天然植物皂苷功效组分的筛选方法及用图
【技术领域】
[0001]本发明的天然植物皂苷功效组分的筛选方法及用途，属于动物营养与饲料科学领域。该发明可作为动物营养及饲料科学研究的一种辅助方法，有利于缩短中枢调控用天然植物皂苷类用于饲料添加剂的研究周期。
【背景技术】
[0002]动物生长是一个复杂的生物代谢过程，受基因型、激素、营养、环境等多方面的影响。这些因素对生长的影响作用都是通过直接或间接影响动物内分泌系统来实现的。人和动物的生长是由促生长激素轴来调控的，促生长激素轴由生长激素释放因子(GRF)、生长激素(GH)和胰岛素样生长因子(IGF)构成。目前的研究表明，参与猪的生长中枢调控的非营养性饲料添加剂的种类很多，如铜、半胱胺(CS87)、苯二氮卓类化合物(F89)、肾上腺素能受体激动剂(如盐酸特伦克罗)、莱克多巴、大豆黄酮等。而由于食用安全的原因，苯二氮卓类化合物(F89)、盐酸特伦克罗(瘦肉精)、莱克多巴等药物被禁止用于猪等动物生长的调控。已发现植物黄酮、皂甙等对动物的生长有调节作用。因此进一步筛选参与动物中枢调控的天然活性成分具有重要的现实意义。
[0003]—些天然植物中含有皂苷、多糖、黄酮等多种药理成分，与动物的的中枢神经的兴奋和抑制过程均有影响。如五加科植物多有改善大脑的兴奋过程，也增加大脑皮层的内抑制过程。1984年，Barenboim等首次从刺五加的根中提取出来刺五加苷B和E，随后Takasugi等证明了刺五加皂苷B和E是刺五加的主要活性成分，目前已知刺五加苷B有抗疲劳作用，刺五加苷E有抗压作用。
[0004]许多大分子物质会受到血脑屏障制约而不能进入脑内，血脑屏障可以防止血液中的神经毒素伤害中枢神经系统，具有保护性作用；对于很多必须的水溶性物质和神经组织所需的代谢物具有比较低的被动渗透性，从而保持脑组织内环境的基本稳定，对维持中枢神经系统正常生理状态具有重要的生物学意义。
[0005]以往对于天然植物功效成分的作用及其饲料化另的研究，多是总结饲养试验等研究成果，如:申请号为“201310296894”的专利“一种促进猪生长及改善肉质的中药饲料添加剂”、申请号为“201310609512”的专利“一种促进猪生长的绿色饲料预混料”、申请号为“201310002811”的专利“一种可促进猪生长及降低猪肉胆固醇的复合饲料添加剂”等，这样使研究的周期变长及其对调控机理的认识受到限制。通过血脑屏障模型筛选参与动物中枢调控的天然活性成分是较快捷径的方法。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是建立一种天然植物中对中枢调控发挥作用的皂苷组分筛选方法，缩短天然植物皂苷用于动物生长促进剂的研究周期。
[0007]天然植物皂苷功效组分的筛选方法，按照下述步骤进行:(I)将已经分离纯化的猪脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞共培养建立猪的离体血脑屏障模型，以细胞培养板为介质，将内皮细胞和星形胶质细胞共培养，然后通过渗漏试验来初步判断模型的完整性。通过实时监测共培养模型的跨膜电阻值，来进一步确定模型的完整性。最后通过芦丁通透性测试和荧光素钠通透系数测定来评价共培养模型的功能。借助此模型研究刺五加皂苷B和E在血脑屏障模型的通透性。
[0008]天然植物皂苷功效组分的筛选方法的用途，用于筛选天然植物中对中枢调控发挥作用的皂苷组分。
[0009]本发明的优点
[0010]1、建立了一种简便的筛选动物中枢调控的非营养性生长促进剂的方法
[0011]2、降低了实验的成本和可操作性的难度
[0012]3、极大地缩短了研究的周期
【附图说明】
[0013]图1为星形胶质细胞和微血管内皮细胞共培养示意图，
[0014]图2为刺五加皂苷B在体外BBB模型中不同时间点的通透率。
【具体实施方式】
[0015]实施例1
[0016]1.离体血脑屏障共培养模型的建立用.25%胰酶将符合试验要求的猪星形胶质细胞消化下来，然后离心，留底部沉淀，用培养用完全培养基重悬底部沉淀，调整细胞密度，以4X 15接种于处理过的Transwell培养板的底部，然后将其倒置于无菌烧杯中，培养箱中培养3小时，然后取出按正常位置放置于24空培养版中，培养小室和培养池中均加入足量的培养液，培养箱中正常培养，一周后，接种猪脑微血管内皮细胞。
[0017]将消化下来的纯化的脑微血管内皮细胞以5X 15密度接种于涂布有鼠尾胶的Transwell培养板的上面，在供池内加入完全培养基，然后每隔两天换液一次。直至到达试验所需状态为止。同时设立对照组，只接种脑微血管内皮细胞组、只接种星形胶质细胞组和空白组。
[0018]2.以刺五加为例检测模型对不同皂苷组分的通透性:
[0019]将上述构建好的体外血脑屏障模型进行挑选，试漏试验显示阳性的用来进行通透性试验。向供池中加入刺五加皂苷B和刺五加皂苷E各1ml，每种试剂分为五个浓度梯度，分别为20、30、40、50、60、70mg/L。受体池中分别加入2ml的培养基，然后在第4、8、12、16、20、24、28h时候分别从受体池中吸取200ul滤液，4°C保存备用，待所有样品收集完毕进行分析处理。向滤液中分别加2倍体积的甲醇，超声处理20min,后离心1min (5000r, 4°C )，取上清液，做LC/MS分析。结果表明:大量的刺五加皂苷B通过体外血脑屏障模型，24h通透率为(58.24±1.32) %，刺五加皂苷E在滤液中未检测到。
【主权项】
1.天然植物皂苷功效组分的筛选方法，按照下述步骤进行:(I)将已经分离纯化的猪脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞共培养建立猪的离体血脑屏障模型，以细胞培养板为介质，将内皮细胞和星形胶质细胞共培养，然后通过渗漏试验来初步判断模型的完整性。通过实时监测共培养模型的跨膜电阻值，来进一步确定模型的完整性。最后通过芦丁通透性测试和荧光素钠通透系数测定来评价共培养模型的功能。借助此模型研究刺五加皂苷B和E在血脑屏障模型的通透性。2.天然植物皂苷功效组分的筛选方法的用途，用于筛选天然植物中对中枢调控发挥作用的皂苷组分。
【专利摘要】本发明公开了天然植物皂苷功效组分的筛选方法及用途，属于动物营养与饲料科学领域。采用离体血脑屏障模型，通过模型的通透性试验筛选进入中枢的天然植物皂苷的功效组份，作为动物营养及饲料科学研究的一种辅助方法，有利于缩短中枢调控用天然植物皂苷类用于饲料添加剂的研究周期。
【IPC分类】C12Q1/02
【公开号】CN105200111
【申请号】CN201510561547
【发明人】杨连玉, 车东升, 杨文艳, 孔志伟, 董晓庆, 王军, 张天芮, 赵春雨
【申请人】吉林农业大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年8月31日