豌豆抗白粉病er1等位基因er1-10及其编码蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及植物病理学、遗传育种及分子生物学领域，具体地说，涉及豌豆抗白粉 病erl新等位基因 erl-?ο及其编码蛋白。
【背景技术】
[0002] 豌豆白粉病(Erysiphe pisi D.C.)是一种气传性病害，严重影响豌豆的产量和品 种，是豌豆上的一种重要病害，严重感染的豌豆品种损失可高达80%以上(Nisar等，2011; Fondevilla等，2012)。
[0003] 防治豌豆白粉病最为经济、有效且环境安全的方法是推广和应用携带erl抗病基 因的抗病品种。抗病基因 erl具有抗病持久而且不受外界环境影响的特点，在欧洲国家已广 泛应用于豌豆栽培种中（Fondevilla等，2007)。目前，国外已经鉴定了大量的抗白粉病豌豆 资源，并在抗性资源中鉴定了3个抗白粉病基因，包括两个独立遗传的隐性基因（erl和er2) 和一个独立遗传的显性基因（Er3) (Harland等，1948 ;Heringa等，1969 ;Fondevilla等， 2007)。從2基因的抗性不稳定，其表达易受环境、温度和叶龄的影响，只在高温和成熟叶片 中表现抗性，且抗性具有区域专化性。Er3基因是最近在野生豌豆(Pisum fulvum L.)中发 现的并已成功转入到栽培豌豆中。目前Er3的应用还不明确。erl基因具有抗病持久而且不 受外界环境的影响。
[0004] 大量研究表明鉴定的大多数豌豆抗白粉病资源均含有erl基因，并且生产中应用 的豌豆抗白粉病资源的抗性也均由erl控制（Tiwari等，1997 ;Ghafoor等，2012 ;Liu等， 2003 ;Vaid等，1997)。60多年前抗病基因 erl已被成功用于病害防治并表现持久抗性 (Harland等，1948)。虹1对白粉菌表现免疫或高抗的机制，通过抑制白粉菌对寄主的表皮细 胞的入侵来表现抗性。随着豌豆分子标记的开发和遗传图谱的构建，抗病基因 er 1被定位在 豌豆遗传图谱的第6连锁群（LG VI)上（Timmerman等，1994)。最近，Humphry等（2011)和 Pavan等（2011)研究表明erl基因是与大麦感白粉病基因（ML0)序列同源的豌豆感基因 PsMLO功能丧失而产生的，由于豌豆PsMLO同源基因序列发生碱基或片段的插入、缺失、替换 等基因突变导致功能丧失而产生了多个erl等位基因。基于erl基因 PsMLOl突变的位置和方 式不同，目前在豌豆抗白粉病资源中已鉴定了9个erl等位基因，分别命名为erl-l、erl-2、 61'1-3、61'1-4、61'1-5、61'1-6、61'1-7、61'1-8和61'1-9。除了等基因61'1-2、61'1-7和61'1-8，其它 已知的6个erl等位基因都是由单碱基缺失或替换引起的。等位基因 erl-2是由未知身份和 大小的DNA片段插入或缺失产生的，等位基因 erl-7是由一个10bp的小片段缺失造成，等位 基因 erl-8是由 3个喊基缺失造成的（Humphry 等，2011; Pavan等，2011; Sun 等，2015; 2016a; 2016b)。目前，利用不同的分子技术，已成功开发了7个erl等位基因（除了新发现的等位基 因 er 1-8和er 1-9之外）的功能标记，可有效应用于分子辅助选择育种(Pavan等，2013; Sun 等，2016a; 2016b ;Wang 等，2015)。
[0005] 目前，豌豆白粉病已对我国豌豆生产造成严重威胁，在白粉病易发地区，豌豆感病 品种的发病率高达1〇〇%。我国对豌豆抗白粉病的研究主要集中在豌豆抗白粉病的资源筛 选和抗病基因 erl的抗性遗传分析及基因鉴定方面。这些研究在中国豌豆资源中发现了对 中国白粉菌分离物EPYN和EPBJ表现免疫或高抗的优异抗源(彭化贤等，1991;曾亮等，2012; 王仲怡等，2013;付海宁等，2014; Sun等，2016a)。最近，在控制培养条件下通过人工接种，筛 选出了多个豌豆抗性资源，并且在这些优异的抗病资源中明确了抗白粉病基因 erl的几个 不同的等位基因，包括er 1-1、er 1-2、erl_6、er 1-7(付海宁等，2014;王仲怡等，2015; Sun等， 2015;2016a;2016b)。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供豌豆抗白粉病erl新等位基因 erl-?ο及其编码蛋白。
[0007]为了实现本发明目的，本发明提供的erl-ΙΟ蛋白，其氨基酸序列如Seq ID No.l所 示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0008] 本发明还提供编码所述蛋白的豌豆抗白粉病erl等位基因 erl-?ο,其cDNA序列如 Seq ID No .2所示。
[0009] 本发明进一步提供所述等位基因 erl-10在豌豆资源抗白粉病的分子育种中的应 用。
[0010] 为了明确豌豆抗白粉病资源G0003840的抗病erl等位基因，本发明对G0003840的 erl候选基因 PsMLOlcDNA进行测序。序列分析结果显示G0003840的PsMLOlcDNA序列与野生 型感病基因 PsMLOlcDNA序列相比，在32bp处发生单碱基缺失突变，这一碱基缺失突变导致 翻译过程中移码突变并形成截短的PsMLOl蛋白，从而引起PsMLOl蛋白功能的变化。这与已 鉴定的9个erl等位基因的突变位置均不相同，表明这是一个erl的新等位基因，将其命名为 erl-10。该等位基因位于豌豆遗传图谱第VI连锁群的erl基因座位上。豌豆抗白粉病资源 G0003840的PsMLOlcDNA对应的CDS序列及其编码氨基酸序列见Seq ID No.5。
