人参皂苷Rg1的新用途的制作方法

专利名称：人参皂苷Rg1的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及人参皂苷Rg1治疗/预防阿尔茨海默病的用途，尤其涉及人参皂苷Rg1在治疗/预防Aβ1-42介导的神经毒性作用所引起的阿尔茨海默病的新用途。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种以进行性认知功能障碍为主要临床表现的神经变性疾病，细胞外大量积聚的神经炎性斑块(Neuriteplaques，NP)、细胞内异常沉积的β-淀粉样肽(β-amyloidpeptide，Aβ)和神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle，NFT)形成及神经突触丢失或神经元丢失是AD的主要神经病理特征。虽然AD的发病机制尚未完全阐明，但“Aβ级联反应学说”已为大多数学者所接受，即各种原因所导致的Aβ代谢异常，引起Aβ在脑组织的异常积聚，进而触发了与AD病理生理、生化相关的级联反应，最终导致神经元的损害。Aβ在体内具有单聚体、寡聚体和凝聚态(纤丝状)几种存在方式，研究发现寡聚态的Aβ比纤丝状、单聚体的Aβ更具有神经毒性，对包括学习记忆的神经生理破坏作用更为广泛。
AD发病中的一个重要早期病理生理改变是细胞内应激反应损害、线粒体功能失调。研究发现直接暴露在Aβ的培养神经元和高表达APP的转基因鼠的脑组织中，皆出现了早期应激反应蛋白激酶JNK/p38-SAPK的活化、NO相关的氮自由基代谢异常及神经元线粒体功能缺陷，如电子传递异常、线粒体膜电位改变、ROS增高等。这些研究提示Aβ造成的细胞内应激反应损害、线粒体功能失调在AD发病过程中起重要的作用。神经元突触可塑性和LTP与学习记忆能力密切相关，研究报道具有神经毒性作用的Aβ导致的神经元突触功能和LTP的异常是AD早期的另一关键性病理生理改变，其中cAMP/PKA/CREB信号通路在参与LTP的调节中占有重要的地位。
到目前为止AD的治疗仍缺乏有效的药物，虽然胆碱脂酶抑制剂和NMDA受体拮抗剂是当前临床上常用的主要治疗药物，能不同程度地改善AD病人的认知和记忆功能、提高病人的生活质量，但不能阻止AD病理发展的进程和延缓患者病情的进展。人参皂苷Rg1是从人参提取的含有2个糖基的单体化合物，以往的研究已经发现1、人参皂苷Rg1可明显减轻多种实验动物模型的学习记忆障碍，提高动物的学习记忆能力；2、可通过增加乙酰胆碱的合成与释放、增加M胆碱受体数量、提高乙酰胆碱转移酶的活性，改善胆碱系统的调节功能；3、人参皂苷Rg1可通过减轻MPTP/MPP+诱导的应激反应来保护多巴胺神经元；4、Rg1还具有增强长时程电位、提高突触的可塑性和改善老年鼠的免疫调节等作用。但人参皂苷Rg1对寡聚态Aβ1-42引起的神经元应激损伤、线粒体功能失衡及与长时程增强有关的cAMP/PKA/CREB信号通路等AD早期的关键性病理生理改变是否具有保护作用呢？目前还不是很清楚。

发明内容
本发明的目的在于提供一种人参皂苷Rg1新用途，具体为人参皂苷Rg1在制备治疗/预防Aβ1-42介导的神经毒性作用所引起的阿尔茨海默病的药物/保健品中的应用。
所述的神经毒性作用是指Aβ1-42介导的皮层神经元调亡。
所述的神经毒性作用是指Aβ1-42介导的早期神经元应激损害。
所述神经毒性作用是指Aβ1-42诱导的皮层神经元线粒体损伤。
所述神经毒性作用是指Aβ1-42对蛋白激酶K-cAMP反应元件结合蛋白信号通路的抑制作用。
蛋白激酶K-cAMP反应元件结合蛋白的英文名称为proteinkinase K-cAMP response element binding protein，缩写为PKA-CREB。
本发明的人参皂苷Rg1一般以药物组合物的形式使用，这种组合物含有治疗有效剂量的作为活性成分的人参皂苷Rg1和可药用辅料。含有人参皂苷Rg1的药物组合物可通过口服、注射或粘膜给药，可以制成片剂、胶囊、粉剂、颗粒、锭剂，或口服液等剂型供临床应用。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。含有人参皂苷Rg1的营养品可以口服。
本申请提供了中药单体人参皂苷Rg1具有以下功能可减轻寡聚态Aβ1-42介导的神经元应激损害，保护线粒体的功能，减少神经元凋亡；人参皂苷Rg1还可减轻Aβ1-42对PKA-CREB信号通路的抑制作用，有助于形成长时程增强、改善记忆功能。从而为人参皂苷Rg1应用于阿尔茨海默病的防治提供了直接有力的实验依据和理论基础，既有很强的科学性和创新性，又有很高的开发应用价值。


图1.1神经元TUNNEL染色(×400)。皮层神经元分别经过0.5μM、1.0μM、5.0μM的寡聚态Aβ1-42作用24h或48h，然后进行TUNNEL染色，凋亡的细胞核被染成阳性。A10.5uM Aβ1-42处理24h，B10.5uMAβ1-42处理48h；A21.0uM Aβ1-42处理24h，B11.0uM Aβ1-42处理48h；A35.0uM Aβ1-42处理24h，B35.0uM Aβ1-42处理48h；A4对照组，B4对照组。
图1.2TUNNEL染色阳性神经元的数量。*P＜0.05 vs对照组。
图1.3神经元TUNNEL染色(×400)。神经元经过2.5μM、5.0μM、10μM的Rg1预孵育24h后，再添加终浓度为5μM的寡聚态Aβ1-42共同作用48h，最后进行TUNNEL的阳性染色。A对照组，B5.0uM Aβ1-42for 48h，C2.5uM Rg1+Aβ1-42，D5.0uM Rg1+Aβ1-42，E10uM Rg1+Aβ1-42，F单纯10uM Rg1处理组。
