一种牡蛎蛋白的保肝护肝肽制剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及牡蛎产品的生产方法领域，尤其涉及一种牡蛎蛋白的保肝护肝肽制剂的制备方法。
【背景技术】
[0002]近年来的科学认为，人体吸收蛋白质主要是以肽的形式吸收的，肽是由氨基酸组成的分子，分子量在5000?200Da之间，具有极强的活性和多样性，能用肽营养的生理功能和生物活性，调节人体内各系统和细胞的生理功能，激活体内有关酶素，因此，各种肽成为人体健康的重要物质。牡蛎肽是从牡蛎肉粉中提取的蛋白质为原料，再经过定向酶切及特定小肽分离技术获得的小分子低聚肽。
[0003]牡.(oyster)，属软体动物门(Mollusca)，瓣鲍纲(Lanellibranchia)，异柱目(Anisomyaria)，牡■科(Ostreidae)动物，俗称海■子，是我国四大养殖贝类之一，也是我国卫生部批准的第一批药用兼保健的功能性食品。牡蛎中蛋白质的含量较高，是制备生物活性肽的良好原料。自然存在于海洋生物中的活性肽含量较少，而且提取困难，难以大量生产；化学合成多肽费时费力，成本昂贵，因此人们越来越多的利用酶解的方法从海洋生物蛋白质中提取活性肽。鲜牡蛎肉呈青白色，质地柔软细嫩，鲜味突出，带有腥味，味道独特，是一种高蛋白、低脂、富含糖原、牛磺酸及大量活性元素的食品，也是传统医学中的药材。随着现代医学研究的深入，发现牡蛎还具有多种生物学活性，如提高机体免疫力、抗肿瘤、对肝脏的保护作用等，已引起研究者的关注。但是对牡蛎的直接酶解，取得酶解效率较低。
[0004]现代营养学研究表明，牡蛎肉含有蛋白质、脂肪复合糖原和10种氨基酸，其中包括人体必需的氨基酸成分，此外还含有维生素A、B、B2, D以及钙、磷等矿物质和铜、碘、锌、锰、钡等多种对人体生理机能具有重要作用的微量元素。牡蛎肉还含有葡萄糖、岩藻糖以及糖脂类成分。
[0005]在牡蛎中所含有的牛磺酸可以促进胆汁分泌，排除堆积在肝脏中的中性脂肪，提高肝脏的解毒作用。在对小鼠的实验中:服用牡砺粉提取物的小鼠，肝内乙醇脱氢酶的含量较未用药物的小鼠明显增加；在经过14天胃管给酒后，未用牡砺粉提取物的小鼠肝细胞切片显示肝细胞出现脂肪变性，而用药的小鼠肝细胞切片显示未见异常改变。可见获得的牡砺粉提取物，具有明显的肝保护作用。由于牡蛎肉的糖元氨基酸、维生素等含量丰富，其中如天然胡萝素可为维生素A的前体，能提高人体免疫力，延缓细胞衰老，亦能防癌抗癌。国内外都有牡蛎提取物的抗肿瘤方面的报道，日本与英国国立癌症研究中心和法国巴黎药学部细胞分子药理学研究所，共同研究牡蛎肉浸出物成分和效用，结果表明:牡蛎肉浸出物对癌症有抑制作用，并能减轻抗癌药阿霉素对心脏的副作用。另据报道，L-岩藻糖能使大鼠的肿瘤缩20%且没有毒性。国内相关人员研究表明，牡蛎提取物不仅能提高荷瘤小鼠的免疫能力，而且能抑制小鼠肝癌和其体内人结肠癌的生长。牡蛎制剂的临床应用范围随着经验的积累正在不断扩大，如对严重酒后酒精中毒病人有效，可消除大量饮酒后胃部不适、恶心。国内研究者张红雨等对渤海湾密鳞牡蛎进行了较全面的营养成分分析，结果表明，密鳞牡蛎富含牛磺酸(50pmol/g)、锌、砸，含有一定量的高度不饱和脂肪酸(EPA+也很丰富)，脂肪、胆固醇含量较低。吴成业等进行了太平洋牡蛎、僧帽牡蛎和近江牡蛎中游离氨基酸和牛磺酸的分析，三者中皆含有人体所有8种必需氨基酸，其中含量最高的都是赖氨酸，这对平衡国民膳食中氨基酸比例具有重要意义，三种牡蛎中牛磺酸的含量分别高达7.542，4.388和3.591mg/g，几乎超过其他游离氨基酸含量的总和。
[0006]范建高等报道，在适当减轻造模大鼠体重的同时，还会显著降低血脂和肝组织脂肪含量，并显著改善肝组织病理学变化。何冬宁等研究了牡蛎对大剂量四氯化碳(CCl4)致小鼠急性肝损伤作用，结果表明，牡蛎可明显抑制CCldI起的小鼠血清谷丙转氨酶(SGPT)、谷草转氨酶(SGOT)升高、肝糖元含量降低、肝脂质过氧化物(LPO)的过量产生，并能使组织形态学上的肝细胞变性、坏死得到明显的减少和改善，肝细胞再生活跃。表明JCOE对肝脏有较好的保护作用。杨勇进等采用给予酒精灌胃制造酒精性肝损伤模型的方法对75只古Wistar大鼠进行了实验研究。结果表明，JOCE可以有效地降低由酒精引起的IL-17、TNF-α及转氨酶的升高，有明显的保肝降酶的作用。
