专利名称：：一种三七茎叶总皂苷在制备免疫佐剂的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种三七茎叶总皂苷在制备免疫佐剂的应用。
背景技术：
：近年来，随着免疫学基础理论研究的深入，以及抗原提纯技术和基因工程技术的迅速发展，出现了多种DNA重组疫苗、合成肽疫苗等，这些新型疫苗具有纯度高、分子量小、特异性强，安全性好等优点。但迄今为止，开发成功的相关疫苗却为数甚少。其原因主要是纯化后的抗原免疫原性弱，单独使用难以诱导机体产生有效的免疫应答。解决这一关键问题的有效途径是使用佐剂。自上世纪20年代Glenny应用氢氧化铝(明矾)作为免疫佐剂以来，铝胶佐剂因其低毒性而仍是至今唯一通过FDA批准的能用于人的佐剂。但是它存在一些无法克服的缺点(1)对人免疫缺陷病毒(fflV)、丙型肝炎病毒(HCV)、单纯疱渗病毒(HSV)、流感病毒以及吸血虫病、百曰咳和伤害的抗原无免疫佐剂性效果；(2)铝胶制备过程，质量标准难以标化；(3)只能诱导体液免疫，不能诱导细胞介导免疫反应后者对于机体<特别是对细胞内寄生病原体(病毒、原虫等)以及肿瘤产生免疫力>尤为必要，远远不能满足新型疫苗的发展要求。为此，近年来各国科研工作者为寻找新的免疫佐剂开展了广泛的研究，并取得了一定的进展。30年代佐剂的研究达到了第一个高潮，以白油为佐剂的研究风靡全世界，但是，随之而来的是副作用之强烈、致癌物质的危害。20世纪卯年代，以蜂胶为代表的新型佐剂尽管能全面启动细胞免疫系统，减少应激，但存在着免疫期较短，在常温下保存易发生变色、沉淀、形成结块、副作用大等一系列缺点。近年来，各国科研工作者对免疫刺激复合体(ISCOM)、细胞因子、天然物质等免疫佐剂作用开展了广泛的研究，并取得了一定的进展。但由于存在不同程度的毒副作用或安全隐患等一些不可避免的缺点，限制了它们的实际应用。因此，迫切需要开发安全、高效的新型免疫佐剂。
发明内容本发明提供了一种三七茎叶总皂苷在制备免疫佐剂的应用，釆用三七茎叶总皂苷为主要有效成分制备的免疫佐剂可以显著地增强抗原的免疫原性，对机体免疫功能有广泛的调节作用，能诱导Thl和Th2免疫应答，免疫佐剂活性优于至今唯一人用的免疫佐剂氢氧化铝胶，而且具有生产成本低、无毒的效果。本发明釆用了以下技术方案一种三七茎叶总皂苷在制备免疫佐剂的应用。所述的三七茎叶总皂苷是从五加科植物三七"otog/"^wg(Burk.)F.H.Chen的干燥茎叶中提取、分离得到。本发明三七茎叶总皂苷的制备过程如下步骤一，将五加科植物三七尸朋ox"otogiraewg(Burk,)F.H.Chen的茎叶粉碎后形成三七茎叶粗粉；步骤二，将三七茎叶粗粉通过乙醇进行回流提取，然后将乙醇提取液进行减压回收乙醇，浓缩；步骤三，将浓缩后的乙醇提取液浸膏用水进行混悬，然后用极性较小的有机溶剂进行萃取，萃取体积为水悬液的1/3,当萃取后的萃取液I接近无色时合并萃取液I，减压回收极性较小的有机溶剂，浓缩萃取液l;再用极性较大的有机溶剂进行萃取，当萃取后的萃取液n接近无色时合并萃取液n，减压回收极性较大的有机溶剂，浓缩萃取液n,将浓缩后的极性较大的有机溶剂萃取液n的浸膏在大孔树脂柱中进行色谱分离，用水洗去水溶性杂质，再用醇溶液为洗脱剂进行洗脱，收集醇洗脱液，减压回收醇溶液，浓缩，并干燥，得到三七茎叶总皂苷。