图1.4人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42诱导的神经元凋亡，每孔取五个视野计数TUNNEL阳性神经元并取平均值。*P＜0.05vs对照组；#P＜0.05vs Aβ1-42处理组。
图1.5寡聚态Aβ1-42诱导皮层神经元caspase-3的活性增加。分别用0.5μM、1.0μM和5μM的寡聚态Aβ1-42作用于皮层神经元24h或48h时，*P＜0.05vs对照组。
图1.6人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42诱导的caspase-3活化。分别用2.5μM、5.0μM和10μM的Rg1预孵育24h后，再加入5.0μM寡聚态Aβ1-42共作用于皮层神经元48h，*P＜0.05vs对照组，#P＜0.05vs Aβ1-42处理组。
图2.1寡聚态Aβ1-42诱导皮层神经元ROS水平升高。ROS的密度分析用图表示，*p＜0.05vs对照组。
图2.2人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42诱导的皮层神经元ROS的升高。ROS的水平用图表示，*p＜0.05vs Aβ1-42处理组。
图2.3寡聚态Aβ1-42诱导皮层神经元H2O2的产生。H2O2的密度分析用直方图表示，*p＜0.05vs对照组。
图2.4人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42诱导的皮层神经元内H2O2升高。H2O2的水平用直方图表示，*p＜0.05vs Aβ1-42处理组。
图2.5寡聚态Aβ1-42诱导的皮层神经元NO水平的升高。分别用0.5μM、1.0μM和5.0μM三种浓度的寡聚态Aβ1-42作用于神经元24h或48h，*p＜0.05vs对照组。
图2.6人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42诱导的皮层神经元NO水平的升高。NO的水平用直方图表示，*p＜0.05vs Aβ1-42处理组。
图2.7寡聚态Aβ1-42处理不同时间后神经元内p38和p-p38的表达水平。用western-blot方法(p38和p-p38抗体)检测裂解物中p38和p-p38的水平，总p38和p-p38的点密度分析用直方图表示，*p＜0.05vs对照组。
图2.8人参皂苷Rg1降低p-p38/p38的水平，*p＜0.05vs Aβ1-42处理组。
图2.9寡聚态Aβ1-42处理不同时间后神经元内JNK和p-JNK的表达水平。用western-blot方法检测裂解物中JNK和p-JNK水平，总JNK和p-JNK水平经点密度分析用直方图表示，*p＜0.05vs对照组。
图2.10人参皂苷Rg1降低p-JNK/JNK的水平。*p＜0.05vs Aβ1-42处理组。
图3.1寡聚态Aβ1-42降低线粒体膜电位，线粒体膜电位的密度分析用直方图表示，*p＜0.05vs对照组。
图3.2人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42诱导的神经元线粒体膜电位的降低。线粒体膜电位的水平用直方图表示，*p＜0.05vs Aβ1-42处理组。
图3.3寡聚态Aβ1-42降低皮层神经元ATP的产生。ATP的水平用直方图表示，*p＜0.05vs对照组。
图3.4人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42降低皮层神经元ATP产生的作用。ATP的水平用直方图表示，*p＜0.05vs Aβ1-42处理组。
图3.5寡聚态Aβ1-42降低线粒体复合物IV的活性。复合物IV的活性用直方图表示，*p＜0.05vs对照组。
图3.6人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42对线粒体复合物IV活性的损害。复合物IV的活性用直方图表示，*p＜0.05vs Aβ1-42处理组。
图3.7寡聚态Aβ1-42诱导皮层神经元线粒体细胞色素c的释放。线粒体细胞色素c的水平用直方图表示，*p＜0.05vs对照组。
图3.8人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42诱导神经元线粒体细胞色素c的释放。不同浓度(2.5μM/5μM/10μM)的人参皂苷Rg1预孵育24h后与寡聚态的Aβ1-42共孵育48h，然后测定胞浆和线粒体内细胞色素c的含量，*p＜0.05vs Aβ1-42处理组。
图4.1寡聚态Aβ1-42降低谷氨酸介导的CREB的磷酸化水平。寡聚态Aβ1-42处理不同时间后检测神经元内CREB和p-CREB的蛋白水平，p-CREB/CREB的比值用直方图表示，*p＜0.05vs谷氨酸对照组。
图4.2人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42降低CREB的磷酸化程度。不同浓度(2.5μM/5μM/10μM)的人参皂苷Rg1预孵育24h后与寡聚态的Aβ1-42共孵育2h，然后测定神经元内CREB和p-CREB的蛋白水平，p-CREB/CREB的比值用直方图表示，*p＜0.05vs谷氨酸对照组。
图4.3人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42对PKA酶活性的降低。不同浓度(2.5μM/5μM/10μM)的人参皂苷Rg1预孵育24h后与寡聚态的Aβ1-42共孵育2h，PKA的活性用直方图表示，*p＜0.05vs对照组。
