一种土壤漆酶活力的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明设及±壤漆酶活力测定方法，尤其设及一种用于森林±壤漆酶活力的标准 化测定方法。
【背景技术】
[0002] 漆酶（Laccase)，属EC1. 10. 3. 2(对苯二酪氧化酶)，其活性中屯、含多个铜原子，参 与木质（纤维）素解聚并氧化腐殖质等分子，可被酪类物质诱导合成，漆酶广布于真菌巧曰白 腐或褐腐担子菌、软腐子囊菌)、细菌和古菌。多酪类聚合物是调落物分解的瓶颈，而漆酶是 将木质素氧化为酪氧自由基的关键酶。因此，漆酶在森林生态系统碳氮循环过程中是极为 关键的蛋白酶。
[0003]然而，漆酶的测定方法目前仍无令人信服的标准化流程。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种±壤漆酶活力的测定方法，该方法旨在通过一级动力学 方程，明确±壤漆酶对底物利用的最大的潜势和产物形成的最大平均时间，并藉此计算漆 酶活力，有利于±壤漆酶活力测定方法的统一化和标准化。
[0005]本发明是通过如下技术方案实现的： 一种±壤漆酶活力的测定方法，所述方法利用一级动力学模型，确定漆酶底物利用最 大潜势和最大产物合成的平均时间，并W此为基础计算漆酶活力；利用酶产物合成动力学 特征参数，从而使得漆酶活力测定过程更为标准化；包括W下过程： (1)无菌生理盐水浸提新鲜±壤样品，水±比10:1，重量比； (2 )ABTS为底物，其工作浓度为20-30mM; (3) W96孔板为底物一酶液检测载体，W酶标仪测定产物吸光值； (4) 于不同底物一酶反应时间测定漆酶产物的吸光值； (5) 利用非线性回归模型，计算漆酶产物的最大合成潜势，W及相应的平均合成时间； (6) 利用上述最大产物合成潜势和平均合成时间，计算±壤漆酶活力。
[0006]所述的一种±壤漆酶活力的测定方法，所述MABTS底物，20-30mMABTS为最适底 物浓度，通过设立一系列底物浓度，即1，2，3，5，8，12，20，30和50mlABTS底物，明 确20-30mlABTS浓度条件下，漆酶产物的吸光值随培养时间而持续增加，且不受±壤环境 因子的抑制。
[0007]所述的一种±壤漆酶活力的测定方法，所述测定产物吸光值，0-6小时持续测定吸 光值，由于漆酶一底物反应过程符合一级动力学特征而非直线方程，即产物合成会经历初 始快速合成、吸光值迅速升高，而中期缓慢、后期停滞的动力学特征；因此，选取如下时间点 测定漆酶产物的光吸收值：底物一酶液混合前1小时内，5-10分钟间隔测定产物吸光值， 中、后期20-30分钟间隔测定吸光值。
[0008]所述的一种±壤漆酶活力的测定方法，所述方法通过一级动力学方程拟合漆酶产 物动力学过程，并将酶活力与动力学参数计算相结合，进而确定特定森林±壤条件下漆酶 对底物利用的最大活力，W及形成最大产物合成的时间尺度，从而避免传统方法中对漆酶 酶活力测定的时间点与最大产物生成量的主观臆断。 具体实施方案
[0009] 下面通过实例对本发明做进一步详细说明。
[0010] 一种修正森林±壤漆酶活力的测定方法，通过一定底物浓度梯度确定最适底物 2, 2' -联氮双（3-乙基苯并嚷挫嘟-6-横酸)二锭盐（ABTS)浓度，利用一级动力学方程模拟 ±壤漆酶活力一底物反应过程，并拟合出特定森林±壤条件下的漆酶活力潜势W及相关过 程的速率常数，从而确定特定森林生态系统漆酶酶活力相关的动力学参数。此测定方法避 免在漆酶传统测定过程中，因±壤复杂环境因素引起的漆酶活力抑制、初始浓度变化时间 难于把握W及最大产物生成量无法计算等原因造成的漆酶活力测定和计算的不准确和不 可靠。
[0011] 实施例1 1、称2g(干重）鲜±(<2mm)，溶于20血灭菌的0. 9%化C1 (体积准确）。30DC，170rpm，l小时。滤纸过滤，取一半滤液，于沸水中煮沸30分钟，阴性对照。所有滤液于4 "C备 用。
[001引 2、200 y 1反应体系，依次于96孔板上加入：雜100 jiL抑5. 0巧樣酸盐一憐酸盐 缓冲液；?孟.50化±壤浸提液；鬚：50化SOmMABTS江作浓度20mlABTS)。
[0013] 3、96孔板样品排列与说明： 96孔板样品排列
4、检测条件：96孔板培养溫度为30°C;波长为420nm;吸光值读取时间为酶液培养前 1小时内，隔5分钟读取吸光值1次，之后的5个小时内每隔半小时读取吸光值1次；检测 总时长为8小时；利用多功能酶标仪进行光吸收值检测。
[0014] 5、最大产物生成潜势计算：漆酶产物合成符合一级动力学方程，即ODt= 0Dm3xX
[l-exp(-kXt)]，其中，ODt为时间t时的酶产物吸光值，ODM。,为生成产物最大理论吸光值，t为酶一底物培养时间，k为产物生成速率常数，1/k即为得到的平均反应时间MPT。将不同 培养时间（t)和相应吸光值（ODt)代入非线性方程，并拟合出ODm。、。
