一种豆状囊尾蚴囊液蛋白的分离纯化和免疫原性检测的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及囊液蛋白分离和免疫领域，具体涉及一种豆状囊尾蝴囊液蛋白的分离 纯化和免疫原性检测的方法。
【背景技术】
[0002] 兔豆状囊尾蝴病（Cysticercosis pisiformis in rabbit)是由豆状囊尾蝴寄生 于家兔等啮齿类动物的肝脏、大网膜、肠系膜和腹腔内引起的一种常见多发病。本病呈世界 性分布，我国发生更为严重。据报道，从东北部的黑龙江、辽宁，到西北部的青海和新疆，从 西南的四川、重庆和贵州，到东南部的福建和华南的广西，再到华中的河南，华东的浙江和 山东等省，均有本病的发生，发病病率从5 %到100 %不等，平均感染率达到40 %左右，死亡 率在4 % -20 %之间。家兔感染豆状囊尾蝴后，临床上的主要表现为被毛松散、消化不良、腹 胀、消瘦、生长发育迟缓，影响皮毛质量和肉品质量，幼兔感染后常可引起大批死亡。因此， 本病给养兔业造成重大的经济损失。
[0003] 目前，我国还没有可供诊断兔豆状囊尾蝴病的血清学方法。这可能与豆状囊尾蝴 的抗原成份多、结构复杂、特异性差、且非特异变化明显有关。在总结前人研究的基础上，本 研究发现豆状囊尾蝴的囊液蛋白，作为一种分泌性抗原，具有良好的抗原性，通过对囊液蛋 白的分离和纯化，可作为免疫抗原或制备抗血清，在临床上对豆状囊尾蝴病进行诊断。
【发明内容】
[0004] 为了从豆状囊尾蝴的囊液中筛选出抗原性好，反应原性强的囊液蛋白，本发明提 供了一种豆状囊尾蝴囊液蛋白的分离纯化和免疫原性检测的方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0006] -种豆状囊尾蝴囊液蛋白的分离纯化方法，包括如下步骤：
[0007] S1、取IOOkDa的超滤管、50kDa的超滤离心管各两个，分别用超纯水润洗干净后， 倒满超纯水，置于4°C冰箱内，预冷5-10min ;
[0008] S2、取1200 μ L全囊液蛋白与等体积的超纯水混合均匀后，得2400 μ L样品；
[0009] S3、提前开启离心机降温至4°C，将预处理好的两个IOOkDa的超滤离心管取出，弃 去管内超纯水，各自加入1200以1^样品，离心处理30-3511^11 ;
[0010] S4、离心后，取出超滤离心管，吸取500 μ L超纯水吹20-30,将位于超滤管内管里 的大于IOOkDa的蛋白收集于干净的小离心管内，-80°C保存备用，并将位于超滤管的外管 内的小于IOOkDa的蛋白直接收集于干净的IOmL离心管内；
[0011] S5、提前开启离心机降温至4°C，将预处理好的两个50kDa的超滤离心管取出，弃 去管内超纯水，分别加入等量的步骤S4收集的小于IOOkDa的蛋白，离心处理30-35min后， 用500 μ L超纯水30-40次吹打50-100kDa的样品，收集于小离心管内，-80°C保存备用，并 将小于50kDa的蛋白直接收集于IOmL离心管内，-80°C保存备用。
[0012] 本发明还提供了一种豆状囊尾蝴囊液蛋白抗原性检测方法，采用PVC-Dot-ELISA 检测方法筛选纯化蛋白的抗原性，分别以切胶回收的纯化蛋白和经过超滤离心管分离的纯 化蛋白作为包被原进行包板，一抗为全囊液蛋白免疫小鼠所制备的抗血清，二抗为辣根过 氧化物酶（HRP)标记的山羊抗鼠 IgG，具体包括如下步骤：
[0013] Sl、按10 μ g/mL (用PBS稀释）的浓度包被96孔PVC板，每孔50 μ L，每种纯化蛋 白各自包被一行（12孔），4°C过夜，PBST洗涤3次，每次间隔5min ;
[0014] S2、用含5%脱脂奶粉的PBST封闭液封闭，每孔200 μ L，37°C，封闭2h，PBST洗涤 3次，每次间隔5min ;
[0015] S3、分别加入一抗，每行留四个孔，三个空为阴性对照，一个空为空白对照，第一空 按照1 : 100开始，依次进行倍比稀释到1 : 12800, 37°C，反应30min，PBST洗涤3次，每 次间隔5min ;
[0016] S4、加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，稀释比例按1 : 5000,每孔50 μ L， 37°C，反应30min，PBST洗涤3次，每次间隔5min ;
[0017] S5、加底物显色液，每孔50 μ L，反应5min ;
[0018] S6、加终止液，每孔50 μ L，立即读数；
[0019] S7、用酶标仪在450nm下测量96孔PVC反应板各孔的OD值，并保存。
[0020] 本发明具有以下有益效果：
[0021] 操作简单，时程短，效率高，而且超滤管分离法比常规的SDS-PAGE分离法更加灵 敏准确，获取的纯化蛋白浓度更高更纯，蛋白回收量大，而且抗原性较强，是比较理想的分 离纯化囊液蛋白和获得抗原性好的囊液蛋白的新方法。
【具体实施方式】
[0022] 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步 详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发 明。
[0023] 实施例1
[0024] 用超滤管对豆状囊尾蝴囊液蛋白进行分离的方法
[0025] S1、取IOOkDa的超滤管、50kDa的超滤离心管各两个，分别用超纯水润洗干净后， 倒满超纯水，置于4°C冰箱内，预冷5-10min ;
[0026] S2、取1200 μ L全囊液蛋白与等体积的超纯水混合均匀后，得2400 μ L样品；
[0027] S3、提前开启离心机降温至4°C，将预处理好的两个IOOkDa的超滤离心管取出，弃 去管内超纯水，各自加入1200以1^样品，离心处理30-3511^11 ;
[0028] S4、离心后，取出超滤离心管，吸取500 μ L超纯水吹打20-30次，将位于超滤管内 管里的大于IOOkDa的蛋白收集于干净的小离心管内，-80°C保存备用，并将位于超滤管的 外管内的小于IOOkDa的蛋白直接收集于干净的IOmL离心管内；
[0029] S5、提前开启离心机降温至4°C，将预处理好的两个50kDa的超滤离心管取出，弃 去管内超纯水，分别加入等量的步骤S4收集的小于IOOkDa的蛋白，离心处理30-35min后， 用500 μ L超纯水30-40次吹打50-100kDa的样品，收集于小离心管内，-80°C保存备用，并 将小于50kDa的蛋白直接收集于IOmL离心管内，-80°C保存备用。