一种蚕丝蛋白多肽及其制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术多肽制备领域，具体涉及蚕丝蛋白多肽制备领域。 技术背景
[0002] 蚕丝蛋白（Fibroin)又名：丝素蛋白。丝素蛋白，是从蚕丝中提取的天然高分子纤 维蛋白，含量约占蚕丝的70%~80%，含有18种氨基酸，其中甘氨酸（gly)、丙氨酸（ala) 和丝氨酸（ser)约占总组成的80%以上。
[0003] 蚕丝蛋白质在化妆品领域被开发利用。由于蚕丝蛋白质与人体皮肤角朊蛋白质极 相似，两者有极好的亲和性；由于蚕丝蛋白质分子特殊的化学结构，所以蚕丝蛋白质具有良 好的吸湿性和散湿性能，能适应周围环境的变化，起天然调湿、改善人体皮肤营养、防止皮 肤起皱、增强皮肤细胞活力和弹性、促进细胞新陈代谢及维持皮肤正常生理状态的作用；蚕 丝蛋白质还具有吸收紫外线，防止日光辐射对人体皮肤损害的作用，所以蚕丝蛋白质已被 广泛用于美容化妆品的优良添加剂。
[0004] 然而，蚕丝蛋白是具有66个氨基酸的蛋白质，分子量较大，往往会引起过敏反应， 导致皮肤瘙痒，从而无法起到应有的护肤作用。小分子蛋白质或多肽就不容易诱发免疫变 态反应。但是，小分子蛋白质往往会失去原形蛋白质的功效。因此，如何才能让分解后的蚕 丝蛋白小分子既有原蛋白质的功效，且不引起过敏，一直是一个难以协调的问题。
【发明内容】
[0005] 发明目的
[0006] 针对现有香丝蛋白化妆品的现状，发明一种香丝蛋白多妝及制备和应用，制备的 蚕丝蛋白多肽，该多肽应用于化妆品，其既有原蚕丝蛋白的功效，而且不产生过敏反应。
[0007] 技术方案
[0008] 本发明为一种蚕丝蛋白多肽，其序列为RRTDKHIAILNNQEIQKFP。制备步骤包括 ⑴将清洗、烘干后的蚕茧500g剪碎，加入500-1000ml去离子水中；（2)煮沸、超声1-2小 时，同时缓慢搅拌；（3)待溶液冷却后，加入水解酶，在20-40°C反应30-60分钟；（4)离心 2000-3000rpm，5-10分钟，取上清；（5)将上清液加入ρΗ6· 0-6. 5的偏酸性缓冲液中，搅拌， 离心10000-15000rpm，30-60分钟，得到沉淀物；（6)将沉淀物复溶于pH5. 5-6. 0缓冲液中， 采用葡聚糖凝胶层析技术，分离出分子量为2-3KDa的多肽，即得。所述的水解酶，可以是木 瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、生姜蛋白酶、合欢蛋白酶、朝鲜蓟蛋白酶等。所述的 蚕丝蛋白多肽，在制备化妆品中的应用。
[0009] 本发明多肽也可委托上海吉尔合成，纯度为95%以上。
[0010] 有益效果
[0011] 本发明的制备得到的蚕丝蛋白多肽，经蛋白质序列测定，序列为 RRTDKHIAILNNQEIQKFP，纯度大于80 %。实验表明，该多肽能抗氧化的作用，作用与原蚕丝蛋 白相当。抗原实验结果表明，该多肽没有抗原性，体外抑制酪氨酸酶的实验证实其具有美白 功能。
【具体实施方式】
[0012] 实施例1
[0013] 将清洗、烘干后的蚕茧500g剪碎，加入500-1000ml去离子水中；煮沸、超声 1-2小时，同时缓慢搅拌；待溶液冷却后，加入菠萝蛋白酶，在室温反应60分钟；离心 2000rpm，5-10分钟，取上清；将上清液加入pH6. 0-6. 5的偏酸性缓冲液中，搅拌，离心 10000-15000rpm，30-60分钟，得到沉淀物；将沉淀物复溶于pH5. 5-6. 0缓冲液中，采用葡聚 糖凝胶层析技术，分离出分子量为2-3KDa的多肽，即得。采用固相蛋白质自动测序仪测定 该多肽的序列为RRTDKHIAILNNQEIQKFP，纯度为88. 9%。