本发明步骤二中乙醇的浓度为80%,回流提取三次，第一次提取2小时，第二次和第三次均提取1.5小时。本发明步骤三中极性较小的有机溶剂为石油醚、乙醚或氯仿。本发明步骤三中极性较大的有机溶剂为正丁醇或正戊醇。本发明步骤三中大孔树脂柱为D101或AB-8大孔树脂柱，醇溶液为浓度75%-95°/的甲醇或乙醇。本发明具有以下有益效果(1)本发明的三七茎叶总皂苷是从五加科植物三七wotog/raewg(Burk.)F.H.Chen的干燥茎叶中提取、分离得到，由于茎叶价格便宜，而且比较常见，因此采用三七干燥茎叶制备的三七茎叶总皂苷的价格也比较便宜，这样应用三七茎叶总皂苷制备免疫佐剂，可以有效地降低制备免疫佐剂的成本。(2)三七茎叶总皂苷药理作用广泛，毒副作用较小。本发明中三七茎叶总皂苷是从五加科植物三七的干燥茎叶中分离得到的，其分离得到的总皂苷具有镇痛、降血脂、抗心律失常、抗炎、抗衰老、增强力等作用，且毒副作用较小。长期毒性试验表明，大鼠按lg/kg、3g/kg、5g/kg连续用药6个月，一般状态无明显影响，血液学检査无明显影响，病理组织学检查各脏器未见明显病理变化。溶血性试验表明，三七茎叶总皂苷引起兔红细胞50%溶血浓度大于2mg/mL,其在临床应用浓度下基本没有溶血作用。(3)三七茎叶总皂苷与氢氧化铝佐剂比较还有如下优点1)三七茎叶总皂苷对注射动物的部位刺激性较小。例如，用含三七茎叶总皂苷的卵清白蛋白(OVA)溶液后腿皮下注射小鼠，未见局部刺激反应和全身不良反应。而用含氢氧化铝的OVA溶液后腿皮下注射小鼠，大部分小鼠都出现局部刺激反应，严重者注射部位由于小鼠的抓咬等还会出现溃烂和全身不良反应。2)三七茎叶总皂苷可以增强机体的细胞免疫应答反应，而氢氧化铝却无此特性。3)三七茎叶总皂苷和氢氧化铝均能诱导机体的体液免疫应答反应，但氢氧化铝只能诱发Th2免疫应答，不能诱发Thl免疫应答，三七茎叶总皂苷即能诱发Th2免疫应答，又能诱发Thl免疫应答，具有更广泛的体液免疫作用。4)三七茎叶总皂苷在水、醇溶液中均能完全溶解，长期保存也无沉淀产生，其各种剂型稳定性较好，因此以三七茎叶总皂苷为佐剂有效成分制备疫苗的方法简便，所制备疫苗的质量容易控制，可低温保存，延长疫苗的有效期。而以氢氧化铝为佐剂的疫苗则不能低温冻结，否则会被破坏胶态，因此，疫苗的有效期较短，储藏条件严格，质量不易控制。5)三七茎叶总皂苷药理作用广泛，除了有免疫佐剂作用外，还有抗衰老、抗炎、增强免疫力等作用。因此三七茎叶总皂苷制备成免疫佐剂作用于机体后，除了具有免疫佐剂作用，还对机体起到保健作用，对于体质虛弱的机体非常有利。而氢氧化铝只能起到免疫佐剂作用，无保健功能。图1为三七茎叶总皂苷体外对分裂原诱导小鼠脾细胞增殖反应影响的条形图图2为三七茎叶总皂苷对分裂原诱导OVA免疫小鼠脾细胞增殖反应影响的条形图(*尸<0.05，**P<0.01，***/><0.01vsOVA对照组);(a户<0.05，aa户<0.01，aaaJ°<0.01vsAlum/OVA组)图3为三七茎叶总皂苷对OVA免疫小鼠血清中特异性抗体IgG、IgGl和IgG2b抗体水平影响的条形图(><0.05，"P<0.01，*"<0.01vsOVA对照组)；(ai><0.05，aai><0.01，aaai><0.01vsAlum/OVA组)具体实施例方式本发明所述的三七茎叶总皂苷是从五加科植物三七"otog/"""g(Burk.)RH.Chen的干燥