[001引 6、酶活力计算：酶活力扣/L) =a(T6/U20)X(V总/V酶）X(ODwax/MPT)。运 里的酶活定义为：25°C，每分钟内，氧化1ymol的ABTS所需酶量。公式解释：V,自和V酶代 表反应体系的总体积和经过适当稀释后的反应酶液体积，ODm。、代表在MPT时间内吸光值的 变化。ABTS的摩尔消光系数（molarextinctioncoefficient)C42。数值取 36, 000mol L1cm1。
[0016] 7、最后，样品漆酶活力应扣除阴性(灭菌±)对照。
[0017] 实施例2 1、称5g(干重)鲜±(<2mm)，溶于50血灭菌的0. 9%化C1 (体积准确）。30DC，170rpm，l小时。滤纸过滤，取一半滤液，于沸水中煮沸45分钟，阴性对照。所有滤液于4 "C备 用。
[001引 2、200y1反应体系，依次于96孔板上加入：雜100jiL抑5. 0巧樣酸盐一憐酸盐 缓冲液；?孟.50化上壤浸提液；鬚：50化IWrnMABTS(工作浓度30mlABTS)。
[0019] 3、96孔板样品排列与说明： 96孔板样品排列
4、检测条件：96孔板培养溫度为30°C;波长为420nm;吸光值读取时间为酶液培养前 1小时内，隔5分钟读取吸光值1次，之后的5个小时内每隔半小时读取吸光值1次；检测 总时长为8小时；利用多功能酶标仪进行光吸收值检测。
[0020] 5、最大产物生成潜势计算：漆酶产物合成符合一级动力学方程，即ODt=ODmaxX [l-exp(-kXt)]，其中，ODt为时间t时的酶产物吸光值，ODM。,为生成产物最大理论吸光值， t为酶一底物培养时间，k为产物生成速率常数，1/k即为得到的平均反应时间MPT。将不同 培养时间（t)和相应吸光值（ODt)代入非线性方程，并拟合出ODm。、。
[0021] 6、酶活力计算：酶活力扣/1>(10~6/U20)X(V.営/V酶）X(ODwax/MPT)。运里 的酶活定义为：25°C，每分钟内，氧化1ymol的ABTS所需酶量。公式解释：V,自和Vg*代表 反应体系的总体积和经过适当稀释后的反应酶液体积，ODm。、代表在MPT时间内吸光值的变 化。ABTS的摩尔消光系数（molarextinctioncoefficient)C42。数值取 36, 000moll1 cm1。
[0022] 7、最后，样品漆酶活力应扣除阴性(灭菌±)对照。
【主权项】
1. 一种土壤漆酶活力的测定方法，其特征在于，所述方法利用一级动力学模型，确定漆 酶底物利用最大潜势和最大产物合成的平均时间，并以此为基础计算漆酶活力；利用酶产 物合成动力学特征参数，从而使得漆酶活力测定过程更为标准化；包括以下过程： (1)无菌生理盐水浸提新鲜土壤样品，水土比10:1，重量比； (2 )ABTS为底物，其工作浓度为20-30mM; (3) 以96孔板为底物一酶液检测载体，以酶标仪测定产物吸光值； (4) 于不同底物一酶反应时间测定漆酶产物的吸光值； (5) 利用非线性回归模型，计算漆酶产物的最大合成潜势，以及相应的平均合成时间； (6) 利用上述最大产物合成潜势和平均合成时间，计算土壤漆酶活力。2. 根据权利要求1所述的一种土壤漆酶活力的测定方法，其特征在于，所述MABTS底 物，20-30mMABTS为最适底物浓度，通过设立一系列底物浓度，S卩1，2，3，5，8，12，20， 30和50mMABTS底物，明确20-30mMABTS浓度条件下，漆酶产物的吸光值随培养时间而 持续增加，且不受土壤环境因子的抑制。3. 根据权利要求1所述的一种土壤漆酶活力的测定方法，其特征在于，所述测定产物 吸光值，0-6小时持续测定吸光值，由于漆酶一底物反应过程符合一级动力学特征而非直线 方程，即产物合成会经历初始快速合成、吸光值迅速升高，而中期缓慢、后期停滞的动力学 特征；因此，选取如下时间点测定漆酶产物的光吸收值：底物一酶液混合前1小时内，5-10 分钟间隔测定产物吸光值，中、后期20-30分钟间隔测定吸光值。4. 根据权利要求1所述的一种土壤漆酶活力的测定方法，其特征在于，所述方法通过 一级动力学方程拟合漆酶产物动力学过程，并将酶活力与动力学参数计算相结合，进而确 定特定森林土壤条件下漆酶对底物利用的最大活力，以及形成最大产物合成的时间尺度， 从而避免传统方法中对漆酶酶活力测定的时间点与最大产物生成量的主观臆断。
【专利摘要】一种用于测定土壤漆酶活力的方法，涉及土壤漆酶活力测定方法，该方法包括如下步骤：1、利用灭菌的0.9%？NaCl浸提新鲜土样；2、于96微孔板上，以2,2ˊ-联氮双二铵盐（ABTS）为底物，底物工作浓度为20-30mM；3、吸光值测定时间，每5-10分钟测定吸光值1次，1-5小时时间段，20-30分钟测定吸光值1次；4、利用一级动力学方程，拟合漆酶产物生成过程，并确定漆酶产物最大生成量时吸光值，以及生成相应的最大产物量的平均合成时间；5、计算漆酶活力。此法排除传统线性方程计算漆酶活力时，初始浓度时间段选取时的主观臆测，以及最大产物生成量难以确定的不足。本发明有利于土壤漆酶活力测定方法的统一和标准化。
【IPC分类】C12Q1/26
【公开号】CN105200118
【申请号】CN201510614584
【发明人】苏宝玲, 王月阳, 白震, 范业展, 唐强
【申请人】沈阳大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月24日