图4.4人参皂苷Rg1降低PKA IIα亚基的蛋白水平。用PKA IIα抗体免疫应迹方法检测，PKA IIα/β-actin的比值用直方图表示，*p＜0.05vs Aβ1-42处理组。
具体实施例方式
实施例1 人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42诱导的皮层神经元凋亡1.TUNNEL染色(1)细胞接种在盖玻片上，经人参皂苷Rg1和/或寡聚态Aβ1-42干预后，吸弃培养基，用1xPBS小心冲洗。
(2)3.7％甲醛在18℃-24℃固定10min。
(3)吸弃甲醛后用100％乙醇固定20min，用1xPBS冲洗。
(4)样品用1xPBS于18℃-24℃条件下浸泡10min后，小心吸弃周围水。
(5)加入50μL的神经元打孔剂(Neuropore)液体于细胞充分接触，在湿盒18℃-24℃下作用15min-30min。
(6)无DNA酶的水冲洗2次，每次2min。
(7)滴加灭活剂[含有3％H2O2的甲醇]在18℃-24℃条件下作用5min后，用1xPBS于18℃-24℃条件冲洗1次，约2min。
(8)用末端脱氧核苷酰酶酸转移酶(TdT)标记缓冲液在18℃-24℃条件作用5min。
(9)滴加标记反应混合液[TdT dNTP Mix；TdT Enzyme；Mn2+]，于湿盒37℃条件下作用1h。
(10)用TdT终止缓冲液终止反应，在18℃-24℃条件作用5min。
(11)弃终止反应液，1xPBS冲洗2次，每次2min。
(12)擦干周围水，滴加链霉亲和素标志的辣根过氧化物酶(streptavidin-HRP)，在18℃-24℃条件作孵育10min。
(13)1xPBS冲洗2次，每次2min后，3，3′-二氨基联苯胺(DAB)显色，室温2-10min后，充分水洗，核复染后，充分水洗，氨水返蓝、水冲后，中性树脂封片。
1.1寡聚态Aβ1-42诱导皮层神经元凋亡TUNNEL染色原代培养的C57BL/6小鼠的皮层神经元分别经过0.5μM、1.0μM、5μM的寡聚态Aβ1-42作用24h或48h，各组神经元进行TUNNEL染色，最后进行TUNNEL阳性细胞计数，统计各组之间的TUNNEL阳性细胞数目。如图1.1所示，对照组神经元形态正常，结构完整，分布均匀，见少量的TUNNEL染色阳性的神经元，即表现为胞质消失，胞核呈棕褐色。不同浓度(0.5μM、1.0μM、5μM)寡聚态Aβ1-42作用不同时间(24h、48h)后TUNNEL染色阳性神经元有不同程度的增加，以5μM的寡聚态Aβ1-42作用48h其数量增多最为明显(p＝0.0001)，阳性神经元计数结果如表1.1和图1.2所示。
表1.1 TUNNEL染色阳性神经元


1.2人参皂苷Rg 减轻寡聚态Aβ1-42诱导的皮层神经元凋亡经过2.5μM、5.0μM、10μM的Rg1预孵育24h后，再添加终浓度为5μM的寡聚态Aβ1-42共同作用48h，最后进行TUNNEL的阳性染色。结果如图1.3所示，对照组神经元形态正常，结构完整，分布均匀，见少量的TUNNEL染色阳性神经元，即表现为胞质消失，胞核呈棕褐色，以5μM的寡聚态Aβ1-42作用48h TUNNEL染色阳性神经元数量明显增多(p＝0.0001)，不同浓度(2.5μM、5.0μM、10μM)人参皂苷Rg预孵育24h后，再与5μM的寡聚态Aβ1-42共同孵育48h，则TUNNEL染色阳性神经元不同程度的降低，阳性神经元计数结果如表1.2和图1.4所示。
表1.2 TUNNEL染色阳性神经元(*P＜0.05vs对照组；#P＜0.05vs Aβ1-42处理组)

2.半胱天冬酶3(caspase-3)活性测定(1)用细胞刮刀刮下细胞，并计算细胞数。
(2)取所需的细胞数体积，400xg离心5min后弃上清。
(3)按照50μL/2×105个细胞比例，加入裂解液，冰上裂解10min。
(4)在4℃条件下以最大离心速度离心5min，取上清。
(5)按照1∶100的比例添加1M的二硫苏糖醇(DTT)于2x反应缓冲液(2x Reat ion buffer)，配成2x Reat ion Buffer/DTT液体。
(6)在96孔测量板上，加入50μL的2xReation Buffer/DTT液体，于37℃预孵预5min。
(7)加入50μL的细胞裂解液，阳性抑制剂组应另外添加1μLcaspase抑制剂。
(8)于37℃孵育1h，上机检测荧光强度。激发波长380nm；发射波长460nm。
2.1寡聚态Aβ1-42增强神经元caspase-3的活性在研究细胞凋亡的同时，以相同条件下测定皮层神经元内caspase-3的活性。结果如图1.5所示，在浓度为0.5μM、1.0μM和5μM的寡聚态Aβ1-42作用于皮层神经元24h或48h时，皮层神经元caspase-3活性随着Aβ1-42作用浓度增加而增高。另外，在相同浓度条件下寡聚态的Aβ1-42作用时间越长，caspase-3活性增高越明显。这提示寡聚态Aβ1-42激活caspase-3活性具有一定的浓度依赖性。其中1.0μM寡聚态Aβ1-42作用48h、5μM的寡聚态Aβ1-42作用24h和48h与对照组比较，caspase-3活性显著升高(p值分别为0.019，0.001，0.0001)。
