鉴定区分普通小麦春化基因vrn3等位基因的特异引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体设及一种鉴定区分普通小麦春化基因册^2巨个 等位基因（WV-A?、WV-化?、WV-化?）的特异引物及其应用。
【背景技术】
[0002] 小麦作为最重要的粮食作物之一，其春化发育特性一直是小麦生理学领域研究的 重要课题。其研究不但能掲示春化发育的生理机制和分子机理，补充完善春化作用的理论， 更重要的是为培育高产、优质、广适性的小麦品种提供理论依据。
[0003] 近年来，随着植物分子生物学的迅速发展，特别是小麦春化相关基因的挖掘，有关 小麦春化发育的分子调控机制取得了新的进展。春化基因是决定小麦全生育期进度的重要 基因，对小麦在不同环境条件下的适应性具有显著的影响。例如，冬小麦品种需要春化处理 才能够正常的开花和成熟。根据春化基因（Vernalization，WA0的等位差异，可将小麦划 分为冬性、半冬性、春性。目前，普通小麦春化基因研究较多的有WW、和WV义其中 册^2堤小麦开花调控途径中的关键基因，可^整合春化和光周期响应途径；Yan等已利用 高密度图谱将册^2淀位于78染色体的短臂上。研究发现册^2疆因序列高度保守，因而对 其所含等位基因的分离与鉴定存在着极大的难度。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种鉴定区分普通小麦春化基因册^^巨个等位基因 (WV-A?、WV-化?、WV-Z议的特异引物及其应用，为研究个等位基因的表达及对小 麦春化发育特性的分子调控提供依据。
[0005] 基于长期的研究实践经验，本发明采用了如下技术研究思路： 先W有代表性的不同春化发育特性普通小麦品种为试验材料，WVRN3-F1/VRN3-R1为 引物（见表3)，在基因组和cDNA上分别扩增WV堪因，结合NCBI上的参考序列（Genbank accessionnumbersEF428115. 1，DQ890164. 1，EF428113. 1)和扩增得到的序列进行比对分 析表明海个品种的cDNA都扩增到一条452bp的片段，且不同品种间序列完全保守；进一 步的研究分析表明，在不同小麦品种基因组中均存在WV-A?、WV-《义WV-化巨种序列，分 别包含2个内含子和3个外显子，S个部分同源序列的外显子差异较小，只有少数单碱基突 变，主要差异在第一内含子和第二内含子上，可根据内含子长度的差异来区分册^^疆因组 上的=个部分同源序列。
[0006] 本发明后续研究通过普通PCR扩增、RACE及site-findingPCR技术，经序列整合 和比对分析，设计一对通用引物JF1和JR1，经PCR扩增得到WV端]A、B、D基因组序列，分 别为17246口、19626口和1723bp。为进一步区分^^足似基因的=个等位基因序列，研究设计了 3个前引物、WJR1为后引物进行扩增： 前引物： 58A-F: 5'-CCGGTCGATCTACACTAGGAAGA-3', 67B-F1:5'-CGTACCCTAGCTAGCAAGGCAA-3'， 70D-F2: 5' -GCTCCAGAGAACCTCTGCTGC-3', 和后引物： JRl: 5' -AGAGAAGCCACCGGTCTCATAC-3'。
[0007] 利用上述引物，W普通小麦品种的基因组DM为模板，进行PCR扩增，分别得到 1660bp、1899bp、1687bp的片段，经序列比对分别为WV-A?、WV-《义WV-Z巧通过在不同 发育特性小麦品种上鉴定，均能有效地区分普通小麦春化基因脚^2?中A、B、D=个等位基 因。
[0008] 本发明具有W下积极有益的技术效果： 1. 经筛选研究，得到1(：10、扔41等不同发育特性小麦品种4、8、0基因组上册^2疆因 的=个同源基因部分序列，并得到能有效鉴定区分不同发育特性小麦品种册^2疆因的= 个等位基因的特异引物； 2.A、B、D基因组分离与鉴定，对研究^^足似不同等位基因在春化进程中的表达 具有十分重要的意义，为进一步明确该等位变异类型的分子机制，开发相应的分子标记提 供了依据。
【附图说明】
[0009] 图1为8个小麦品种WV堪因DNA和cDNA的PCR扩增产物的电泳图；其中，M: 分子量标准DL2000 ;1-8 :DNA扩增产物；9-16 :cDNA扩增产物。
[0010] 图2为迂春10号、新春2号、京841部分cDNA序列比对图。
[00川 图3为迂春10号WV-A?、WV-原?、WV-Z?堪因的DNA序列比对图。
[001引 图4为WV堪因3'RACE和5'RACE的PCR扩增产物的电泳图；其中，M:分子量 标准DL2000 ;1 :3'RACEPCR产物；2 : 5'RACEPCR产物。
[001引 图5为和WVJ-满]cDNA序列比对图；图中方框标记的为起始密码子和 终止密码子；长框标记序列分别为2个序列的特异引物，箭头表示引物的设计出的人为突 变位点。
[0014]图6为3个品种WV-化郝WV-化觀cDNA序列比对；图中方框内为起始密码子， =角箭头所示为突变位点。