茎叶中提取、分离得到，它的具体的制备过程如下步骤一，将五加科植物三七"otog/"se"g(Burk.)F.H.Chen的茎叶粉碎后形成三七茎叶粗粉；步骤二，将三七茎叶粗粉通过浓度为80%乙醇进行回流提取提取三次，第一次提取2小时，第二次和第三次均提取1.5小时，然后将乙醇提取液进行减压回收乙醇，浓缩；步骤三，将浓缩后的乙醇提取液浸膏用水进行混悬，然后用极性较小的有机溶剂进行萃取，极性较小的有机溶剂为石油醚、乙醚或氯仿，萃取体积为水悬液的1/3，当萃取后的萃取液I接近无色时合并萃取液I,减压回收极性较小的有机溶剂，浓缩萃取液l;再用极性较大的有机溶剂进行萃取，极性较大的有机溶剂为正丁醇或正戊醇，当萃取后的萃取液n接近无色时合并萃取液n，减压回收极性较大的有机溶剂，浓缩萃取液n，将浓缩后的极性较大有机溶剂萃取液n的浸膏在大孔树脂柱中进行色谱分离，大孔树脂柱为D101或AB-8大孔树脂柱，用水洗去水溶性杂质，再用浓度为75%-95%的甲醇或乙醇为洗脱剂进行洗脱，收集醇洗脱液，减压回收醇溶液，浓缩，并干燥，得到三七茎叶总皂苷。下面通过实验来进一步说明三七茎叶总皂苷在制备免疫佐剂的应用。实施例一三七茎叶总龟苷中龟苷含量的测定(1)对照品和供试品溶液制备精密称取在6(TC减压干燥至恒重的人参皂苷Rbl对照品2.48mg于25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀，制备成每mL含0.992mg的对照品溶液。精密称取三七茎叶总桌苷25.6mg于25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀，制备成每mL含1.024mg的供试(2)线性关系的考查精密吸取0.5，1,1.5，2,2.5,3.0mL的对照品溶液，分别置于10mL具塞试管中，挥干溶剂，加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，在60。C水浴中加热15min，立即置冷水中冷却，加入冰醋酸5.0mL摇匀，放置15min，相应试剂随行空白对照，在波长560nm处测定吸收度A，以光吸收度为横坐标，以相应具塞试管人参皂苷Rbl的浓度(mg/mL)为纵坐标，绘制标准曲线。求回归方程为Y=0.03865X-0.00015,r=0.9994。结果表明人参皂苷Rbl含量在0.0083mg/mL-0.0496mg/mL之间，有良好线性关系。(3)精密度和加样回收率试验吸取供试品溶液lmL，按本实例(2)中所述方法显色，连续测定A值六次，RSD=0.43%,说明精密度良好。精密称取同一批次的三七茎叶总皂苷6份，制备成供试品溶液，精密加入不同体积的对照品溶液，进行加样回收率试验，平均回收率为99.3%,RSD为3.4。/。。(4)稳定性和重现性试验吸取供试品溶液lmL，按本实例(2)中所述方法显色，每隔5分钟测定一次A值，共测定6次，RSD=0.49%，说明在30分钟内稳定性良好。取同一批次的三七茎叶总皂苷6份，制备成供试品溶液，按本实例(2)中所述方法显色，测定吸光度，并用回归方程计算含量，计算得变异系数RSD《。/。，符合要求，该方法重现性好。(5)样品含量测定精密称取三七茎叶总皂苷样品6份，按本实例(1)中所述方法制备供试品溶液，精密吸取lmL的供试品溶液，按本实例(2)中所述方法显色，依法测定吸光度，并用回归方程计算含量，结果见表l。