2.2人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42诱导皮层神经元caspase-3活化分别用2.5μM、5.0μM和10μM的Rg1预孵育24h后，再加入5.0μM寡聚态Aβ1-42共作用于皮层神经元48h，然后测定皮层神经元内caspase-3活性。研究发现，单独Aβ1-42作用的皮层神经元活性内caspase-3活性明显升高，然而经过人参皂苷Rg1预孵育的各浓度组的皮层神经元内的caspase-3活性却有不同程度的降低(与Aβ1-42作用组比较，p值分别皆小于0.05)。这提示人参皂苷Rg1可减轻寡聚态Aβ1-42对caspase-3的活化。如图1.6所示。
实施例2人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42对神经元的应激损害1.荧光法测定活性氧基团(ROS)的水平不同条件处理的各组细胞，经0.25％的胰酶消化，无菌的PBS小心洗涤后计数。取相同细胞数，直接加入1M 2、7-二氯氢化荧光素二酯(DCFH-DA)溶液，调整终浓度为10uM，37℃条件下5％CO2培养箱中静置0.5h。无菌PBS小心洗涤3次后，使用荧光分光光度计，选择480nm激发波长和530nm发射波长，测量荧光强度，同时设置空白对照管。
1.1寡聚态Aβ1-42诱导的皮层神经元ROS水平升高5μM的寡聚态Aβ1-42作用原代培养的小鼠皮层神经元后，观察不同时间点(3h、6h、12h、24h、48h)细胞内ROS的水平，研究结果如图2.1所示寡聚态Aβ1-42可诱导神经元内ROS的产生，并且随着寡聚态Aβ1-42作用时间的延长，神经元内ROS水平越来越高，其中寡聚态Aβ1-42作用24h和48h时，神经元内的ROS升高最为显著。这提示ROS可能参与寡聚态Aβ1-42对神经元损害作用。
1.2人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42诱导的皮层神经元ROS的升高前面研究发现，寡聚态Aβ1-42可诱导神经元内ROS的产生，并且随着作用时间的延长，在5μM寡聚态Aβ1-42作用24h和48h，细胞内的ROS明显升高。在此基础上，采用不同浓度(2.5/5/10μM)的人参皂苷Rg1预孵育24h后，再与Aβ1-42共同作用24h或48h，测定细胞内的ROS水平。结果如图2.2所示，在Aβ1-42共同作用24h或48h后，不同浓度的人参皂苷Rg1均可抑制寡聚态Aβ1-42所致的细胞内ROS水平的升高。
2.荧光法测定H2O2水平接种在96孔板的皮层神经元，经各种条件处理后，细胞暴露于含有50μM的Amplex试剂(Amplex Red reagent)和0.1U/ml辣根过氧化物酶(horseradish peroxydase，HRP)作用60min，选择激发波540nm和发射波590nm，用多功能荧光酶标仪测定荧光强度。同时设置空白对照组。
2.1寡聚态Aβ1-42诱导皮层神经元H2O2的产生5μM寡聚态Aβ1-42作用皮层神经元后，观察不同时间点(3h、6h、12h、24h、48h)细胞内H2O2的水平，研究发现随着寡聚态Aβ1-42作用时间的延长，神经元内H2O2水平不断升高，如图2.3所示，提示对神经元的损害不断加重，以寡聚态Aβ1-42作用24h和48h H2O2水平升高最为显著(p分别为0.007、0.002)。
2.2人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42诱导的皮层神经元内H2O2升高前面研究发现5μM寡聚态Aβ1-42孵育24h或48h可明显升高神经元内H2O2水平。所以选择寡聚态Aβ1-42孵育24h或48h作为研究时间点，观察不同浓度的人参皂苷Rg1对神经元内H2O2水平的可能影响。研究发现人参皂苷Rg1预孵育组比Aβ1-42单独孵育24h或48h组，神经元内的H2O2水平都有不同程度的降低。单独给予人参皂苷Rg1处理，神经元内H2O2水平与对照组相似，如图2.4所示。
3.NO代谢产物亚硝酸盐的测定(1)用不含氮的细胞裂解液，裂解细胞。
(2)然后用高速离心机离心，去掉残余的碎片。
(3)再用Bio-rad蛋白试剂盒进行蛋白定量。
(4)取相同量的蛋白用Griess法进行测定蛋白中含有的亚硝酸根，同时设有标准曲线，从曲线中算出亚硝酸根的具体数值A按50微升/孔，在96孔板中加入标准品及样品。B按50微升/孔，在96孔板中加入标准品及样品。C按50微升/孔，在各孔中加入室温Griess ReagentI。D按50微升/孔，在各孔中加入室温Griess Reagent II。E室温下混合10min-15min后上机检测，波长为540nm测定吸光度。
3.1寡聚态Aβ1-42诱导皮层神经元NO水平的升高本实施例用0.5μM、1.0μM和5.0μM三种浓度的寡聚态Aβ1-42，研究Aβ1-42作用24h和48h后细胞内NO的水平。研究结果如图2.5所示三种浓度皆能增加细胞内的NO水平。Aβ1-42作用48h的细胞与作用24h相比，细胞内NO水平升高更为明显；高浓度的Aβ1-42要比低浓度的Aβ1-42诱导的NO水平升高程度要显著。其中5.0μM的Aβ1-42作用48h后，细胞内NO水平升高了4-5倍。
3.2人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42诱导的皮层神经元NO水平的升高先用不同浓度的人参皂苷Rg1预孵育24h，然后加入终浓度为5.0μM寡聚态Aβ1-42共同作用48h，最后测定细胞内NO水平，比较各组之间的变化。研究结果如图2.6所示不同浓度的人参皂苷Rg1预孵育组细胞内NO的水平皆低于单纯Aβ1-42作用组，单独给予人参皂苷Rg1细胞内NO水平与对照组相似。这提示人参皂苷Rg1可不同程度的减少寡聚态Aβ1-42诱导的细胞内NO水平升高。