[001引 图7为迂春10号WV-《邢WV-Z口的启动子区序列比对图。
[0016] 图8为不同春化特性品种^^7；啼-《?启动子区序列比对图。
[0017] 图9为通用引物JF1和JR1PCR扩增产物电泳图；M:分子量标准化2000 ;1-8 :8 个品种DNA扩增产物。
[001引 图10为LC10的WVJ-A 觀序列比对图。
[0019] 图11为S对特异引物的PCR扩增产物电泳图；其中M:分子量标准化2000 ;1-5 :5 个品种WV-AWVJ-Z?的0臟扩增产物。
[0020] 图12为不同品种WV-AWW-Z?的序列比对结果图；图13为图12的后 续图。
【具体实施方式】
[0021] W下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。各实施例中所用试剂及 原料，如无特别说明，则均为市售，所设及的方法如无特别说明，则均为常规方法。
[002引实施例1普通小麦WV堪因cDNA部分序列的扩增和比对 W普通小麦品种迂春10号（1X10)、新春2号（XC2)、豫麦18(Y18)、郑麦9023(29023)、 周麦18 (Z18)、豫麦49-198 (Y49-198)、京841 (J841)和肥麦（FM)孕穗期叶片提取的RNA 反转录的cDNA为模板，WVRN3-F1/VRN3-R1 (见表3)为引物，进行PCR扩增，PCR扩增体系 为20yレ含2yL10X缓冲液、0. 2yL巧U)r^qOM聚合酶、1.8yL(2. 5ymo化i)dNTP， 每条引物lyiaOymo化1)，DM模板1化，d地20 13化。反应程序为94°C预变性5min; 94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 0. 5 ~1. 5min, 35 个循环；72°C终延伸lOmin。每 个品种都可W扩增得到一条约为400bp左右的特异性条带(见图1);将上述片段回收、连 接转化后，分别挑选5个阳性单克隆进行测序，测序结果经BLAST分析，为小麦册^2疆因 片段，所有品种的测序结果用DNAMAN软件进行序列比对，结果如图2显示（图中只展示迂春 10、新春2号、京841的序列比对结果)，每个品种都只能得到一条452bp的片段，不同品种 间的运段cDNA序列完全保守。
[0023] 实施例2普通小麦S个同源基因基因组部分序列扩增和比对 W迂春 10 号（1X10)、新春 2 号（XC2)、豫麦 18(Y18)、郑麦 9023(29023)、周麦 18(Z18)、 豫麦49-198 (Y49-198)、京841 (J841)和肥麦（FM)春化特性不同的有代表性的8个品种 的DNA为模板，WVRN3-F1/VRN3-R1 (见表3)为引物分别进行PCR扩增，PCR反应体系及扩 增程序同实施例1。经测序分析，每个品种均扩增得到了 3种序列，根据NCBI上公布的A、 B、D基因组部分参考序列，分别确定为WV-A?、WV-化?、WV-化?。同一品种运S个同源基因 的序列差异见图3 (图中只^迂春1〇号为例，展示册^^巨个同源基因扩增的部分序列差 异）所示，结合实施例1中扩增得到的cDNA序列，A、B、D基因组上基因的S个同源 基因序列主要差异位于第一和第二内含子之间，而外显子部分则比较保守，在第=外显子 上存在单碱基差异，其中WV-A?与WV-化么间存在7个单碱基差异，WV-A?与WV-化存 在5个单碱基差异，WV-化?与WV-化么间则存在5个单碱基差异。
[0024] 根据不同品种之间册^^疆因的序列分析结果，册^^觀^个同源基因在不同品种 之间都非常保守，在外显子段都不存在显著差异，因而同一品种册^^疆因的^个同源序列 对应的内含子差异可W作为区分WV-A?、WV-化?、WV-化？cDNA序列的依据之一。
[002引实施例3普通小麦S个同源基因cDNA的RACE扩增和序列比对 ^迂春10号不同生长时期叶片的RNA混合物为模版，根据前期获得的册^^疆因的部 分cDNA序列，设计了用于5'RACE和3'RACE的特异引物5' -GSPU5' -GSP2和3' -GSP1、 3'-GSP2(见表 3)。分别与SMART?RACEcDNAAmplificationKit试剂盒提供的Universal PrimerAMixOJPM)组合进行5'和3'端RACE的PCR扩增，扩增结果见图4。从图中可W 看出，5'RACE获得了大约300bp的特异片段，3'RACE获得了大约1000bp的特异片段。将 上述片段回收、连接转化后，分别挑选10个5'RACE和10个3'RACE的阳性克隆进行测序， 测序结果用DNAMAN软件进行序列比对和拼接，最终得到了WV端]二个同源性很高的cDNA 全长序列。
[002引将获得的cDNA序列分别先命名为巧日晰似-之（图5)，序列分析显示 和WW-满]cDNA全长分别为1241bp和1245bp。它们的5'UTR分别为117bp和123bp，3'UTR分别为591bp和59bp，ORF均