表l三七茎叶总皂苷中皂苷的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(6)含量限度因三七茎叶总皂苷的免疫佐剂活性与其不同成分的复合作用及皂苷的含量密切相关，提取工艺不同、药材在釆收过程中的不确定性等均能影响其药效的发挥，为确定其药效的稳定性，以6份样品平均含量的80%为下限，120%为上限，限定其含量范围为45%-67%。实施例二溶血性测定以真空釆血管从兔心脏采血，置盛有玻璃珠的三角瓶中，轻轻振摇15min，去除纤维蛋白，加二倍量的生理盐水进行洗涤，2000r/min离心10min，洗涤3次，红细胞悬浮液用生理盐水稀释成2%。取上述三七茎叶总皂苷，用0.45|im微孔滤膜过滤后，用生理盐水倍比稀释制成0.25mg/mL-5mg/mL稀释液，并设四个重复，将不同浓度供试品溶液各取2mL，分别加2mL2。/。的红血球悬浮液于试管中，混匀，并以生理盐水和蒸馏水分别做最大和最小溶血对照。将上述各试管置37。C恒温水浴锅培养lh后，离心，取上清，在412nm测定吸光度，各组的吸收值减去生理盐水对照组的吸收值就可以表示溶血性，按下面的公式计算其溶血率。公式:溶血率气T广To)/(T腿-T。)x100。Tmax:阳性对照蒸馏水作用组的吸光度；To:生理盐水作用组吸光度；TV.不同浓度的三七茎叶总皂苷作用时测得的吸光度。结果见表2。表2三七茎叶总皂苷对兔红细胞的溶血活性<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>从表2可见，三七茎叶总皂苷浓度为2.0mg/mL和l.Omg/mL时兔红细胞的溶血百分率分别为14.66%和0.16%。说明三七茎叶总皂苷的溶血性很小。本发明利用三七茎叶总皂苷的溶血性很小的特性在制备免疫佐剂时可以降低免疫佐剂的溶血性。实施例三体外淋巴细胞转化试验取IOO^iL脾细胞悬液(1x10"个/mL)加96孔板内，每份样品12孔，其中4孑L力口ConA(终浓度为5ng/rnL),4孔力口LPS(终浓度10pg/mL),4孔加100nLRPMI1640液，各孔再加入不同浓度的三七茎叶总皂苷稀释液(终浓度分别为0pg/mL，0.1^ig/mL,lfig/mL,10pg/mL,100|xg/mL)，37°C、5%C02培养48h。结束前4h，各孔加入MTT(2mg/mL)50pL/孔，继续培养4h。弃去各孔内液体，各加二甲基亚砜150jaL，置暗处室温15min，以酶标仪于578nm波长测定OD值，结果见图l。由图1可见，三七茎叶总皂苷在0.1pg/mL~lOO^g/mL的浓度范围内对刀豆蛋白A(ConA)和脂多糖(LPS)三种分裂原诱导小鼠脾细胞增殖反应呈浓度依赖性的双向免疫调节作用，浓度1.0ng/mL和lO.Ojag/mL时能显著或极显著促进这两种分裂原诱导小鼠脾细胞增殖反应。本发明可以利用实施例三中三七茎叶总皂苷的实验所得出的特性在制备免疫佐剂中可以提高免疫佐剂的双向免疫调节作用以及提高细胞的增殖反应。实施例四三七茎叶总皂苷对OVA免疫小鼠细胞免疫的影响本实施例中将三七茎叶总皂苷生理盐水溶液和OVA生理盐水溶液混合后在37。