4.Western-blot检测JNK、p38的蛋白水平弃培养液，用预冷的PBS清洗2次，每孔加入100μl细胞裂解液〔10mmol/L Tris(PH7.4)、100mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、1mmol/L EGTA、1mmol/L NaF、20mmol/L Na4P2O7、2mmol/L Na3VO4、0.1％SDS、0.5％Sodium deoxycholate、1％Trion-X100、1mmol/LPMSF、60μg/ml aprotinin、10μg/ml leupeptin、1μg/mlpepstatin〕，在冰面上裂解20min，用细胞刮刀将细胞刮下，混匀，于14000×g、4℃离心10min，吸上清液至离心管中，Bradford法进行蛋白定量。取20μg样品，加入等体积的2×上样缓冲液〔125mmol/L Tris(PH6.8)、10％g lycerol、10％SDS、0.006％bromophenol blue、130mmol/L DTT〕混匀，100℃沸水中煮90sec，以10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用半干电转移法将蛋白转移到PVDF膜，室温下用封闭液封闭1h后将膜移入用封闭液稀释的一抗(1∶1000稀释，兔来源的多克隆抗体JNK、p-JNK、p38和鼠来源的单克隆抗体p-p38)，4℃孵育过夜，洗液洗涤3×5min、1×10min，辣根过氧化物酶耦联的IgG二抗(1∶1000稀释)反应2h，洗液洗涤3×5min、1×10min，用化学发光法显色，X射线底片曝光。β-actin作为内参照。实验重复3次。
4.1寡聚态Aβ1-42诱导皮层神经元p38磷酸化水平的增加本实施例选择1h内来研究寡聚态Aβ1-42对原代培养的小鼠皮层神经元的影响，即在原代培养的小鼠皮层细胞中，加入5μM的寡聚态Aβ1-42作用5min、15min、30min和60min，然后用western-blot来测定细胞内p-p38和p38的蛋白水平。从图2.7所示，可以看到Aβ1-42作用5min后p-p38/p38的比值明显升高，这提示Aβ1-42诱导皮层神经元p38发生磷酸化，激活了p38的活性。但是随着Aβ1-42作用时间的延长，p-p38/p38的比值升高也发生了变化，逐渐下降。
4.2人参皂苷Rg1降低寡聚态Aβ1-42诱导的皮层神经元p38磷酸化前面研究发现当5μM寡聚态Aβ1-42作用5min时p-p38/p38比值达到最高。所以，我们选择5min作为寡聚态Aβ1-42作用时间，研究人参皂苷Rg1对p38磷酸化的可能影响。结果如图2.8所示20μM的p38特异性抑制剂SB203580可明显抑制寡聚态Aβ1-42诱导的p38磷酸化，而不同浓度的人参皂苷Rg1具有与p38特异性抑制剂SB203580相似的作用，可不同程度的降低p-p38/p38比值。此外，单独给予10μM的人参皂苷Rg1处理可明显地减少p-p38的蛋白表达水平。这提示人参皂苷Rg1可抑制皮层神经元p38的磷酸化和减轻Aβ1-42诱导p38发生磷酸化，从而抑制p38介导的早期应激反应。
4.3寡聚态Aβ1-42诱导的皮层神经元c-Jun氨基端激酶(JNK)磷酸化水平的增加本实施例以5μM寡聚态Aβ1-42，研究1h内(5min、15min、30min和60min)JNK磷酸化水平的变化情况。从图2.9所示，可以看到Aβ1-42可使得p-JNK/JNK的比值升高，这提示Aβ1-42诱导皮层神经元的JNK过度磷酸化。但是随着Aβ1-42作用时间的延长，p-JNK/JNK的比值也发生了变化。在Aβ1-42作用15min和30min时，p-JNK/JNK的比值最高，随着时间的延长p-JNK/JNK的比值逐渐下降。这提示Aβ1-42诱导皮层神经元JNK活性增高是有时间范围的，而且是在早期发生了应激反应激活JNK的活性。
4.4人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42诱导的皮层神经元JNK磷酸化前面研究发现寡聚态Aβ1-42可使得p-JNK/JNK的比值发生了改变，在15min和30min时，p-JNK/JNK的比值达到最高水平后，p-JNK/JNK的比值就逐渐下降。所以，选择15min作为研究的时间点，探讨人参皂苷对p-JNK/JNK的比值的可能影响。研究结果如图2.10所示，10μM的JNK磷酸化特异性抑制剂sp600125可阻断寡聚态Aβ1-42诱导的p-JNK/JNK的比值升高，不同浓度的人参皂苷Rg1可不同程度的减轻寡聚态Aβ1-42诱导的p-JNK/JNK的比值升高，这提示人参皂苷Rg1可抑制JNK的活性，从而减轻Aβ1-42介导的早期应激损害。
实施例3人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42诱导的皮层神经元线粒体损伤
1.荧光法测定线粒体膜电位的水平不同条件处理的各组细胞，经0.25％的胰酶消化，无菌的HBSS(Hank s’balanced saltsolution)小心洗涤后计数。取相同细胞数，直接加入1xJC-1在37℃的培养箱孵育15min后，用HBSS洗涤三次，加入等体积的分析缓冲液轻轻混匀，上机检测荧光强度(exλ488nm，emλ525nm；exλ530nm，emλ590nm)。所得的荧光强度比值反映线粒体内外膜电位差红色荧光强度(exλ530nm，emλ590nm)/绿色荧光强度(exλ488nm，emλ525nm)。
