一种具有抗癌活性的opb寡肽及其表达载体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种具有抗癌活性的寡肽及其表达载体和应用。
【背景技术】
[0002] Yin Yang 1(YY1)是一个多功能蛋白，具有促进肿瘤细胞生长的活性。YY1带有一 个0PB(0ncoprotein Binding)区域(如图1所示），可以结合多个促进癌症产生及发展的蛋 白（癌蛋白），包括AKT，Mdm2，ElA和Ezh2。
[0003] 癌症的发生与发展过程中伴随着遗传和表观遗传的改变。表观遗传是指那些在细 胞分裂时不涉及DNA序列变化的可遗传性状。表观遗传可以协调遗传学信息在分化与发育 进程中的作用。这些调节的缺陷会导致人类的各种疾病，包括癌症。YY1参与许多肿瘤形成 过程中的表观遗传学调控机制。迄今为止，大多数的研究表明，YY1的生物学功能是刺激细 胞增殖和癌症的发生和发展。
[0004] YY1最早是由Shi等人做为一个含有414个氨基酸的DNA结合蛋白而被发现的。做为 一个转录因子，YY1具有"阴阳（YinYang)"的特性，即可以抑制或激活靶基因的表达。YY1在 DNA上的共有结合元件（consensus binding element)存在于脊椎动物的7%基因中，这意 味着YY1在调节生物个体基因表达上的重要性。很多研究表明，YY1所调节的基因具有多种 生物学功能，包括细胞生长，分化以及胚胎的发育。YY1可以结合多个参与表观遗传学的重 要蛋白因子，包括调节组蛋白乙酰化的p300/CBP、PCAF、HDACs，组蛋白甲基化的E Zh2、EZhl、 PRMT4，DNA甲基化的DNMTs。因此，YY1是一个重要的表观遗传学调节因子。
[0005] 在早期的研究中，人们对于YY1在癌症发生中的作用一直不够明确。直到2004年， 我们发现了 YY1可以负调节抑癌基因 P53,其促癌或刺激细胞生长的功能才被意识到。随后 的多篇报道都证实了 YY1抑制P53的功能，因而，YY1对p53的负调控成为认知YY1做为原癌基 因的关键转折。值得注意的是，YY1的这一功能并不依赖于其调节转录的活性，这也就扩展 了 YY1的功能或调节范围。YY1做为转录因子促进原癌基因 c-Myc和ERBB2/HER2的表达，YY1 对原癌基因 Ezh2功能的促进作用，多种生长因子刺激YY1基因表达的现象，以及YY1的启动 子带有原癌基因标志性结构G-quadruplex等，被陆续发现。这些进一步牢固了 YY1的原癌基 因地位和增强了其做为癌症治疗中靶基因的可能性。
[0006] 现有技术存在的问题：（1)细菌系统表达产物，可能会含有内毒素，但这个缺点可 以通过使用针对去除内毒素的方法来解决。（2)基于DNA质粒的表达系统很难合成太小的多 肽分子，因为难以进行分离纯化。但合成2X0PB分子也有利于活性多肽的稳定性。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是为了提供一种抗癌(尤其是乳腺癌）的物质，即提供一种具有抗癌 活性的0ΡΒ寡肽及其表达载体和应用。
[0008]本发明的一种具有抗癌活性的0ΡΒ寡肽，其序列为Gly-Asn-Lys-Lys-Trp-Glu-Gln-Lys-Gln-Val-Gln-Ile-Lys-Thr-Leu-Glu-Gly-Glu-Phe-Ser-Val-Thr-Met-Trp-Ser- Ser〇
[0009]本发明的一种具有抗癌活性的OPB寡肽，我们以乳腺癌为例，展示了该寡肽或其任 意一部分寡肽可以用于制备治疗癌症的药物。
[0010]本发明的一种具有抗癌活性的0ΡΒ寡肽的pMBP-2x〇ro表达载体的构建，它是按照 以下步骤构建的：