[0014] 实施例2
[0015] 将清洗、烘干后的蚕茧500g剪碎，加入500-1000ml去离子水中；煮沸、超声 1-2小时，同时缓慢搅拌；待溶液冷却后，加入无花果蛋白酶，在37°C反应30分钟；离 心3000rpm，5-10分钟，取上清；将上清液加入pH6. 0-6. 5的偏酸性缓冲液中，搅拌，离心 10000-15000rpm，30-60分钟，得到沉淀物；将沉淀物复溶于pH5. 5-6. 0缓冲液中，采用葡聚 糖凝胶层析技术，分离出分子量为2-3KDa的多肽，即得。采用固相蛋白质自动测序仪测定 该多肽的序列为RRTDKHIAILNNQEIQKFP，纯度为82. 2%。
[0016] 实施例3
[0017] 将上海吉尔合成的多肽添加入乳膏基质中，进行免疫原性检测。BALB/c白鼠6只， 雌雄各半，将小鼠背部脱毛，裸露皮肤。分别取不同浓度的蚕丝蛋白多肽溶液（0.5，1.0， 2. Omg/ml)以1. 25 μ L/cm2涂敷密度短期1次涂敷，每日涂敷1次，连续8周，于1-12周 眼眶静脉丛定点取血每周一次，12000rpm离心2min，分离血浆取上清液，-20°C低温保存备 用。待室温溶解后，取0.1 ml上清液间接ELISA检测血清中抗体滴度。以各样品实际A值 (0D450)比阴性对照血清A值即得RA值，RA彡2. 1即为阳性，将Blood bio-samples样品 作一系列稀释后进行检测，呈阳性反应的最高稀释度即为该样品的滴度。测定结果显示。 1-12周收集的血样，经ELISA间接法检测多肽诱导抗体均为阴性。由此可见，本发明得到的 蚕丝蛋白多肽无免疫原性。
[0018] 实施例4
[0019] 将上海吉尔合成的多肽添加入乳膏基质中，采用1，1_二苯基-2-苦肼基 (l，l-diphenyl-2_picryhydrazyl，DPPH)法测定蚕丝蛋白多肽清除自由基活性。分别取 不同浓度的蚕丝蛋白2. Omg/ml、蚕丝蛋白多肽溶液（0· 5,1. 0,2. Omg/ml) 1.0 ml，置IOml离 心管中，加入3. Oml的DPPH溶液，室温避光反应30min，同时以无水乙醇为空白，于517nm 波长处测定吸光值。按下列公式计算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率（％)= A0- (As-Ac) /A。X 100 % (公式中，A。一 1.0 ml 蒸馏水 +3. OmlDPPH 溶液的吸光度值；As- 1.0 ml 样品溶液+3. OmlDPPH溶液的吸光度值；A。一1.0 ml样品溶液+3. Oml无水乙醇的吸光度值）， 将实验重复三次，2. Omg/ml蚕丝蛋白、0. 5,1. 0, 2. 0, mg/ml蚕丝蛋白多肽溶液的清除率分 别为32. 12、25. 41、33. 62、52. 92%。可见，蚕丝蛋白多肽溶液具有抗氧化的作用，且与原型 蚕丝蛋白相比，其抗氧化作用不变。
[0020] 实施例5
[0021] 抑制酪氨酸酶的实验
[0022] 上海吉尔合成的多肽给药组反应混合物2mL :0.1 M pH6. 8PBS 0. 9mL加不同浓度 的多肽ImL加0.03%酪氨酸0. lmL。37°C的恒温箱孵育lOmin，加0.1 mL的酪氨酸酶（350u/ mL)水溶液，将溶液混合均匀，置于37°C的恒温箱中反应25min后，用分光光度计于475mm 测定吸光度值；阴性对照组以等体积的蒸馏水代替多肽用分光光度计于475mm测定吸光度 值；阳性对照组用熊果苷代替多肽用分光光度计于475mm测定吸光度值；0.1 M pH 6. 8PBS 按照2005版《中国药典》配制。多肽分为l、5、10mg/mL。同时，以熊果苷（10mg/mL)作为阳 性对照组。抑制率％= (1-给药组/阴性组）*1〇〇% ;每个浓度多肽实验均重复统计学处 理试验数据以均数土标准差（X土s)表示，采用t检验，使用Excel软件做数据分析处理。