1.1寡聚态Aβ1-42对皮层神经元线粒体膜电位的破坏作用正常细胞的线粒体膜上，内外侧面存在电位差，它是线粒体维持电子传导过程所需要，如果线粒体膜上的电位差减弱了，该线粒体功能将受到限制。本中请发现，5μM寡聚态Aβ1-42可降低线粒体膜上的电位差，随着寡聚态Aβ1-42作用时间(3h、6h、12h、24h、48h)的延长，该线粒体的膜电位差越来越小，如图3.1所示。这提示寡聚态Aβ1-42对神经元线粒体具有毒性作用。
1.2人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42对神经元线粒体膜电位的破坏作用前面研究发现寡聚态Aβ1-42作用24h或48h可明显降低线粒体膜电位，因此在前面研究基础上，探讨人参皂苷Rg1对寡聚态Aβ1-42破坏线粒体膜电位的可能影响。研究发现，不同浓度的人参皂苷Rg1可不同程度的提高线粒体膜电位，减轻寡聚态Aβ1-42对线粒体膜电位的破坏作用。这提示人参皂苷Rg1可能具有保护线粒体，减轻寡聚态Aβ1-42对神经元线粒体的毒性作用，结果如图3.2所示。
2.细胞内ATP水平测定采用Roche公司的ATP Bioluminescence As say Kit HS II检测细胞内ATP的含量。ATP试剂盒中的溶解缓冲液(dilution buffer)将各组细胞数量调至104/ml，之后加入ATP试剂盒中的细胞裂解试剂(cell lysis reagent)于15℃-25℃条件下作用5min，最后加入等体积的荧光(素)酶试剂(luciferase reagent)，用化学发光检测仪检测化学发光的强度，比较不同组细胞内ATP水平。
2.1寡聚态Aβ1-42降低皮层神经元ATP的水平ATP是细胞内直接的能量提供体，它来源于线粒体。ATP的水平直接反应线粒体的功能状态，也可提示线粒体的损害与否和损害程度。如图3.3所示，5μM寡聚态Aβ1-42可降低细胞内ATP的水平，并且在12h、24h和48h时ATP的水平降低有统计学意义(p值分别为0.047，0.001，0.0004)，以Aβ1-42作用24h和48h时ATP水平降低最为明显。这也提示寡聚态Aβ1-42可破坏线粒体产生能量的功能，并随时间的延长，其破坏作用越来越严重。
2.2人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42降低皮层神经元ATP产生的作用前面研究发现5μM寡聚态的Aβ1-42作用于皮层神经元24h和48h时，神经元内的ATP水平已经明显下降。在此基础上，研究不同浓度的人参皂苷Rg1对细胞内ATP水平的影响。结果如图2.14所示不论在寡聚态的Aβ1-42作用于皮层神经元24h还是48h，不同浓度的人参皂苷Rg1可减轻寡聚态的Aβ1-42降低细胞内ATP的程度。这提示人参皂苷Rg1可能具有保护线粒体，减轻寡聚态Aβ1-42对线粒体的破坏作用。
3.细胞内线粒体复合物IV活性测定(1)寡聚态Aβ1-42作用于皮层神经元不同时间，用1x冷的PBS(PH7.4)洗2遍。
(2)用细胞刮刀刮下细胞(每组大约1×107个细胞)，离心、弃上清。
(3)用50μL分离缓冲液(isolaton buffer250mM sucrose；20mMHEPES PH7.2 and 1mM EDTA)轻轻重悬细胞。
(4)加入1x分析缓冲液(1x assay buffer10mM Tris-HCl PH7.0 and 120mM KCl)轻轻重悬细胞。
(5)加入1x酶溶解缓冲液(1x enzyme dilution buffer10mM Tris-HCl PH7.0)50μL轻轻重悬细胞。吸出小部分的混匀液体进行蛋白定量。
(6)最后加入50μL细胞色素c底物溶液(ferrocytochrome csubstrate solution)(0.22mM)，在波长550nm测定其在3min内每5秒吸光值。
3.1寡聚态Aβ1-42对线粒体复合物IV活性的损害线粒体复合物IV是线粒体电子传递链上重要的复合物酶，它的活性变化关系到线粒体产生ATP的能力和影响到氧化产物的生成。本实施例用线粒体复合物IV的特异性底物细胞色素c在550nm的吸光值改变情况，间接提示线粒体复合物IV的功能状态。研究发现线粒体复合物IV活性受到寡聚态Aβ1-42的影响，寡聚态的Aβ1-42可降低线粒体复合物IV的活性。在5.0μM寡聚态Aβ1-42的作用12h、24h和48h后，线粒体内复合物IV不同程度下降，尤其是寡聚态Aβ1-42的作用24h和48h后，线粒体内复合物IV下降最为明显，如图3.5所示。
3.2人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42对线粒体复合物IV的活性损害前面研究发现寡聚态Aβ1-42可抑制线粒体复合物IV的活性，寡聚态Aβ1-42作用24h和48h后，线粒体内复合物IV活性明显下降。所以，在前面的研究基础上，探讨人参皂苷Rg1对Aβ1-42抑制复合物IV活性的可能影响。各种浓度的人参皂苷Rg1可不同程度的减轻Aβ1-42对复合物IV活性的抑制作用，提示人参皂苷Rg1能减轻寡聚态Aβ1-42对线粒体呼吸链复合物IV活性的抑制作用，如图3.6所示。
4.细胞线粒体的提取、细胞胞浆和线粒体内细胞色素c的测定提取细胞线粒体的步骤(1)不同浓度寡聚态Aβ1-42作用于皮层神经元不同时间，用冷的1x PBS(PH7.4)洗一遍。
(2)用细胞刮刀刮下细胞(每组大约1×107个细胞)，4℃条件600xg离心5min弃上清，重复两次。
(3)加入1ml胞浆缓冲液(1x cytosolic buffer)，轻轻重悬，置于冰上15min。
(4)在冰上用1ml的匀浆器(KONTES，Fisher Scientific Company)手动匀浆后，4℃条件下800xg离心20min弃沉淀物(沉淀物为细胞核、细胞碎片和完整的细胞)，上清包含线粒体和胞浆液。
