液体培养基过夜培养不同的细菌，转培养使细菌处于对数生长期。用PB 培养基调整菌液OD6。。约为0. 002。
[0059] 3)弃去封闭液，每孔加90 μ L 0D_约为0. 002的含菌PB培养基，再加入10 μ L无 菌水配好的终浓度梯度为50 μ Μ、1 μ Μ、0. 5 μ M的本发明的寡肽。阴性对照为90 μ L含菌培 养基+10 μ L无菌水；阳性对照为90 μ 1含菌培养基+10 μ L浓度为0. 25mg/mL氨苄青霉素 溶液（终浓度为〇· 〇25mg/mL，约62 μ M)。
[0060] 4)将加好菌液和药品的酶标板置于28°C摇床，IOOrpm恒温培养。分别在培养后 0h、3h、12h、15h、24h、36h，用 BIOTEK ELX800 酶标仪测定每孔的 630nm 吸光值（OD630)。
[0061] 5)利用sigmaplotlO和Excel软件分析处理数据。
[0062] 结果表明：本发明的寡肽对革兰氏阳性菌（以枯草芽孢杆菌为例）抑菌效果不明 显。对革兰氏阴性菌（以大肠杆菌为例）抑菌效果受浓度影响不大。试验显示本发明的寡 肽浓度低至〇. 5 μ M时，与革兰氏阴性菌孵育3小时后表现出抑菌活性，在15小时表现最大 抑菌活力。对真菌的抑菌效果与革兰氏阴性菌的类似。具体结果见附图2。
[0063] 由结果显示该寡肽有望用于制备临床用新型抗革兰氏阴性菌药物。
【主权项】
1. 一种具有抗肺癌作用的寡肽，其特征在于：该寡肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所 不。2. 权利要求1所述寡肽在制备抗肺癌药物中的应用。3. 权利要求1所述寡肽在制备抗革兰氏阴性菌药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种具有抗肺癌作用的寡肽，该寡肽的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。实验证实本发明的寡肽对肺癌细胞具有选择性杀伤能力，对革兰氏阴性菌抑菌效果明显。对真菌的抑菌效果与革兰氏阴性菌的类似。其有望直接用于制备抗肺癌抑菌药物并克服耐药性问题，应用前景可观。
【IPC分类】A61K38/08, A61P35/00, A61P31/04, C07K7/06
【公开号】CN105061562
【申请号】CN201510590158
【发明人】王丽, 马韫韬
【申请人】山东电力中心医院
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年9月16日