[0011] 一、将2x0PB DNA连接到pUC56载体上，构建得到pUC56-2x0PB载体；
[0012] 二、将构建的pUC56-2x0PB用限制性内切酶Bglll和Xbal在37°C酶切3小时：
[0013]三、将步骤二酶切得到的2x0PB片段用1 %琼脂糖电泳胶回收；
[0014]四、将步骤三回收的DNA片段用连接到用限制性内切酶Bglll和Xbal酶切后的ρΜΒΡ 载体，得到ρΜΒΡ-2χ0ΡΒ表达载体；
[0015] 五、将步骤四构建的ρΜΒΡ-2χ(ΡΒ表达载体转入大肠杆菌DH5a中，培养后，采用限制 性内切酶Bgl II和Xbal进行验证，并进行DNA序列分析验证，对验证成功的pMBP-2x〇ro表达 载体转入到大肠杆菌BL21中，即完成所述的具有抗癌活性的0ΡΒ寡肽的pMBP-2x0PB表达载 体的构建。
[0016] 本发明构建的载体说明如下：
[0017] 包含有以下原件：（1 )MBP(Maltose binding protein)，可以结合淀粉树脂 (amylose resin)以便进行蛋白分离。（2)PCS序列：是PreScission蛋白酶(PSP)的酶切位 点，在得到MBP-2x0PB后，可以用PSP将2x0PB从融合蛋白上切下。（3)TAT:可以帮助2x0PB穿 过细胞膜进入细胞的信号肽段。（4)HA:用于HA-抗体识别的序列。（5)0PB:0n C〇pr〇tein Binding，即我们预测的具有抗癌作用的多肽序列。或者，这一段为Cont:0PB的乱序序列，用 来做为对照。（6)终止密码子(STOP)。
[0018] 本发明的(PB寡肽来源于YY1的氨基酸201-226区域，包括Mdm2，Ezh2，ElA和AKT，本 申请将从该区域获得肽段命名为原癌基因蛋白结合(oncogene protein binding;或0ΡΒ) 区域。
[0019] 本发明构建了在原核细胞大肠杆菌中表达的pMBP_2x0PB表达载体(如图2所示）。 这一载体可以表达出带有MBP和2个0ΡΒ肽段的融合蛋白MBP-2x0PB，然后通过后期纯化和酶 切处理，得到纯化的2x0PB肽段。在进行这一研究时，我们也构建了一个用于对照的表达质 粒pMBP-2xCont，它可以用来合成设计成一个混乱序列的2xCont多肽。
[0020] 本发明包含以下有益效果：
[0021 ]本发明通过15年有关YY1的研究，第一次报道了YY1促进Mdm2介导的p53泛素化降 解；并报道了 Y Y1的s U Μ 0化（S u m 0 y 1 a t i ο η)对其转录活性的调节，Y Y1对雄激素受体 (androgen receptor)功能的促进，尤其是ΥΥ1在乳腺癌细胞和组织中的高表达以及对乳腺 细胞的增殖作用和其高表达对肿瘤形成的必要性，YY1启动子区域含有癌基因特有的标志 性结构 G-quadruplex。
[0022]本发明依据前期的研究结果，发现YY1中含有氨基酸201-226的区域可以结合多个 原癌基因，包括Mdm2，Ezh2，ElA,ΑΚΤ，因此，我们命名这一区域为0PB(0ncogene Protein Binding)。例如，YY1通过其0ΡΒ区域与促生长蛋白AKT结合，并刺激AKT在S473位点的磷酸化 而进行激活。YY1介导的AKT激活不依赖于传统的由PI3K-PIP3介导的AKT激活信号通路。更 进一步，利用0ΡΒ序列合成出的肽段具有抑制肿瘤细胞生长增殖的效果，表明基于0ΡΒ的肽 段是一种潜在的治疗癌症药物的药物。
[0023] 0ΡΒ肽的优势在于：
[0024] (1)与2XCont相比，2X0PB活性肽段可以特异性地抑制癌细胞的增值，我们以乳 腺癌为例，展示2 Χ0ΡΒ活性肽段对乳腺癌细胞增殖具有显著的抑制作用，并且不影响正常 乳腺细胞的生长。这意味着将来利用2 Χ0ΡΒ制成的抑癌药物应该可以选择性杀伤癌细胞， 而对正常细胞具有较低的毒性或副作用。