(5)上清液于4℃条件下800xg离心10min弃除残余的细胞核，重复2次。
(6)于4℃条件下10000xg离心20min，所得上清为胞浆成分，沉淀为线粒体成分。
(7)用1x胞浆缓冲液(1x cytosolic buffer)重悬线粒体部分，于4℃条件下10000xg离心20min弃上清后，加入完整的线粒体缓冲液(complete mitochondrial buffer)，冰上裂解15min后充分混匀。
(8)含有胞浆成分的上清液体，于4℃条件下16000xg离心30min，弃沉淀。
(9)用Bio-Rad protein assay测定蛋白浓度，分装后置于-80℃保存。
测定细胞胞浆和线粒体内细胞色素c(1)细胞色素c标准曲线制备和含细胞色素c的样品滴加用已知浓度的细胞色素c按照梯度用封闭缓冲液从50ng/ml-0.781ng/ml依次稀释。含细胞色素c的样品用封闭缓冲液稀释到20-100ng/ml浓度，每孔加入100μL体积。
(2)细胞色素c与抗体的结合在室温下100rpm的速度孵育2h后，用250μL洗液洗3次。
(3)细胞色素c检测抗体的结合按照说明书要求配合所需的细胞色素c检测抗体浓度，室温下100rpm的速度孵育1h后，用250μL洗液洗3次。
(4)HRP耦联的streptavidin与细胞色素c检测抗体结合按照说明书要求配合所需浓度，室温下100rpm的速度孵育1h后，用250μL洗液洗4次。
(5)显色、读数用develping solution室温下孵育2-10min后，加入stop solution，最后在450hm分光光度计读数。
4.1寡聚态Aβ1-42诱导皮层神经元线粒体细胞色素c的释放细胞色素c主要存在于线粒体内，是线粒体电子传递链重要物质，参与线粒体的氧化磷酸化和ATP的产生。正常情况下细胞色素c存在于线粒体内，当线粒体受到损害时线粒体的双膜结构通透性增加或膜完整性被破坏，线粒体的细胞色素c就释放到胞浆中，从而激活caspase级联反应，诱导caspase依赖性的凋亡产生。如图3.7所示，对照组中胞浆的细胞色素c含量是很少，大部分细胞色素c位于细胞线粒体中。在经过5.0μM寡聚态Aβ1-42作用后，随着时间的延长，胞浆内的细胞色素c含量逐渐增高，线粒体内的细胞色素c的含量不断的减少。
4.2人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42诱导的神经元线粒体细胞色素c的释放前面研究发现寡聚态Aβ1-42作用48h后，胞浆内的细胞色素c含量明显增高，线粒体内的细胞色素c的含量明显的减少，胞浆内的细胞色素c含量超过线粒体内的细胞色素c含量。在此基础上，研究不同浓度的人参皂苷Rg1预孵育24h后与寡聚态的Aβ1-42共孵育48h，然后测定胞浆和线粒体内细胞色素c的含量，结果如图3.8所示不同浓度的人参皂苷Rg1预孵育组可不同程度的减少胞浆中的细胞色素c，提高线粒体内的细胞色素c含量。这提示人参皂苷对线粒体具有一定的保护作用。
实施例4人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42对PKA-CREB信号通路的影响1.Western-blot检测p-CREB/CREB及PKA IIα亚基的蛋白水平弃培养液，用预冷的PBs清洗2次，每孔加入100μl细胞裂解液〔10mmol/L Tris(PH7.4)、100mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、1mmol/L EGTA、1mmol/L NaF、20mmol/L Na4P2O7、2mmol/L Na3VO4、0.1％SDS、0.5％Sodium deoxycholate、1％Trion-X 100、1mmol/LPMSF、60μg/ml aprotinin、10μg/ml leupeptin、1μg/mlpepstatin〕，在冰面上裂解20min，用细胞刮刀将细胞刮下，混匀，于14000×g、4℃离心10min，吸上清液至EP管中，Bradford法进行蛋白定量。取20μg样品，加入等体积的2×上样缓冲液〔125mmol/L Tris(PH6.8)、10％g lycerol、10％SDS、0.006％bromophenol blue、130mmol/L DTT〕混匀，100℃沸水中煮90sec，以10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用半干电转移法将蛋白转移到PVDF膜，室温下用封闭液封闭1h后将膜移入用封闭液稀释的一抗(兔来源的多克隆抗体CREB、鼠来源的单克隆抗体p-CREB和兔来源的多克隆抗体PKA IIα分别1∶1000稀释)，4℃孵育过夜，洗液洗涤3×5min、1×10min，辣根过氧化物酶耦联的IgG二抗(1∶1000稀释)反应2h，洗液洗涤3×5min、1×10min，用化学发光法显色，X射线底片曝光。β-actin作为内参照。实验重复3次。
1.1寡聚态Aβ1-42降低CREB的磷酸化程度CREB又名cAMP反应元件结合蛋白，是一种转录调节因子，CREB在Ser133位点磷酸化可使得CREB-cAMP结合物增强下游基因的蛋白表达。研究结果如图4.1所示，寡聚态Aβ1-42降低谷氨酸介导的CREB的磷酸化水平，在Aβ1-42作用2h时，p-CREB/CREB的比值降低最为明显。