C的温度下以每分钟100转的转速振摇30分钟后得到三七茎叶总皂苷生理盐水溶液和OVA生理盐水溶液的混合液；将氢氧化铝的生理盐水溶液和OVA生理盐水溶液混合后在37'C的温度下以每分钟100转的转速振摇30分钟后得到氢氧化铝生理盐水溶液和OVA生理盐水溶液的混合液。将30只小鼠随机分组，每组5只。生理盐水对照组每只注射生理盐水0.2mL;OVA对照组每只注射0.2mL的OVA生理盐水溶液(0.5mg/mL);氢氧化铝(ALum)对照组每只注射O.lmLOVA生理盐水溶液(lmg/mL)和O.lmL氢氧化铝(Alum)生理盐水溶液(2mg/mL)的混合液；三七茎叶总皂苷试验组每只注射O.lmLOVA生理盐水溶液(lmg/mL)和O.lmL含100jig、200pg、400pg三七茎叶总皂苷生理盐水溶液的混合液。各组皮下注射免疫2次，第一次免疫和第二次免疫间隔14天，在第二次免疫后的14天，取小鼠放血处死，无菌取脾，磨碎、过滤，力口Hank，s液，1500rpm离心3分钟，弃上清液，重复洗涤2次，以RPMI1640培养液混悬细胞。取0.1mL脾细胞悬液加白细胞稀释液3.9mL,台盼兰染色计数，活细胞数不少于95%;取lmL脾细胞悬液，用PRMI1640液稀释、调整细胞浓度至1xl07+/mL。取lOOpL脾细胞悬液加96孔板内(重复12孔)，其中4孔加ConA液lOOpL(5jag/mL)，4孔加LPS液100jiL(10pg/mL),4孔加100jaLRPMI1640培养液。37°C、5%C02培养68h。结束前4h，各孔加入50nLMTT溶液(2mg/mL),继续培养4h。弃去各孔内液体，加二甲基亚砜溶液150pL,置暗处室温15min,以酶标仪于578nm波长测定OD值。计算刺激指数(SI)气有丝分裂原培养物的OD值)/(无有丝分裂原培养物的OD值)，结果见图2。从图2可见，三七茎叶总皂苷三个剂量组均能显著或极显著促进刀豆蛋白A(ConA)和脂多糖(LPS)两种分裂原诱导OVA免疫小鼠脾细胞增殖反应，而铝胶组与OVA组无显著性差异。说明三七茎叶总皂苷能显著增强OVA受免小鼠的细胞免疫反应，而铝胶则无此活性。本发明利用实施例四中三七茎叶总皂苷的实验所得出的特性在制备免疫佐剂中能显著增强细胞免疫反应。实施例五三七茎叶总皂苷对OVA免疫小鼠体液免疫的影响本实施例中将三七茎叶总皂苷生理盐水溶液和OVA生理盐水溶液混合后在37'C的温度下以每分钟100转的转速振摇30分钟后得到三七茎叶总皂苷生理盐水溶液和OVA生理盐水溶液的混合液；将氢氧化铝生理盐水溶液和OVA生理盐水溶液混合后在37'C的温度下以每分钟100转的转速振摇30分钟后得到氢氧化铝生理盐水溶液和OVA生理盐水溶液的混合液。将30只小鼠随机分组，每组5只。生理盐水对照组每只注射生理盐水0.2mL;OVA对照组每只注射0.2mL的OVA生理盐水溶液(0.5mg/mL);氢氧化铝(ALum)对照组每只注射O.lmLOVA生理盐水溶液(lmg/mL)和O.lmL氢氧化铝(Alum)生理盐水溶液(2mg/mL)的混合液；三七茎叶总皂苷试验组每只注射O.lmLOVA生理盐水溶液(lmg/mL)和O.lmL含100吗、200pg、400pg三七茎叶总皂苷生理盐水溶液的混合液。各组皮下注射免疫2次，第一次免疫和第二次免疫间隔14天，在第二次免疫后14天分离血清，在96孔酶标板每孔加入100uL包被液，置4'C孵育24h后，用洗涤液洗涤3次，每次3min。每孔加150pL封闭液，于37。