[0011] 本发明通过对豌豆抗白粉病资源G0003840的erl候选基因 PsMLOlcDNA序列分析， 发现了新的抗性等位基因 er 1-10。确定了新等位基因 er 1-10的cDNA序列。本发明首次鉴定 了 erl的新等位基因 erl-10,对豌豆抗白粉病育种工作具有重要意义，通过育种手段可有效 控制豌豆白粉病的发生，减轻该病害造成的经济损失，并为豌豆资源抗白粉病的分子育种 提供新的基因资源。
【附图说明】
[0012] 图1为本发明中感病品种陇豌1号（左）和抗病资源G0003840 (右)接种豌豆白粉菌 分离物EPYN 10天后的表型。
[0013] 图2为本发明中豌豆白粉病抗病资源G0003840和野生型豌豆感病资源在基因 PsMLOl编码第一个外显子(含126bp)的核苷酸序列比对结果。
【具体实施方式】
[0014] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning:a laboratory manual ,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0015] 以下实施例中涉及的抗病豌豆资源G0003840来自于中国国家作物种质库，感病对 照品种陇豌1号由甘肃省农业科学院作物研究所杨晓明研究员提供，抗病对照品种YI由美 国华盛顿州立大学陈卫东教授提供。
[0016] 实施例1豌豆抗白粉病资源G0003840的表型鉴定
[0017] 将抗病豌豆资源G0003840和感病对照品种陇豌1号以及抗病对照品种ΥΙ分别播种 于以粗蛭石为基质的250mL的纸杯中，每杯播5粒，于18~26 °C温室培养，待豌豆苗第3或第4 莖节叶片展开时，采用抖落法接种白粉菌分离物EPYN的分生孢子（NCBI，Accession number:KR957355)，接种后置于18~22°C温室培养。采用0~4级的病害严重度分级标准，0 级:无病；1级:病斑上有淡薄菌丝层，可见绿色叶面，不产生孢子;2级:菌丝层较厚，不透绿， 产生一定量孢子;3级：菌丝层厚，产孢量较多；4级:产孢量多，病斑上的菌丝层全被孢子覆 盖(Vaid等，1997 ;Rana等，2013)。接种10天后感病对照品种病害严重度达4级后调查各供试 资源的发病情况。抗性评价标准为:〇级为免疫(1)，1~2级为抗病(R)，3~4级为感病(S)。共 进行三次重复接种鉴定。
[0018] 接种10天后，感病对照品种陇豌1号所有植株的叶片、茎杆和卷须上全部覆盖厚的 菌丝层，并产生大量分生孢子，茎杆和卷须也布满菌丝体和分生孢子，病害严重度为4级，表 现感病;抗病对照品种YI (PI 391630)叶片、茎杆和卷须上均无可见症状，病级为0，表现免 疫。抗感对照品种对分离物EPYN的表型反应与之前的鉴定结果相同。抗性资源G0003840的 表现型与抗病对照YI相同，对分离物EPYN表现免疫反应。
[0019] 感病品种陇豌1号和抗病资源G0003840接种豌豆白粉菌分离物EPYN 10天后的表 型如图1所示。
[0020] 实施例2抗性资源的erl候选基因 PsMLOlcDNA序列鉴定
[0021] 用RNAprep植物总RNA提取试剂盒（离心柱型，购自天根生化）提取豌豆资源 G0003840以及感病对照品种陇豌1号的植物总RNA。具体操作方法如下：
[0022] 1)取约100mg豌豆幼嫩叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450yL RL(使用前加入 β-巯基乙醇至终浓度为1 % )，涡旋剧烈震荡混匀；
[0023] 2)将所有溶液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中），12000rpm离心5min， 小心吸取收集管中的上清至RNase-free的离心管中；
[0024] 3)缓慢向离心管中加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转 入吸附柱CR3中，静置2min，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液；
[0025] 4)向吸附柱CR3中加入500yL去蛋白液RW1，静置2min，12000rpm离心lmin，倒掉收 集管中的废液；
[0026] 5)DNaseI工作液的配制：取10yL DNasel储存液放入新的RNase-free离心管中，加 入70yL RDD溶液，轻柔混匀；
[0027] 6)向吸附柱CR3中央加入80yL DNasel工作液，室温放置20min;
[0028] 7)向吸附柱CR3中加入350yL去蛋白液RW1，静置2min，12000rpm离心lmin，倒掉收 集管中的废液；
[0029] 8)向吸附柱CR3中加入500yL漂洗液RW(使用前加入无水乙醇），室温静置2min， 12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液；
[0030] 9)重复步骤8);
[00311 10) 12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，彻底晾干残 留的漂洗液；
[0032] 11)将吸附柱CR3放入一个新的RNase-free离心管中，向吸附膜的中间位置悬空滴 加50yL RNase-free ddH2〇,室温放置lOmin，12000rpm离心2min，得到RNA溶液；
[0033] 12)RNA完整性检测:普通琼脂糖凝胶电泳，电泳条件:胶浓度1.2% ; 1 XTBE电泳缓 冲液；150V;15min。
[0034] 用BioRT逆转录扩增(RT-PCR)试剂盒(两步法)合成mRNA第一条cDNA链，用PsMLOl 特异性弓1物对？8]\^01?/?8]\^011?(5,-八八