[0023]
[0024] 皮肤黑素形成是一个十分复杂的过程，在皮肤黑素的形成过程中由于受到紫外 线、遗传、内分泌、炎症介质、饮食不当等因素的影响，色素代谢异常，皮肤黑素过快增长和 分布不均，就会造成局部皮肤过黑及色素沉着，表现为黄褐斑、雀斑和炎症后色素沉着等。 酪氨酸酶为含Cu离子的氧化酶，其普遍存在于哺乳动物、植物和微生物中，主要参与生物 体内黑色素和其他多酚类物质的形成过程，是生物体合成黑色素的关键酶，酪氨酸酶抑制 剂就是通过抑制酪氨酸酶活性从而抑制黑色素生成，因而可用来预防和治疗色素沉着等。 本发明通过体外实验观察了多肽对酪氨酸酶活性的抑制作用，结果表明不同浓度的多肽液 对酪氨酸酶活性均有抑制作用，且具有显著的量效关系，证实其具有确切的美白祛斑功效。
【主权项】
1. 一种蚕丝蛋白多肽，其特征在于，序列为RRTDKHIAILNNQEIQKFP。2. 根据权利要求1所述蚕丝蛋白多肽的制备方法，其特征在于，步骤包括（1)将清 洗、烘干后的蚕茧500g剪碎，加入500-1000ml去离子水中；（2)煮沸、超声1-2小时， 同时缓慢搅拌；（3)待溶液冷却后，加入水解酶，在20-40 °C反应30-60分钟；（4)离心 2000-3000rpm，5-10分钟，取上清；（5)将上清液加入pH6. 0-6. 5的偏酸性缓冲液中，搅拌， 离心10000-15000rpm，30-60分钟，得到沉淀物；（6)将沉淀物复溶于pH5. 5-6. 0缓冲液中， 采用葡聚糖凝胶层析技术，分离出分子量为2-3KDa的多肽，即得。3. 根据权利要求书2所述蚕丝蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述的水解酶是木 瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、生姜蛋白酶、合欢蛋白酶或朝鲜蓟蛋白酶。4. 根据权利要求书1所述的蚕丝蛋白多肽在制备化妆品中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种蚕丝蛋白多肽，涉及生物技术多肽制备领域。其序列为RRTDKHIAILNNQEIQKFP。其制备步骤包括将清洗、烘干后的蚕茧500g剪碎，加入500-1000ml去离子水中；煮沸、超声1-2小时，同时缓慢搅拌；待溶液冷却后，加入水解酶，在20-40℃反应30-60分钟；离心2000-3000rpm，5-10分钟，取上清；将上清液加入pH6.0-6.5的偏酸性缓冲液中，搅拌，离心10000-15000rpm，30-60分钟，得到沉淀物；将沉淀物复溶于pH5.5-6.0缓冲液中，采用葡聚糖凝胶层析技术，分离出分子量为2-3KDa的多肽，即得。本发明可作为制备化妆品中的添加剂。抗原实验结果表明，该多肽没有抗原性。该多肽没有抗原性，体外抑制酪氨酸酶的实验证实其具有美白功能。
【IPC分类】C12P21/06, A61K8/64, C07K7/08, A61Q19/02
【公开号】CN105061563
【申请号】CN201510450309
【发明人】罗瑞雪
【申请人】苏州普罗达生物科技有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月28日