C孵育2h后用洗涤液洗涤3次，每次3min。每孔加待检血清稀释液100pL，每个样品3复孔，重复3次。37。C孵育2h,用洗涤液洗涤3次，每次3min。每孔加入辣根过氧化物酶标兔抗小鼠IgG、辣根过氧化物酶标羊抗小鼠IgGl或IgG2b抗体稀释液100pL，37'C孵育2h后用洗涤液洗涤3次，每次3min。每孔加lmg/mL邻苯二胺底物溶液100pL，37。C显色10min，每孔加2M硫酸50pL终止反应。置酶标仪于490nm处测定OD值，结果见图3。由图3可见，三七茎叶总皂苷三个剂量均能显著提高OVA免疫小鼠血清中特异性IgG、IgGl和lgG2b抗原水平，且三七茎叶总皂苷三个剂量组小鼠血清中IgG2b抗体水平显著高于Alum/OVA对照组。说明三七茎叶总皂苷能显著增强OVA受免小鼠的体液免疫反应，其制得的免疫佐剂性效果优于铝胶。权利要求1、一种三七茎叶总皂苷在制备免疫佐剂的应用。2、根据权利要求1所述的三七茎叶总皂苷在制备免疫佐剂的应用，其特征是所述的三七茎叶总皂苷是从五加科植物三七尸awoxwotog/me"g(Burk.)F.H.Chen的干燥茎叶中提取、分离得到。3、根据权利要求1所述的三七茎叶总皂苷在制备免疫佐剂的应用，其特征是它的制备过程如下步骤一，将五加科植物三七MotogzVwe"g(Burk.)F.H.Chen的茎叶粉碎后形成三七茎叶粗粉；步骤二，将三七茎叶粗粉通过乙醇进行回流提取，然后将乙醇提取液进行减压回收乙醇，浓缩；步骤三，将浓缩后的乙醇提取液浸膏用水进行混悬，然后用极性较小的有机溶剂进行萃取，萃取体积为水悬液的1/3，当萃取后的萃取液I接近无色时合并萃取液I,减压回收极性较小的有机溶剂，浓缩萃取液I;再用极性较大的有机溶剂进行萃取，当萃取后萃取液n接近无色时合并萃取液n，减压回收极性较大的有机溶剂，浓缩萃取液n,将浓缩后的极性较大有机溶剂萃取液n的浸膏在大孔树脂柱中进行色谱分离，用水洗去水溶性杂质，再用醇溶液为洗脱剂进行洗脱，收集醇洗脱液，减压回收醇溶液，浓縮，并干燥，得到三七茎叶总皂苷。4、根据权利要求3所述的三七茎叶总皂苷在制备免疫佐剂的应用，其特征是所述的步骤二中的乙醇的浓度为80%,回流提取三次，第一次提取2小时，第二次和第三次均提取1.5小时。5、根据权利要求3所述的三七茎叶总皂苷在制备免疫佐剂的应用，其特征是所述的步骤三中极性较小的有机溶剂为石油醚、乙醚或氯仿。6、根据权利要求3所述的三七茎叶总皂苷在制备免疫佐剂的应用，其特征是所述的步骤三中极性较大的有机溶剂为正丁醇或正戊醇。7、根据权利要求3所述的三七茎叶总皂苷在制备免疫佐剂的应用，其特征是所述的步骤三中大孔树脂柱为D101或AB-8大孔树脂柱，醇溶液为浓度75%_95%的甲醇或乙醇。全文摘要本发明公开了一种三七茎叶总皂苷在制备免疫佐剂的应用。本发明采用三七茎叶总皂苷为主要有效成分制备的免疫佐剂可以显著地增强抗原的免疫原性，对机体免疫功能有广泛的调节作用，能诱导Th1和Th2免疫应答，免疫佐剂活性优于至今唯一人用的免疫佐剂氢氧化铝胶，而且具有生产成本低、无毒的效果。文档编号A61K39/39GK101380472SQ20081015531公开日2009年3月11日申请日期2008年10月27日优先权日2008年10月27日发明者于生兰,孙红祥,成张,方希修,朱善元,洪伟鸣,王妲妲,枫秦,葛竹兴,杰郁,义郑,陈玉勇申请人:枫秦