[0025] (2)与化学法多肽合成相比，利用DNA质粒在细菌中发酵表达的方法合成多肽，具 有成本低，产量高的特点。一但形成了固定的工序，也是便于操作。
[0026] (3)该肽段便于加入不同的信号肽段。
【附图说明】
[0027] 图1为YY1的功能结构区域及0PB(0ncoprotein Binding)区域的序列；
[0028]图2为活性多肽的表达载体示意图；
[0029] 图3为2x0PB肽段(带有HAtag，2μg/ml)在WST-1试验中抑制MCF-7的结果图；其中，A 为2 X Cont曲线图；B为2x0PB肽段曲线图；
[0030] 图4为2x〇ro肽段(带有HAtag，2μg/ml)在WST-1试验中抑制MDA-MB-231的结果图； 其中，A为2 X Cont曲线图；B为2x0PB肽段曲线图；
[0031 ] 图5为2x0PB肽段（带有HAtag，2μg/ml)在WST-1试验中抑制MCF-10A的结果图；其 中，A为2x0PB肽段曲线图；B为2XCont曲线图；
[0032] 图6为2x0PB肽段抑制多种乳腺癌细胞株中的增殖效果图；其中，A为MCF-10A细胞； B为 ZR-75-1 细胞;C为 SK-BR-3 细胞;D 为MDA-MB-175VII 细胞;E 为CAMA-1 细胞;F为 BT-474细 胞;G为MDA-MB-231细胞;Η为SUM159细胞；I为BT-549细胞;J为HS-578T细胞。
【具体实施方式】
【具体实施方式】 [0033] 一:本实施方式的一种具有抗癌活性的0ΡΒ寡肽，其序列为Gly-Asn-Lys-Lys-Trp-Glu-Gln-Lys-Gln-Val-Gln-Ile-Lys-Thr-Leu-Glu-Gly-Glu-Phe-Ser-Val-Thr-Met-Trp-Ser-Ser 〇
【具体实施方式】 [0034] 二:本实施方式的一种具有抗癌活性的0ΡΒ寡肽，该寡肽或其任意一 部分寡肽用于制备治疗癌症的药物。
【具体实施方式】 [0035] 三:本实施方式与二不同的是:所述的寡肽或一部分 寡肽用于制备治疗癌症的药物。其它与二相同。
[0036]【具体实施方式】四：本实施方式的一种具有抗癌活性的01?寡肽的pMBP-2x〇ro表达 载体的构建，它是按照以下步骤构建的：
[0037] 一、将2x0PB DNA连接到pUC56载体上，构建得到pUC56-2x0PB载体；
[0038] 二、将构建的pUC56_2x0PB用限制性内切酶Bglll和Xbal在37°C酶切3小时:这个反 应利用了BamHI和Bgl II这两个限制性内切酶是同尾酶的特性；
[0039]三、将步骤二酶切得到的2x0PB片段用1 %琼脂糖电泳胶回收；
[0040]四、将步骤三回收的DNA片段用连接到用限制性内切酶Bglll和Xbal酶切后的ρΜΒΡ 载体，得到ρΜΒΡ-2χ0ΡΒ表达载体；
[0041 ]五、将步骤四构建的pMBP-2x(PB表达载体转入大肠杆菌DH5a中，培养后，采用限制 性内切酶Bglll和Xbal进行验证，并进行DNA序列分析验证，对形成的菌落提取质粒进行筛 选，并用酶切鉴定这些质粒中是否带有插入片段，确定所插入片段的正确性;对验证成功的 pMBP-2x0PB表达载体转入到大肠杆菌BL21中，即完成所述的具有抗癌活性的0ΡΒ寡肽的 pMBP-2x0PB表达载体的构建，用于表达0ΡΒ多肽。
[0042]同时本实施方式按照上述步骤构建pMBP-2xCont表达载体，用来作为实验当中的 对照样品；
[0043]其中，2xCont DNA的核苷酸序列（这个是编码两个连续的、将(PB肽段序列弄混乱 后的肽段）D