[0007]目前，关于酶水解牡蛎蛋白的专利技术大多采用单酶或复合酶一步水解的酶解模式，这种酶解模式不利于牡蛎蛋白的水解，也不宜于牡蛎蛋白中生物活性序列的释放。目前有关牡蛎提取物的制备方法很多，如US66732涉及到一种由牡蛎分泌液制备牡蛎提取物的方法；CN1024074涉及到一种全营养牡蛎精粉的生产方法；CN1067553涉及到一种由新鲜活牡蛎提取有效成分的方法；CN1132646采用酶解工艺制备牡蛎成分；CN1302501涉及到牡蛎肉粉的加工方法；这种处理方法会损失蛋白多肽中的功能成分而降低其生物学活性，而采用微囊化技术既可以掩盖牡蛎蛋白肽的不良气味，又不会损失多肽中的功能成分。
[0008]采用双酶分步水解模式提高牡蛎蛋白的水解度，制备具有保肝护肝活性的牡蛎蛋白肽以及利用微囊化技术提升其品质的研究尚未发现。因此，开发一种可控制的酶法制备高活性、风味优良的牡蛎蛋白保肝护肝肽的方法具有重要的理论意义和应用价值。
[0009]综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。
【发明内容】
[0010]针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种牡蛎蛋白的保肝护肝肽制剂的制备方法，其采用双酶分步水解模式，提高了牡蛎蛋白的水解度，克服了传统工艺会损失牡蛎蛋白多肽中的功能成分而降低其生物学活性的缺陷，制备出了具有保肝护肝活性的牡蛎蛋白肽，以及利用微囊化技术掩盖牡蛎蛋白肽的不良气味，保持多肽的高活性，提升了产品的品质。
[0011]为了实现上述目的，本发明提供一种牡蛎蛋白的保肝护肝肽制剂的制备方法，包括如下步骤:步骤A:取定量牡蛎粉，按一定比例加入去离子水，水浴加热，匀浆处理，得到牡蛎匀浆液；步骤B:调节步骤A中得到的牡蛎匀浆液pH为7.0?10.0，加入蛋白酶I，在40?60°C条件下进行酶解反应2?4h ;步骤C:保持步骤B所述酶解反应的反应体系温度和pH不变，加入蛋白酶II，继续酶解2?4h，终止反应，得到牡蛎蛋白水解液；步骤D:将步骤C得到的牡蛎蛋白水解液升温至75?95°C，保持15?30min，灭活蛋白酶I和蛋白酶II，冷却后离心除杂，得到上清液；步骤E:向步骤D所述上清液中加入95%乙醇，使其终体积达到总体系的60?80%，4°C静置10?15h后离心取上清液，调节所述上清液pH至6.0?8.0，并将所述上清液通过截流分子量为3000?1000Da的超滤膜，收集超滤液，得到牡蛎多肽。
[0012]根据本发明的的牡蛎蛋白的保肝护肝肽制剂的制备方法，所述步骤A之前还包括:将新鲜牡蛎剥壳取肉洗净，冷冻干燥后粉碎。
[0013]根据本发明的的牡蛎蛋白的保肝护肝肽制剂的制备方法，步骤B中，所述蛋白酶I为碱性蛋白酶或胰蛋白酶；步骤C中，所述蛋白酶II为复合风味蛋白酶、木瓜蛋白酶或中性蛋白酶中的任一种。
[0014]根据本发明的的牡蛎蛋白的保肝护肝肽制剂的制备方法，步骤B中，所述蛋白酶I按每10g牡蛎蛋白加入200?800KU蛋白酶的比例加入；步骤C中，所述蛋白酶II可按照每10g牡蛎蛋白加入200?800KU蛋白酶的比例加入。
[0015]根据本发明的的牡蛎蛋白的保肝护肝肽制剂的制备方法，所述步骤A具体为:取定量牡蛎粉，按1:20?1:30 (质量与体积比)比例加入去离子水，然后在75?95°C水浴中加热15?30min，在勾楽功率1500?3500r/min下勾楽5?lOmin，得到牡■勾楽液。
[0016]根据本发明的的牡蛎蛋白的保肝护肝肽制剂的制备方法，还包括将步骤E中得到的所述牡蛎多肽通过微囊化技术处理。
[0017]根据本发明的的牡蛎蛋白的保肝护肝肽制剂的制备方法，所述微囊化技术处理包括如下步骤:(I)将微囊化壁材溶于水中，制成壁材溶液；(2)将步骤(I)所述壁材溶液按一定比例加入到步骤E所述牡蛎蛋白保肝护肝肽溶液中，室温下搅拌0.5?2h，得到混合溶液；(3)对上述混合溶液进行喷雾干燥处理，得到微囊化蛋白多肽。
[0018]根据本发明的的牡蛎蛋白的保肝护肝肽制剂的制备方法，步骤(I)中，所述壁材为乳清浓缩蛋白(蛋白质含量多80% )、海藻酸钠或二者的混合物，所述海藻酸钠与浓缩乳清蛋白混合质量比为1:10?1:35。
[0019]根据本发明的的牡蛎蛋白的保肝护肝肽制剂的制备方法，步骤(I)中，所述壁材溶液中壁材的质量浓度可根据蛋白多肽溶液中多肽的质量以及混合溶液的干物质含量来确定；步骤(2)中，所述牡蛎蛋白保肝护肝肽溶液与所述壁材的质量比为1:1?1:5。
[0020]与现有技术相比，本发明的方法具有如下有益效果:
[0021]1、本发明采用双酶分步水解的酶解模式，可有效提高牡蛎蛋白的水解度，工艺简单易行，便于工业化生产；