1.2人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42降低CREB的磷酸化程度前面研究表明，寡聚态Aβ1-42可降低谷氨酸介导的CREB的磷酸化，在5.0μM寡聚态Aβ1-42作用2h时，p-CREB/CREB的比值降低最为明显。因此，选择2h作为Aβ1-42作用的时间点，研究人参皂苷Rg1对其可能影响。结果如图4.2所示，人参皂苷Rg1可不同程度的增加p-CREB蛋白水平，使得p-CREB/CREB的比值升高。
1.3人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42诱导的PKA IIα亚基的蛋白水平PKA IIα亚基是PKA的调节亚基，它是cAMP与PKA结合的基团，PKA IIα亚基的蛋白水平与PKA的活性呈反比。本实施例将探讨5μM的寡聚态Aβ1-42作用2h后，PKA活性的变化的基础上，从PKA亚基的角度来研究和间接推测PKA的活性情况，以及人参皂苷Rg1可能的保护作用机制。结果如图4.4所示。
2.细胞内PKA活性测定(1)处理后的各组细胞，吸弃上清，用1×冰冷的PBS洗一遍。加入裂解液buffer[20mM MOPS，50mM β-glycerolphosphate，50mMsodium fluoride，1mM sodium vanadate，5mM EGTA，2mM EDTA，1％NP40，1mM dithiothreitol，1mM benzamidine，1mM PMSF and 10μg/mL leupeptin and aprotinin]；(2)冰上裂解10分钟，细胞刮刀刮下，移至1.5ml的离心管；(3)13,000rpm离心15分钟；(4)取上清，蛋白定量。
(5)PKA酶作用底物的准备工作a)计算所需的孔数，把剩余的保存在4℃的干燥密封锡箔纸袋子；b)每孔加入50μL的kinase assay dilution buffer，在室温浸泡10分钟；c)小心吸弃各孔液体。
(6)加入标准品和样品a)每孔加入30μL的反应液加入纯的活性PKA或样品或空白孔(只有kinase assay dilutionbuffer)；b)除了空白组，每孔加入10μL的ATP溶液(用kinaseassay dilution buffer溶解的1mg/mL浓度)，未来避免交叉污染，加入每孔的液体后换新的tip头；c)封好给孔，在30℃孵育90分钟，最好是每隔20分钟轻轻摇晃几下，以便充分混匀；d)吸弃每孔液体以终止反应，倒扣板，在干净的纸上，轻拍反应板。
(7)加入特异性磷酸底物抗体a)除了空白孔，每孔加入40μL的phospho-secific substrate antibody；b)用新的具有黏附功能的封口膜，封好板，室温下孵育60分钟，最后是每隔20分钟轻摇，使其充分混匀。
(8)洗板a)吸弃各孔液体；b)每孔加入100μL的洗液，使用排枪(为了降低背景，每次洗液间隔1-2分钟)；c)重复洗3次，共4次；d)第4次，吸弃洗液后，倒扣板，在干净纸上，轻拍板。
(9)加入抗兔Ig-GHRP CONJUGATEa)除了空白孔，每孔加入40μL的现配好的抗兔IgGHRP Conjugate(1∶1000的antibody dilution buffer稀释)；b)封好板，在室温下孵育30分钟，每隔10分钟轻摇，使其充分混匀；c)洗板，步骤同4。
(10)加入TMB SUBSTRATE和ACID STOP SOLUTIONa)每孔加入60μL的TMB SUBSTRATE；b)室温下孵育30-60min，同时观察颜色变化；c)按照加入TMB SUBSTRATE的顺序加入20μL的STOP SOLUTION。
(11)测定吸光值吸光波长450nm。
2.1人参皂苷Rg1减轻寡聚态Aβ1-42对PKA酶活性的降低蛋白激酶A(PKA)是细胞内一种重要的蛋白激酶，活化的PKA可使细胞内某些蛋白(包括CREB)的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化，于是改变这些蛋白的活性，进一步影响到相关基因的表达。在前面研究发现，5μM的寡聚态Aβ1-42作用2h可明显降低CREB的磷酸化水平，而CREB最主要的调节激酶为PKA，所以本实施例将探讨5μM的寡聚态Aβ1-42作用2h后，PKA活性的变化，以及人参皂苷Rg1可能的保护作用。结果图4.3所示5μM的寡聚态Aβ1-42作用2h后，PKA的活性显著下降，各浓度的人参皂苷Rg1可不同程度的减轻Aβ1-42诱导的PKA活性下降。这些提示人参皂苷Rg1可能直接或间接的保护PKA的活性，减轻Aβ1-42对PKA的抑制作用。
权利要求
1.人参皂苷Rg1的新用途，其特征在于人参皂苷Rg1在制备治疗/预防Aβ1-42介导的神经毒性作用所引起的阿尔茨海默病的药物/保健品中的应用。
2.根据权利要求1所述的人参皂苷Rg1的新用途，其特征在于所述的神经毒性作用是指Aβ1-42介导的皮层神经元调亡。
3.根据权利要求1所述的人参皂苷Rg1的新用途，其特征在于所述的神经毒性作用是指Aβ1-42介导的早期神经元应激损害。
4.根据权利要求1所述的人参皂苷Rg1的新用途，其特征在于所述神经毒性作用是指Aβ1-42诱导的皮层神经元线粒体损伤。
5.根据权利要求1所述的人参皂苷Rg1的新用途，其特征在于所述神经毒性作用是指Aβ1-42对蛋白激酶K-cAMP反应元件结合蛋白信号通路的抑制作用。
全文摘要
本发明涉及人参皂苷Rg1治疗/预防阿尔茨海默病的用途，提供了人参皂苷Rg1在治疗/预防Aβ
文档编号A61P25/00GK101084909SQ20071000917
公开日2007年12月12日 申请日期2007年7月3日 优先权日2007年7月3日
发明者陈晓春 申请人:福建医科大学附属协和医院